保留时间漂移、色谱柱批次重现性
液相色谱峰形拖尾解决方案
峰形后拖解决方案和实例继前一篇《峰形前拖解决方案》，我们对峰形后拖的情况及其解决方案也进行了总结。
与《峰形前拖解决方案》相同，在这里我们也同样的撇开所有的污染、塌陷、死体积等其它因素，假设系统是好的，柱子是新的、好的，单纯探讨液相方法与峰形后拖之间的关系，通过调整液相方法来解决峰形前拖的问题。
这样有利于厘清拖尾产生的根本原因，对峰形拖尾的问题提供一些经验上解决方案。
首先让我们了解一下峰形后拖的几种常见形式，三种常见的拖尾如下：系统是好的，柱子是好的，为什么会产生后拖？我们还是回顾一下，色谱分离的一般过程，正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布，如下图所示：色谱分离是一个物理过程，样品分子经过在固定相与流动相之间的多次分配、吸附解吸，由于不同分子与固定相和流动相之间的相互作用力的差异而使它们在色谱柱中的移动速度不同，以此实现分离的目的。
相同色谱条件下，有些化合物容易产生拖尾，有些则不产生拖尾，这说明拖尾的产生跟样品本身的性质是密切相关的，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾。
可以想象一下，样品分子在分析过程所处的环境，一是流动相，二是固定相，流动相可以自由流动的，均一性比较好，因此可以认为样品分子四周都被相同组成的流动相所包围，其对每个样品分子的相互作用力也是均匀的、对称的，不应该是引起浓度分布发生变化的主要原因。
考虑固定相，固定相中除了C18长链外还有填料键合时残余的硅羟基，由于C18长链是非极性的，其与样品分子的相互作用力也是很微弱的范德华力，而硅羟基则具有一定的极性Si－Oδ－Hδ＋，在pH一定的条件下甚至还会发生电离，形成－Si－O－形式的离子态。
Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多，同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不会很多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生作用。
液相基础知识
反相液相色谱
流动相极性 〉固定相极性 非极性组分保留值大，极性组分先流出 反相色谱用的较多，一般用水做溶剂， 但有些特殊情况不适合用反相色谱，要 用到正相色谱
正相液相色谱
固定相极性〉流动相极性 异丙醇过滤作为溶剂，水的极性较大， 一般不作为正相色谱溶剂
过滤的方式和目的
1:过滤所用滤膜:0.45um或更小孔径的滤 膜 2:过滤的目的:除去溶剂中的细小颗粒， 避 免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制 的 磷酸盐缓冲液 3:过滤的方式: 先混合再过滤和分别过滤再混合
7:化学或次级保留（硅羟基效应）,加三乙胺, 处理拖尾会很好,是一个很好的扫尾剂。加 1‰的冰CH3COOH，会很好的改善酸性物 拖尾,氢离子与硅羟基结合，扫除拖尾. 8:样品溶剂选择不当。 9:样品过载，拖尾特别厉害。 10:柱温过低，分离效果差。
峰形异常—肩峰 峰形异常 肩峰
1:保护柱或分析柱污染，拿到色谱柱要先 测 柱效，若是色谱柱被污染， 冲洗色谱柱， 可能会有效率。 2:样品溶剂不溶解于流动相中。
保留时间漂移（ 保留时间漂移（二）
5:泵中有气泡，压力不稳定，有波动，输 液 不稳，保留时间会拖前或滞后。 6:流动相的选择不当，看是否选择错误。 7:键和相流失，强酸强碱通过时，会破坏 柱 子的内部结构，造成保留时间提前。 8:缓冲容量不够。
基线漂移（ 基线漂移（一）
1:温度波动，对检测器控温。 2:流动相不均匀，脱气或者使用纯度更高的 溶剂。 3:流通池被污染或有气泡，流通池脏了，用 异丙醇冲洗流通池。 4:检测池背压过高或拆卸过程中操作不当， 造成流通池窗口破裂，更换新透镜。 5:流动相配比不当或流速变化。
检测器漏液
1:流通池垫片损坏。 2:流通池透镜破碎，废液管如果太脏，会 堵 塞废液管，造成检测器内部压力过高， 会 压碎透镜，造成气泡，给与检测器一定 的 移（一）
液相色谱柱使用问题解析
液相色谱柱使用问题解析液相色谱柱使用疑难问题解析就液相色谱柱的安装，使用和维护知识，以及各种柱压、峰形和色谱柱寿命等问题前来提问，也欢迎液相色谱方面的高手前来交流切磋。
内容提纲：一、液相色谱柱的安装、启用和维护中的重点注意事项1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配2、溶剂的匹配转换3、新柱使用前的平衡和老化4、pH使用范围5、色谱柱的保存二、柱压问题1、填料破碎和使用后，有填料粉末生成2、颗粒物堵塞引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除3、化学污染物引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除三、峰形问题1、峰后拖2、峰前延3、其他峰形问题四、保留时间问题1、保留时间的重现性2、保留时间漂移3、柱与柱之间的重现性4、批与批之间的重现性五、寿命问题六、其他疑难的色谱技术问题一.安装、启用和维护中重点注意事项色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。
如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。
另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。
1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。
上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。
接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。
2. 溶剂的匹配转换色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。
