蛇足石杉生物碱的提取与测定

蛇足石杉生物碱的提取与测定

曾汉元1

, 印　彪2

, 连　琰

3

(11怀化学院生物工程系,

湖南怀化　418008;　21华东师范大学生物医学系,上海　200062;

31怀化学院化学化工系,

湖南怀化　418008)

摘　要:研究蛇足石杉生物碱的提取工艺1整个工艺是:用酸浸提、微波加热、蒸馏、萃取、反萃取、脱色等分离技术从蛇足石杉中提取石杉碱,最后定性定量检测1结果表明:(1)微波加热处理可提高石杉碱的提取率;(2)萃取和反萃取相结合,使用旋转蒸发仪蒸馏有助于分离石杉碱;(3)用碘化铋钾试液对提取的生物碱进行饱和滴定,然后烘干称量,再根据化学反应式来计算生物碱含量,是一种较好的近似测定方法;(4)根据标准样品的直线回归方程,利用紫外分析仪测定石杉碱甲含量是一种经济高效的方法;(5)洪江市塘湾镇的蛇足石杉的石杉碱甲的含量为01085‰,粗提物中石杉碱甲的百分含量为2611%1

关键词:石杉碱甲;　提取;　纯化;　定性测定;　定量分析

中图分类号:R282171;Q946188 文献标识码:A 文章编号:1671-9743(2007)08-0030-03

收稿日期:2007-03-01

基金项目:湖南省教育厅资助科研项目(03C324);怀化市科技局重点资助项目1

作者简介:曾汉元(1966-),男,湖南绥宁人,怀化学院副教授,博士生,主要研究植物学1

蛇足石杉Huper zia serrata (Thunb 1ex Murray )T rev 又名千层塔、蛇足石松,是石杉科石杉属的一种多年生蕨类植物1蛇足石杉含有石杉碱甲1临床研究表明,石杉碱甲是迄今自然界中最强效、选择性最高的无毒副作用的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂,对治疗早老性痴呆症、单纯性记忆障碍以及重症肌无力症疗效显著,对增强青少年的记忆力也有良好的效果[1-3]1

蛇足石杉的石杉碱甲含量一般只有0103‰～

0108‰,含量极低1十多年来,人们已摸索出多种方

法来提取石杉碱甲,如酸浸泡、S oxhlet 抽提、乙醇渗漉,近年又利用超声波和微波协助提取[2,4-6]1本研究综合各种方法,试图寻找一种经济实用的生产工艺对石杉碱甲进行粗提,为开发利用本地丰富的蛇足石杉资源提供技术支持1

