质谱技术的新进展及其在生命科学中的应用

收稿日期:2002-03-09

基金项目:华南师范大学博士启动基金资助项目(98008)

作者简介:文丽君(1975-),女,湖南衡东人,2000级硕士研究生,研究方向为有机材料合成.

第15卷第3Π4期2002年7月海南师范学院学报(自然科学版)JOURNA L OF H AI NAN NORM A L UNI VERSITY (NAT URA L SCIE NCE )V ol .15　N o .3Π4July 2002文章编号:1671-8747(2002)04-0209-05

质谱技术的新进展及其在生命科学中的应用

文丽君,曾　志,杨定乔

(华南师范大学化学系,广东广州510631)

摘　要:文章综述了质谱技术的新进展与CZE ΠMS ΠMS ,M A LDI -T OF -MS ,LC -ESI -MS 等质谱

新技术及它们在生命科学中的应用.指出这些质谱新技术已被证明在多肽和蛋白质的鉴定、单核

苷酸、核酸、糖蛋白的分析等领域是很有效的工具.

关键词:CZE ΠMS ΠMS;M A LDI -T OF -MS;LC -ESI -MS;生物分子结构鉴定;生物分子序列分析

中图分类号:O657114 文献标识码:A

近年来,一系列质谱软电离技术得到了新的发展.这些软电离技术包括电喷雾电离(Elec 2

trospray I onization ESI )[1]和基质辅助激光解吸电离(Matrix -assisted Laser Des orption Πionization

M A LDI )[2]等.它们的发展不但使质谱技术发生了突破性的革新,而且使质谱技术在生命科学中的应用得到了前所未有的扩展.质谱技术所能提供的精确分子量和分子结构信息及其微量鉴定的特点,使它成为蛋白质组研究中两大支撑技术之一.其中电喷雾质谱由于其易于与常规的高分辨率分离方法如高效液相色谱和毛细管电泳等实现在线连用而在多肽混合物的分析中得到了广泛的应用;因为在多肽混合物的高灵敏度分析中,将多肽与其它杂质分离对于获得准确的分析结果至关重要.

最近,毛细管电泳Π质谱联用方法(CE ΠMS )得到了新的发展,已被成功地应用于多肽和蛋白质的鉴定中.一些微量电喷雾技术如微升电喷雾(microspray )技术和纳升电喷雾(nanospray )技术以及相应的CE ΠMS [3]

接口技术和具有极高灵敏度的质谱仪如傅立叶转换离子回旋共振质

谱仪(FTI -CR -MS )的研制已使得在阿托摩尔(10-18m ol ・L -1)水平上进行蛋白质鉴定成为可能[4].

随着分子生物学和生物技术的迅猛发展以及核酸在生命科学研究中的重要位置,有关核酸的分子生物学已成为当前生命化学中最具活力的研究方向之一.化学合成和化学修饰的寡核苷酸已经在基因诊断方面显示出良好的应用前景.因此,建立和发展一种更有效,灵敏,快速和精确的寡核苷酸的结构和序列分析方法一直是生物化学家们研究的前沿之一.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术为此提供了新的途径.它不仅广泛地应用在多肽和蛋白质的质量分析上,能直接或间接测定生物试样样品中的肽和蛋白质离子[5],而且在对化学修饰的寡核苷酸及核酸片段的序列分析上也显示了良好的应用前景.液相色谱-质谱法,结合蛋白酶及专

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一性糖苷酶的酶解,可用来分析糖结合位点,糖链的组成和结构以及糖链的分支情况[6].

1　毛细管区带电泳Π串联质谱联用法鉴定多肽和蛋白质

随着质谱技术的发展,通过串联质谱测定蛋白质的多肽序列,并搜索数据库成为高通量鉴定蛋白质的新方法,用图论及真实谱-理论谱联配的方法对串联质谱得到多肽图谱进行从头解析.

最近,有报道[7]用包层液接口实现毛细管电泳Π电喷雾质谱在线连用,对标准多肽混合物和蛋白酶解产物在低皮可摩尔水平上进行了串联质联质谱分析,建立了利用毛细管区带电泳Π串联质谱法(CZEΠMSΠMS)对多肽和蛋白质进行高灵敏度鉴定的方法,并通过数据库来搜寻鉴定蛋白质.

毛细管电泳Π电喷雾质谱在线连用:毛细管区带电泳在Beckman pΠACE system5500型毛细管电泳仪上进行.为了保证稳定的喷雾过程,CEΠMS接口处的不锈钢细管上加上了4.25kV (对比质谱仪毛细管入口处)的正向高压.质谱实验在Finnigan M AT LC Q离子阱质谱仪上进行.在质谱仪检测器的扫描设置中包含三个阶段:首先是质谱仪在400～2000mΠz的范围内作全扫描(Full scan)检测所有经过加热的毛细管进入质谱仪的离子;在对信号计数超过105(可另行设置)的丰度最大的离子在很小范围内进行精度很高的微扫描(Z oom scan)可用于确定离子的带电荷情况;最后质谱仪对已作微扫描的离子在离子阱中作MSΠMS,并将生成的所有碎片离子记录下来,质谱仪又回到全扫描状态并依次循环下去.所有这三个阶段均可在1s内完成3次,从而获得足够的质谱信息.

CZEΠMS和CZEΠMSΠMS是一种灵敏度很高的高分辨率分析方法.若用极微量的微升电喷雾接口或纳升电喷雾接口,由于所消耗的样品非常少,检测限往往能达到fm ol(10-15m ol・L-1)低水平.若连用的质谱仪采用高灵敏度的FTICR-MS,检测限更能达到阿托摩尔(10-18m ol・L-1)水平[8].这对在蛋白质的研究中双向电泳凝胶上极微量蛋白质的鉴定提供了强有力的支持,且CIEΠMSΠMS还能产生高质量的CI D质谱图以提供对多肽结构进行解析所必须的信息,从而实现多肽的从头排序(de nov o sequencing).但同时也应看到CZEΠMS和CZEΠMSΠMS还存在着一些原理和技术上的限制性因素:如CZEΠMS中要求使用挥发性较好的缓冲溶液,但这些缓冲溶液的离子强度却较低,这势必会对CZE分离效度造成一定影响.CZE的检测限稍高,CZEΠMS 的接口处既要保证毛细管末端的分离电压,又要保证毛细管末端的喷雾电压,不但技术难度大,且易造成不稳定的因素.对这些问题目前已有一些解决办法:如在线的等速预浓缩[9]和固相微抽提[10],从而实现样品的在线浓缩.在CZE的分离缓冲溶液中加入一定比例有机溶剂,可增加其挥发性而提高电喷雾效率,还可提高CZE的分辨率.另外CZEΠMS接口研制也有长足进步.随着其不断完善与发展,它们在生物学各个领域中的应用势必拓宽与深化.

2　MA LDI-T OF-MS法检测单核苷酸多肽及寡核苷酸的序列分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted Laser Des orptionΠionization time of flight mass spectrometry,M A LDI-T OF-MS)法是应用M A LDI对生物大分子进行离子化和质量分析,将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液并干燥,分子将嵌入质谱仪的真空小室,用瞬