特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。
正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。
如何解决色谱柱使用过程中出现的问题
如何解决色谱柱使用过程中出现的问题一、保留值与分离度重现性不好原因分析原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱的变化填料，键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解，强保留分堆积堵塞保留因子（K）分离子（）柱效（N）保留因子（K）柱效（N）柱外效应系统差易，进样量大，进样0与色谱柱之间，色谱柱与检测器之间管路太长，检测器流通池体积大，接头死体积大等注效（N）问题原因表现分离效果变差流动相组分改变保留因子（K）柱效变化很小流速改变保留因子（K）分离因子温度改变保留因子（K）柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子（K）柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子（K）注效（N）二、造成色谱峰（不对称）拖尾的原因1.色谱柱本身填装问题，筷板堵塞或填料塌陷2.柱头有污染；3样本超载；4样品溶剂不合适]5.柱外效应6化学或二次保留（硅基）效应7缓冲容量不足或不合适8重金属污染三、如何解决峰形拖尾的问题A. 与化学有关的拖尾问题1 .流动相中，加入30MM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺2如然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3.降低进样量至〈1UG。
B．与色谱柱有管的拖尾问题1如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇，家1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。
2.使用保护柱C.与HPLC 系统有关的蜂拖尾和峰加宽1.进样体积过大，通常〈25UL〉2.进样0与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应〈20CM，内径为0.007〉3检测器流通池的体积过大四、如何储存色谱柱1防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200PPM的叠0钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中家20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。
2.尽可能将色谱柱储存于100%有机溶剂（乙晴最好）中，避免在缓冲溶液中保存。
色谱柱名词解释
色谱柱是色谱分析中使用的一种关键设备，用于将混合物中的成分分离并进行定性和定量分析。
以下是一些与色谱柱相关的常见名词解释：
1. 固定相（Stationary Phase）：色谱柱中的固定涂层或填料，具有特定的化学性质和分离能力。
样品在固定相中发生相互作用，导致不同成分以不同速度移动并被分离。
2. 流动相（Mobile Phase）：用于携带样品通过色谱柱的流体，可以是气体（气相色谱）或液体（液相色谱）。
流动相的选择取决于分析目标和色谱柱类型。
3. 柱效（Plate Number）：用于描述色谱柱分离能力的度量。
柱效越高，表示色谱柱的分离效果越好。
4. 保留时间（Retention Time）：在色谱柱中，样品组分从进样到检测器出现的时间。
保留时间可以帮助确定化合物的特征和纯度。
5. 色谱峰（Chromatographic Peak）：色谱图中呈现出的高度峰值，表示在特定保留时间内检测到的样品成分。
6. 柱温（Column Temperature）：色谱柱的操作温度，可以对分离效果和分析速度产生影响。
某些分析方法需要在特定的温度下进行。
7. 柱寿命（Column Lifetime）：色谱柱使用期限，取决于使用条件和期间的保养和维护。
柱寿命的结束通常由分离性能下降或峰形变得不规则来决定。
Agilent 6820 气相色谱仪－维护与故障排除 说明书
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同一批次色谱柱和不同批次色谱柱的重现性
How about batch-to-batch reproducibility?
How to assure good batch-to-batch reproducibility for the assay?
色谱柱 构造：由柱管和固定相组成，是色谱仪 的最重要部件。 性能评价：柱性能指标包括：在一定实 验条件（试 样，流动相，流速，温度） 下的柱压，塔板高度H和板数n，对称因 子，保留因子和分离因子的重复性或分 离度R.
How about batch-to-batch reproducibility?
• Q.3: How about batch-to-batch reproducibility?
问：不同批次柱子的重现性怎么样？
键合相的含碳量和覆盖度
键合相表面基团的键合量，可通过键合硅胶进行元素 分析，用含碳的百分数（含碳量）表示。例如ODS的 含碳量可以在5%到40%的范围。 基团的键合量也可用表面覆盖度表示，即参加反应的 硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。 由于键合基团的空间位阻效应，使硅醇基不能全部参 加键合反应，故会残余硅醇基。 残余硅醇基会减弱键合相表面的疏水性，对极性溶质 产生次级化学吸附，使保留机制复杂化，造成峰拖尾。 为减少残余硅醇基，一般在键合反应后，用三甲基氯 硅烷等进行钝化处理，即封尾。
Column-to-Column and Batch-to-Batch Reproducibility 同一批次柱子和不同批次柱子的重现性
Qustion
How to assure good column-to-column reproducibility?