1　实验材料与仪器试剂

111　实验材料

蛇足石杉购于湖南省洪江市塘湾镇,经鉴定符合药典规定1

112　仪器与试剂

紫外分析仪(T U -1221)、组织捣碎机、高速离心机(T DZ 5-WS )、旋转蒸发仪(R201)、电子分析天平

(A L104)、烘干箱、酸度计、活性炭、酒石酸、氯仿、

氢氧化钠、稀氨水、碘化铋钾等,其中酒石酸、氯仿、氢氧化钠和碘化铋钾为分析纯1石杉碱甲标准品由复旦大学红旗制药厂提供,纯度为9918%1

2　实验方法

211　材料的预处理

(1)把蛇足石杉材料洗净,晒干1

(2)称取蛇足石杉1000g ,用组织捣碎机粉碎1212　材料的浸泡提取

(1)将粉碎的蛇足石杉分成2等份(1份用于碘化

铋钾的饱和滴定,另1份用于其它的定性定量分析),

每份500g ,各装入1个塑料桶内,再各加入1500m l 115%的酒石酸,浸泡24小时,然后用微波炉加热90秒,再浸泡12小时,离心,得上清液1

(2)再向滤渣中各加入115%的酒石酸1000m l ,微波炉加热90秒,继续浸泡24小时,离心,与前面的上清液分别合并1213　生物总碱的分离纯化

(1)用旋转蒸发仪浓缩提取液至50m l 1(2)加稀氨水,调pH 到9左右,氯仿∶浓缩液=1∶6左右萃取4次,合并氯仿相,再萃取一次1

(3)1%NaOH 溶液∶氯仿层=1∶1　萃取6次,取下层1

(4)1%HC L ∶氯仿层=1∶1　反萃取6次,取酸水层1

(5)用旋转蒸发仪浓缩至20m l ,即得样品的生物总碱提取液1

(6)最后,将1份提取液用烘箱120℃烘干12小时,称量1(另1份不烘干)214　生物总碱的检测

第26卷第8期

怀化学院学报 V ol 1261N o 182007年8月

　J OURNA L OF HUAIHUA UNI VERSITY Aug 1,2007

21411　生物总碱的定性检测

(1)将烘干的样品再配制成溶液1

(2)依次取样做碘化铋钾试验、碘一碘化钾试验、

硅钨酸试验和测吸光度121412　生物总碱的定量测定

方法一:T U -1221紫外分光光度仪在200～500nm 范围内对样品提取液进行扫描,扫描步长012nm ,扫描速度3100nm Πm in ,重复3次1读取313nm

波长处的吸光度,从标准曲线的回归方程计算出样品中石杉碱甲的含量1

方法二:将1份提取液加入中号试管,调pH =8,用配好的碘化铋钾溶液做饱和滴定,静置18小时,取沉淀放入烘箱烘干,称量,再根据化学反应式计算生物总碱的质量1

3　结果

311　标准样品的趋势线及回归方程

称取石杉碱甲标准样品溶于氯仿中配制成浓度为01013mg Πm L 的标准溶液,分别吸取0、015、1、115、2、215m L 于容量瓶中定容到5m L ,用紫外分光光度计在200～500nm 范围内对样品进行扫描,读取313nm 波长处的吸光度A (见表1)1将有关的结果输入计算机,用Excel 作回归分析,得到直线回归方程C =01075A -010002,相关系数r =019997(见图1)1相关系数高,说明该回归方程能够很好地与实际情况相吻合1另据王国峰等[8]的测定,石杉碱甲的浓度在1218～15913μg Πm l 范围内,也具有良好的线性关系1

表1　标准样品在不同浓度时的吸光度

相对浓度

015

110

115

210

215

吸光度0010415010707011105011475011909

图1　标准样品的吸光度趋势线

312　定性检测结果

(1)碘化铋钾试验:取提取液1m l ,加碘化铋钾

试液1～2滴,出现黄色沉淀1反应式如下:AIK +

BiI31K I →AIK 1BiI31K I ↓(AIK 为生物总碱,BiI31K I 为碘化铋钾)1

(2)碘一碘化钾试验:取提取液1m l ,加碘一碘

化钾试液1～2滴,出现棕色沉淀或混浊1

(3)硅钨酸试验:取提取液1m1,加硅钨酸试液1～2滴,生成灰白色或淡黄色沉淀1加热可使反应灵敏1

上述三种检测结果均为阳性,因此,可以确定:提取物中含有生物碱1

313　定量测定结果

31311　用T U -1221紫外分光光度仪测定,得A =0156671

根据已建立的回归方程C =01075A -010002,得C

=010423g ,也就是说500g 的蛇足石杉中含有石杉碱

甲4213mg ,因此,原料中石杉碱甲的含量大于

01085‰(因为还有部分的石杉碱甲无法被提取出来,因此为“大于”)131312　用碘化铋钾做定量测定,得AIK 1BiI31K I 44010mg 1

根据AIK+BiI31K I →AIK 1BiI31K I ↓,利用化学反应式进行计算,得出AIK 为7311mg ,也就是说500g 的

蛇足石杉中含有生物碱7311mg 以上(因为还有部分的生物碱无法被提取出来),因此,在原料中,生物碱的含量大于01146‰1

(说明:碘化铋钾的分子量为1253171蛇足石杉中含有多种生物碱,但分子量多数在242～280之间[1]1考虑到提取的成分中以石杉碱甲含量最多,而石杉碱甲的分子量为242,因此,生物碱的平均分子量按250进行近似计算1)

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13・第26卷第8期 曾汉元,印彪,连琰:蛇足石杉生物碱的提取与测定