What we need in the information from manufacturers ?
一种提高色谱指纹谱保留时间重现性的新方法
一种提高色谱指纹谱保留时间重现性的新方法王龙星 肖红斌 梁鑫淼3(中国科学院大连化学物理研究所,大连116012)摘 要 通过色谱热力学分析发现,在相同的分析条件下,即使采用不同的液相色谱系统或不同的色谱柱,组分的保留时间存在简单的线性关系,应用该线性关系可提高不同反相C 18柱间保留时间重现性,经过实际样品在不同操作条件下的验证,表明该方法是正确而可行的。
关键词 指纹谱,保留时间重现性,高效液相色谱 2002211214收稿;2003204207接受本文系国家973计划资助项目(N o.G 1999054406)1 引 言色谱指纹谱是近年来中药质量控制的热点1,2,提高不同实验室间色谱数据的重现性无疑对指纹谱质量控制具有重要的意义。
反相C 18柱是高效液相色谱中使用最广泛的色谱柱,提高不同反相C 18柱间保留时间的重现性对指纹谱的实际应用有较大的帮助。
对使用反相C 18柱的液相色谱分析而言,造成在同一条件下的保留时间漂移的原因是液相色谱仪器系统引起的保留时间漂移和色谱柱的差异引起的保留时间漂移。
本文通过色谱热力学理论分析找到了一个新方法,能够有效地提高不同C 18柱保留时间的重现性,对两个不同的C 18柱校正前后保留时间的差别从最大12min 减少到了一般在0.2min 以内。
2 理论部分根据色谱热力学3,组分的容量因子k 与色谱两相分配过程中的焓变ΔH 与熵变ΔS 的关系为:(β是相比)ln k =lnΔSR-ΔHRT-ln β(1) 由于使用的填料类型是相同的,我们认为,在相同的操作条件下不同C 18柱的焓变ΔH 与熵变ΔS 是相同的。
它们的差别主要是:不同C 18柱其填料的相比β是有一定差别,不仅不同品牌填料间的β不同,而且随着色谱柱的使用,固定相有轻微的流失这也将带来相比的变化;由装柱过程带来的填料间孔隙的大小与几何性状的不同以及色谱柱本身长度的不同引起的不同C 18柱间死时间的差别。
沃特世HPLC排查故障指南
沃特世HPLC 故障排查指南目录变化的保留时间 (1)飘移的保留时间 (2)峰拖尾的原因 (3)不同批次色谱柱之间的重现性 (5)色谱柱寿命 (7)样品前处理的问题 (8)常见色谱问题及沃特世色谱柱产品解决方案 (10)Q：我的色谱峰保留时间不稳定，会是什么问题？A：首先需要找出变化的模式，它会告诉我们很多潜在的原因。
如果保留时间从这次进样到下次进样随机变化，我会首先检查泵和溶剂混合装置。
为了校验泵是否工作正常，可以用量筒和秒表来测量流速。
为了校验流动相组成没有变化，可以在流动相中加入跟踪剂来观察基线的变化。
如果流动相组成是稳定的，基线也该很稳定。
如果流动相组成有变化，你会观察到基线的相应变化。
举例说明，如果你使用反相条件，UV检测器，可以在有机相溶剂中加入0.1%的丙酮，监测254nm下的基线变化。
另一种方法也可以，你需要人工配制流动相，然后通过溶剂混合装置。
如果保留时间的变化消失了，问题就出在溶剂混合装置上。
Q：一天之内的进样保留时间一致，但是不同天数之间的保留时间会变化。
A：这种情况下，仪器本身不太可能有问题。
保留时间变化最有可能的原因是流动相组成的变化。
在反相色谱中，保留因子k和流动相中有机溶剂的体积含量成指数关系。
根据经验，如果有机溶剂含量误差1%，那么保留时间的变化在5%到15%之间，典型情况在10%左右。
这意味着你必须仔细称量有机溶剂，最好的配制流动相方法是用质量称量代替体积称量。
此外，流动相如何脱气也可能导致保留时间的变化。
最好的脱气方法是使用真空超声脱气大约一分钟左右，这会最大程度的减少溶剂蒸汽的挥发。
另一个方法是用氦气流喷射，在流动相被氦气平衡后，氦气流必须被关闭，否则氦气会带走溶剂蒸汽，溶剂的组成会由于蒸发而发生变化。
如果你的样品组成是离子状态或者离子化的，那么控制流动相的pH值是非常重要的。
小到0.1单位的pH 变化会导致保留时间漂移10%左右。
所以准确测量pH值并保证pH仪被很好地的校准。
waters故障指南(中文版)
目录1 色谱柱使用寿命问：我的色谱柱进样大概100针后峰形变差了，踏板数很低，怎么回事？答：100针确实很少，一般情况下使用时间会长很多的。
首先我们要确认你的使用条件是不是导致色谱柱寿命下降的原因。
两种基本情况：1 在相同实验中以前使用的色谱柱寿命长很多2 在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后全部损坏如果是第一种情况，应该检查一下实验是否保持一致。
样品的组成改变了吗？样品中强吸收的污染物会破坏色谱柱的柱效。
或者管路的密封圈是否完好？脱落的密封圈会堵塞色谱柱过滤器和填料的顶层，从而影响样品的分布。
如果可以确认色谱条件没有变化，那么可以推测是柱床松动的原因。
在实验室和运输过程中色谱柱剧烈的震动都会导致柱床松动。
（色谱柱有没有掉到地上？）或者也有可能使生产商的问题。
而且这种问题标准色谱柱检测中心是检测不出来的，只有在用过一段时间后才会显露出来。
这种情况生产商会免费替换色谱柱。
问：那些生产商真好，但是我的情况不是这样的。
我的色谱柱总是用不了多长时间。
有时候100针，有时候200针。
200针还可以忍受，但是100针太差了。
色谱柱开销太大了，我该怎么办？答：我完全同意你所说的。
我们必须要找到原因然后看看我们能做些什么。
最大可能是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端。
可能是在流动相中不溶的沉淀物或者是强吸收的物质。
随着进样的增加这些污染物在色谱柱顶端累积，阻止样品正常吸附和扩散。
从而导致峰形变差。
通常这种问题和柱压升高同时出现。
问：嗯，可能就是这个原因。
我应该怎么避免这种问题呢？答：有几种方法可以采用。
一，采用合适的样品准备技术处理样品。
用和分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（SPE：solid phase extraction）1效果很好。
另外一种非常有效的方法是使用保护柱。
保护柱是作为牺牲柱装在色谱柱前使用的，出现问题的时候就会被替换掉。
为了获得最好的分析效果，保护柱的填料和装填技术必须和分析柱一样。
如果用不同品牌的填料就不能获得最佳的分析性能和保护作用。
影响液相色谱仪检测结果的4大因素
影响液相色谱仪检测结果的4大因素液相色谱检测结果不准确，精密度低？导致这一现象的原因有哪些？本文汇总了影响液相色谱仪检测结果的4个主要因素，希望能对大家有所帮助。
液相色谱仪本身对于仪器本身一般不会有问题，特别是刚买回来的新仪器。
对于仪器本身最重要的就是仪器的校验，刚买回来的仪器一般都是由卖家先对仪器做系统的确认工作(包括IQ、PQ、OQ),确认顺利通过后，再请国家或省级仪器检定局的来校验，检定合格后就可以放心使用了，除此之外，一些做得好的公司每半年会对仪器进行一次的内部校验，目的就是为了保证仪器的正常可运行状态。
色谱条件色谱条件一般包括流动相、色谱柱、检测波长、流速及进样量。
流动相就涉及到配制流动相所用到的水和试剂试液，水一般要求用超纯水或其他水的电阻率不大于18.2兆欧级别，试剂试液要求用色谱级别的，原因为防止水和试剂试液中的杂质对色谱结果的干扰。
1、气泡由于HP1C系统中气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降;气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定,使基线起伏。
造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。
为了避免这类问题的出现，HP1C实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理；在HP1C 系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净；在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。
2、柱温在操作HP1C时，色谱柱是在室温环境下工作的°大多数的工作环境温度是不断变化的，温度的差别就会引起较第杂的问题。
温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的，HP1C方法中的洗脱方式受温度的影响。
等度洗脱时温度会影响保留时间，当温度升高时所有的色谱峰都前移了，等度洗脱时一般温度每升高1℃,保留时间会缩短(VS)%。
评价色谱柱效和分离效果的指标
评价色谱柱效和分离效果的指标色谱柱（ChromatographicColumn）是分离科学领域中广泛使用的基础仪器之一，它能帮助研究人员快速准确地将特定分子类型的物质分离出来，并获得他们需要的细节数据，从而实现精确测定。
本文旨在介绍评价色谱柱效果和分离效果的指标，以期为研究人员和应用者提供关于色谱柱性能的指导。
色谱柱的性能指标：1）色谱柱的选择因子（Selectivity Factor）：指的是两个物质在色谱柱中的分离程度，通常通过在不同浓度的混合物中进行测量来计算。
该因子用于衡量色谱柱在分离混合物中表现出的分离度和效率，在评价色谱柱性能时是非常重要的指标。
2）色谱柱的迁移因子（Migration Factor）：也称为保留因子，指的是在色谱柱中，同一种物质在不同浓度混合物中的分离特性。
迁移因子可以提供一个有效的方法来比较不同的色谱柱的分离性能。
3）色谱柱的解离因子（Resolution Factor）：解离因子是用来衡量色谱柱在分离混合物中的能力的一种指标，它表明两个不同物质在一定条件下在色谱柱中分离的程度。
4）色谱柱的灵敏度（Sensitivity）：色谱柱的灵敏度指的是在色谱柱中检测物质的灵敏度，它是用来评价色谱柱性能的重要指标。
灵敏度越高，色谱柱就越能够检测到更加细小的物质，从而获得更好的分离效果。
利用色谱柱的性能指标进行评价：色谱柱的性能可以通过测量色谱柱的选择因子、迁移因子、解离因子和灵敏度来评价，这些指标的值可以提供有关色谱柱的性能的可靠信息。
通常情况下，色谱柱的选择因子一般大于1，迁移因子大于1.5，解离因子大于2，灵敏度高于1.0。
此外，在评价色谱柱性能时，也需要考虑色谱柱的重现性。
重现性是指在相同的测试条件下，在色谱柱中重复测量同一样物质的分离特性的能力，重现性高的色谱柱更有可能提供准确的测量数据。
结论：总之，评价色谱柱的效果和分离效果可以通过测量色谱柱的选择因子、迁移因子、解离因子和灵敏度来实现。
正相液相色谱保留时间漂移的影响因素和解决办法研究
正相液相色谱保留时间漂移的影响因素和解决办法研究姚媛媛;段正康;曾航日;李倩【摘要】以双氧水工作液为主要分析对象,研究了正相液相色谱法中保留时间漂移的影响因素和解决办法.采用单因素实验法,考察了流动相组成和温度变化对保留时间的影响.在研究过程中,选取了正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(80∶19.5∶0.5,v/v)或正己烷-二氯甲烷-甲基叔丁基醚(80∶ 19.5∶0.5,v/v)和正己烷-二氧六环(95∶5,v/v)流动相体系对双氧水工作液进行了分析研究,结果表明,流动相组分中含有挥发性和强吸水性组分时,对保留时间漂移影响明显;当流动相组分中含有易挥发性溶剂时,环境温度和柱温的改变对保留时间的漂移影响明显.最后,针对影响保留时间漂移的因素,提出了对应的解决办法.【期刊名称】《应用化工》【年(卷),期】2016(045)006【总页数】4页(P1184-1186,1190)【关键词】正相液相色谱;保留时间;漂移;双氧水工作液【作者】姚媛媛;段正康;曾航日;李倩【作者单位】湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105【正文语种】中文【中图分类】TQ075+.1;TQ244.3;O657.7+2高效液相色谱法是20世纪60年代中后期迅速发展起来的新型分离分析技术，与经典的液相色谱相比，具有分析速度快、分析效率高、灵敏度高、自动化程度高等优点。
该法目前被广泛应用于医药、食品、养殖业、水质分析等领域。
物质的保留时间是液相色谱分析中定性分析的重要依据。
同一物质在相同的色谱条件下，连续进样2次的保留时间相差在15 s以内，属于正常现象，相差超过30 s，就可认为该物质保留时间漂移[1]，不能作为定性依据，也严重影响定量结果的准确性，甚至不能进行定量分析。
影响保留时间漂移的因素可能有环境温度的不稳定、流动相组成的变化、色谱柱性质发生变化等 [1-2]。
气相色谱保留时间漂移
气相色谱保留时间漂移
气相色谱保留时间漂移是指在气相色谱分析中，化合物在不同条件下出现的保留时间差异。
保留时间是指化合物从进样口进入柱子后，到达检测器所需的时间。
根据物理化学原理，保留时间受到多种因素的影响，包括柱子的性质、进样量、进样方式、流速等。
保留时间漂移是指在相同柱子、相同条件下，化合物在不同分析运行中保留时间出现的差异。
这种现象可能是由于柱子的老化、柱子温度的不稳定、流速的变化等原因引起的。
当保留时间发生漂移时，可能会导致化合物错判或分析结果不准确。
为了减小保留时间漂移的影响，可以采取以下措施：
1. 检查柱子：定期更换老化的柱子，避免柱子堵塞或表面涂层受损。
2. 控制柱子温度：保持稳定的柱子温度，避免温度波动引起保留时间变化。
3. 控制流速：保持稳定的流速，避免流速变化引起保留时间漂移。
4. 校准方法：定期校准分析方法，以确保准确的保留时间。
总之，气相色谱保留时间漂移是一个常见的问题，对分析结果有重要影响。
通过合理的方法操作和定期的维护，可以减小保留时间漂移的影响，提高分析准确性。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。
其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查；(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
色谱柱特点总结
LUNA1、pH 1.5-10范围内能稳定使用；2、每根3μ和5μ色谱柱都有出色的不同批次间重现性；3、通用的3μ，5μ，10μ，10μ制备型和15μ色谱柱及其散装填料可供选择；4、固定相多种多样：硅胶, C5, C8, C18, 苯基-己基，CN，NH2和SCX。
尖锐的峰形Luna具有非凡的硅胶品质，致密的键合相表面覆盖度和完美的端基封尾，在宽pH范围内改善了峰形，使方法更准确，灵敏。
自由暴露的硅醇基对峰拖尾有很大的影响。
不完全或没有端基封尾的硅醇基会与被分析成分及金属杂质直接接触，使其酸性增加，处于低pH下的带电状态。
使用简单的水/乙腈（50：50）流动相分析吡啶和苯酚，得到的峰形及分离效果能很好的指示自由硅醇基。
在此条件下，暴露的硅醇基离子化，洗脱出的吡啶是个拖尾峰，特别是苯酚后还有杂质甚至流出峰1.Luna C18（2），C8（2），C5Luna已经成为世界上最好的反相色谱柱之一，因为它始终将目光聚集在色谱分离的两个重要指标：分离度和峰形。
高柱效和键合相表面高覆盖度得到了尖锐的色谱峰。
无论你是用USP方法还是常规方法，LunaC18（2），和Luna C8（2）都是你的第一选择，因为：实际上通过完美键合技术和端基封尾已经消除了自由暴露的硅醇基因；尖锐的峰形提供了高灵敏度；PH的稳定性1.5－10.0，可稳定使用超过10000小时。
2.Luan NH2（氨基）Luna氨基柱通过改进，提高了柱子的寿命和重现性。
它是唯一的无论是100％的水流动相中，还是在反相和正相条件下，都有pH1.5～11.0的稳定性的柱子。
对于单糖和寡糖分析或者任何正相分离，Luna氨基柱都是极好的选择。
3.Luan SCX（强阳离子交换）Luna SCX是以硅胶为基质的苯磺酸衍生化固定相，能从中性和阴离子化合物的混合物中选择性分离含胺的和阳离子类型物质。
Luna SCX材料的重现性极好，5µ，10µ填料分别便于分析分离和放大化，柱子在pH2.0～7.0范围内稳定。
液相保留时间飘,但峰面积一致
液相保留时间飘,但峰面积一致
液相保留时间漂移是指在液相层析中，不同样品分析物的保留时间可能会发生变化。
这种现象通常是由于实验参数的变化或仪器偏差等造成的。
然而，峰面积一致的情况可能是由于峰宽发生变化，但峰高与峰宽之间存在一定的平衡关系，从而使峰面积保持一致。
峰宽的变化可能与液相柱性能的变化、流速的变化、采样量的变化等因素有关。
为了解决液相保留时间飘移的问题，可以采取以下措施：
1. 校准仪器：定期校准液相层析仪器，包括调整流速、替换液相柱、校准检测器等。
2. 优化实验条件：调整流速、温度、缓冲液pH值等实验条件来改善保留时间的稳定性。
3. 保持恒定的温度：尽可能稳定温度，避免温度的变化对保留时间产生影响。
4. 采用内标法：引入内标物来校正保留时间的偏差，提高分析结果的准确性和可重复性。
5. 密切关注液相柱的替换周期：定期更换液相柱，以确保分析条件的一致性。
需注意的是，虽然峰面积保持一致，但仍需对保留时间飘移进行关注和纠正，以确保分析结果的准确性和可重复性。
HPLC分析时保留时间重现性不稳定可能的原因
HPLC分析时保留时间重现性不稳定可能的原因
2014-06-09
HPLC分析时，保留时间重现性不稳定会影响峰面积的重现性，从而造成实验数据不精确，色谱分析无法进行，造成这方面的原因有很多，常见的解决方案与排查方法如下：
确认色谱柱是好的。
确认流动相是新鲜配置的，比例没有错误。
检查一下溶剂瓶里的溶剂过滤器没有长菌，没有被堵塞。
如果使用梯度洗脱方法，请确认平衡时间足够长。
如果是压力不稳定，一定会影响保留时间。
仔细观察柱前压的变化，如果压力稳定，就可以判断泵的系统没有问题，请更换新的色谱柱试试。
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3保留时间漂移
问：我的色谱峰保留时间发生漂移，会是什么原因呢？
答：这个问题很有意思。
原因有很多，让我们一个一个来看。
人们通常认为保留时间漂移是平衡的问题。
如果你是做正像色谱用纯硅胶柱的话就很有可能是这个问题。
正像色谱的保留时间对吸附在硅胶表面的水的含量是非常敏感的，所以流动相中溶有水的话，保留时间就会漂移。
因为水在正己烷或二氯甲烷等溶剂中的溶解性非常低，所以柱子要很长时间才能平衡好。
我曾碰到过一个例子，用非常纯的正己烷平衡一个星期后保留时间还是漂移。
所以我建议避免使用非常纯的试剂。
通常使硅胶达到水平衡的做法是使用半饱和水的试剂。
制备方法是一体积的水饱和的疏水试剂：一体积的纯试剂混合。
这个方法可以大大缩短平衡的时间。
在反相色谱中，通常很快就可以平衡的。
只需要几个（5-10）柱体积的流动相就可以。
当然并不是所有情况都这样。
一个典型的例外就是含有离子对试剂的离子对色谱。
离子对试剂的使用量一般是2-5mmol/L或更少。
它们吸附在反相键和相表面，表面浓度在0.5-2μmol/m2。
键和相的比表面积为330m2/g，一根4.6mm*250mm的柱子含有3g的键和相，其表面积达到1000m2。
要1L的2mmol/L 的离子对试剂才能平衡好柱子。
当然这只是极限的情况，不过一般用几百mL平衡柱子也不少见的。
不要把用过离子对试剂的柱子换成有机相保存过夜，因为换溶剂的过程中离子对试剂被洗脱下来，而再平衡又需要很长时间。
问：这些现象都有一个共同点：流动相中含有低浓度的强吸收的物质。
这就是导致保留时间漂移的普遍原因吗？
答：是的。
其他的没这么普遍。
不过强吸收的物质也可能来自样品。
这种情况下强吸收的物质会随着进样的增加而累积，从而导致色谱柱化学性质的改变。
样品中赋形剂的吸收就是一个例子。
通过观察保留时间改变的比率可以判断污染物是来自于流动相还是样品中。
下面来做个实验：
1 重复进样几次，如：重复进4次，每次运行1小时。
2 不进样，泵入相同时间的流动相
3 重复第一步
4 将保留时间作图
A：相对于时间
B：相对于进样次数
如果第一张图谱呈平滑的曲线，就是流动相中携带有污染物。
如果第二张图呈平滑的曲线，样品就是污染物的来源。
问：还有其他导致保留时间漂移的原因吗？
答：有的。
也有可能流动向组分随着时间而变化的。
你如果不是使用现在带有在线混合能力的仪器的话，将会发现流动相的组分在慢慢的挥发。
特别是在用氦气脱气的时候更加明显，所以应该将氦气的流速控制到最小。
一个经常被低估的原因是键和相的水解。
生产厂家通常规定一个pH范围，超过这个范围键和相救不稳定了。
这个范围通常是2-8或9。
尽管如此，还是要小心对待这些极限条件的，分界线不是非常明显的。
水解通常还取决于其他条件的，比如温度和有机溶剂，在这个pH范围之类也有缓慢的水解的。
键和相在中等pH条件下是最稳定的，pH3-5，低温。
等度色谱条件优于梯度。
当然水解确实也在等度中发生，键和相通常会自身吸附，处于一个自身平衡的状态。
但是在梯度或清洗柱子的时候，使用到高浓度的有机溶剂时，自身平衡被打破，水解的键和相就被冲出了柱子。
问：我会记住这些的。
温度的改变会导致保留时间漂移吗？
答：是的，温度也通常被考虑到的。
如果你让仪器自动进样过夜或过周末，就会发现保留时间随着实验室温度的改变而产生漂移。
在许多地方，为了节能在晚上或周末室温会设置到不同的温度。
按常理来说，室温每改变1℃，保留时间改变1%-2%。
联系柱压的增加导致保留时间漂移的现象。
柱压增加可能是因柱子污染物造成的，但是即使是过滤头堵塞都可能导致保留时间的改变。
压力会推动流动相通过过滤头，该过程中的摩擦会加热流动相。
这种温度的增加就会导致保留时间的变化。
另外还有一些导致保留时间漂移的原因，但是都非常少见。
使用高覆盖率的键和C18末端完全封口的色谱柱在少于一定比例有机溶剂的流动相中因不能完全润湿会导致平衡很慢。
这将会使流动相和固定相失去接触而导致“疏水坍塌”，即固定相表面一些区域因键和相的自我吸收而导致与样品的交互作用减少。
及时跑几个柱体积的有机溶剂就可以再生柱子了，最好是使用流动相中的有机修饰剂（？）。
这种现象在不是末端键和的色谱柱中很少或几乎没有碰到。
4 不同色谱柱和不同批次之间的重现性
问：我要开始开发一个新的HPLC方法。
验证之后，该方法将转道QC实验室并将使用许多年。
我担心该方法的长期的重复性，特别是柱子的长期重复性。
怎样才能确保好的重复性呢？
答：首先，我要表扬你在开始做这个方法的时候就能考虑到这个方面。
如果可以预料到该方法将要使用好几年，在选择柱子方面就要做些功课。
要想使柱子在该方法的可预见的适用期内可资使用，就要选择一些大的生产厂家。
另外，要选择一种标准的表面化学物质-比如C18或C8-而不是那些新奇的或很少使用的。
换句话说，柱子的选择要保守点。
下一个标准才是柱子的重复性，如果你或你的同事以前用一根柱子有很好的重复性，这是一个很好的起点。
同时也要考虑生产商提供的信息。
近来有的厂家开始印刷他们的说明和不同批次的重复性实验的结果。
你可以从厂家得到这些信息然后细心对照。
问:我该从这些信息中寻找什么呢？
答：让我往后回一点，解释一下不同柱子和批次之间重复性的不同方面。
下面，就说一下反相填料，因为他们更加普遍。
如果你用同一批填料的不同柱子，将会得到不同的踏板数（峰宽），不同的柱压，不同的保留时间。
保留时间与填料密度和柱体积呈比例改变，而柱体积则取决于柱子的内径。
这个改变对你的方法应该是没什么影响的，因为所有峰的保留时间都呈比列的改变，而分离度还是没变。
这个原因导致的保留时间变化的RSD 通常在3%左右，但是如果生产商对柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。
柱子踏板数的变化会影响方法，特别是做双峰的时候，它们很少能达到基线分离的。
尽管2-3%的踏板数的标准偏差已经可以达到，但通常还是在+/-10%，记住踏板数是个平方数，分离度仅仅取决于踏板数的根。
所以踏板数2%的偏差相当于峰宽1%的偏差。
你要确认一下柱子的厂家是有踏板数的上下限，还是只有一个下限，上下限都有比较让人满意。
同一装填程序的柱子其柱压的重复性是相当好的，同一批次变化应不超过+/-5%。
问：那么批次之间的重复性怎么样呢？
答：如果你注意一下批次间的色谱参数，你会发现同参数会不同，更重要的是批次间分离的选择性也会改变。
就是说峰的相对保留会改变，比如他们在色谱图中
的相对位置，这对你方法的确定性是不利的
这种改变是你要尽量避免的，所以你要从厂家那里得到一些消息，他们是怎么确保批次之间重复性的，这包括一些物理，化学，色谱方面的测试。
在物理测试中，最重要的一项是装填的表面积，该项参数的变化会直接导致保留时间的变化。
所以你要知道厂家认可的批次间表面积改变的幅度是多少。
通常情况下幅度是+/-10%，但是+/-5%也是可以达到的。
化学方面的参数最重要的是键合相的表面覆盖率。
通常用多少umol/m2表示。
许多厂家并没有直接给出这个参数，而只说明了C的百分含量。
我们希望看到的这个代替性的说明以及一个紧凑的幅度，通常是+/-10%，低于+/-4%的也可以达到。
最后你要知道厂家的色谱重复性测试。
通常色谱柱会附带一张色谱图，检测的是一些简单的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。
但是这不是一个好的批次间重复性测试。
因为这些中性疏水化合物的相对保留重复性相当好，对装填中表面覆盖率的改变是相当不敏感的。
好的批次间重复性测试还应在混合物中添加强碱化合物。
在精心设计的测试中，精选的碱性化合物主要与残余硅羟基作用，而中性化合物则主要与键合相作用。
只有含有2种化合物的重复性测试才是让人信服的。
如果一个厂家是这样测试的并且有好的重复性，那么他的柱子会更加让人放心。
问：我不知道厂家的测试与我的化合物的检测有什么联系，我应该怎样在我的检测中确保一个好的批次间重复性呢？
答：你说的很对：上面的消息只能让你有一个比较大的机会确保重复性。
但最后必须用你自己的检测来做重复性测试。
有些厂家提供一整套的设备包括不同装填批次的柱子来做这个测试，另外有的厂家则按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的东西。
同一装填批次的色谱柱是没有用的，你需要的是用不同键和反应装填的柱子。
如果同一批次是不同天内装填，然后色谱柱编号又不同的时候的时候，厂家可能自己也会迷糊的。
所以你最好询问2次，确保厂家给你的是你要的。
你可能需要3根不同批次的色谱柱来为你的方法做重复性测试。
如果批次间的改变不影响你的检测，那么接下来的时间你的方法应该有一个好的重复性。