RTPCR常见问题分析

3 提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性：
3.1 首先应确定模板RNA完整性好，无DNA污染。
3.2 RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。
3.3 为了防止模板降解，可以在反应体系中加入 RNase抑制剂RNasin。
3.4 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性， 太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
2、 RNA被损害和降解：必要的话更换RNA。
3、 RNAse污染：维持无菌条件;加入RNase抑制 剂。
4、 无效的cDNA：通过增加70%乙醇清洗的次数 来去除制备RNA过程中的抑制剂。
5、 无效的PCR扩增：注意：反转录的抑制剂包 括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精 胺。调整cDNA合成温度或引物设计。
使用公式估算Tm，把 退火温度设定为低于 Tm 5℃。因为这些公 式只是估算Tm值，所 有真正的退火温度实 际会高些或低些。
问题二：产生非特异性条带
1.引物和模版 的非特异性 退火
1.避免引物3’端含有2 个到3个dG或dC’
2.在第一链合成中使用 基因特异性引物，而 不是随即引物或 oligo(dT)。
3.用于合成 cDNA第一链 合成的引物 的退火不充分
1.确定退火温度适合实验 中所用的引物。对于随机 六聚体，建议在反应温度 保温之前先在25℃保温10 分钟。
2.对于基因特异性引物 （GSP），可以试以下其 他GSP，或换用oligo(dT) 或随即六聚体确定GSP是 反义序列。
4.起始RNA量 不够
2.3 一步法与两步法区别：
一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏， 操作简便，污染率低，RNA二级结构减少， 并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了 PCR反应的错配率。而在两步法中，两步 法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活 性，同时可由一次反转录样品获得多个遗 传信息，并且由于在第一步中将RNA反转 录为cDNA，从而更易于保存。另外，两 步法的整个过程比一步法更节省费用。
问题八： 在无反转录酶的情况下， 对照RNA获得扩增结果
通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。 由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消 除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、 1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。
有可能是引物二聚体的条带
问题九： 扩增产物滞留在加样孔 中
4.形成引物二 聚体
5.镁离子浓度 太高
6.沾染外源 DNA
设计在3’端没有互补 序列的引物。
对于每一个模板和引 物组化优化镁离子浓 度。
使用抗气雾剂和UDG 酶。
问题三：产生弥散条带
原因
1.cDNA第一链产物的含 量过高 2. DNase降解DNA产生的 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ核苷酸的非特异性 扩增 3. PCR反应中引物过多 4. 循环数过多 5. 退火温度过低
>1kb的RT- PCR产物， 保持反应温度≤65℃。 不要在高于37℃时使 用M-MLV;如果不需要 全长cDNA，在第一链 反应中使用随机引物;
7.引物或模板 对残余的RNA 模板敏感
8.靶序列在分 析的组织中不 表达
9.PCR没有起 作用
在PCR前用RNaseH 处理。
尝试其他靶序列或组 织
5. 多糖同RNA 共沉淀
增加RNA量;对于 <50ng的RNA样品， 可以在第一链cDNA合 成中使用0.1μg到 0.5μg乙酰BSA;
使用氯化锂沉淀RNA 以除去多糖;
6.RNA模板 二级结构太多
将RNA和引物在不含盐及 缓冲液条件下变性/退火;
提高逆转录反应温度，对 SuperScriptⅡ可以到50℃， 对 ThermoScript可以到 65℃。注意：不要在 >60℃时使用oligo(dT)引 物，选择一个在反应温度 可以退火的GSP;对于
有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了 高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少 稀释100倍再进行二次扩增。
另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物 的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行 热启动以提高特异性
3.PCR的低特异性
对策
1.用DNase I预处理RNA . 2.使用基因特异性引物 .
3.优化PCR条件.
问题七:产生大分子量的弥散条带
大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特 异性的起始及延伸产生的。对于长片段的PCR， 建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或 1:100-1:200）
对两步法RT-PCR，不 要在PCR步骤中使用 超过1/5的逆转录反应 产物;
10.PCR引物设 计较差
避免在引物3'端含有互 补序列。避免可以形 成内部发卡结构的序 列。设计Tm类似的引 物。最佳引物浓度介 于0.1μM到0.5μM之间。 为了精确确定引物浓 度，在260nm测量光 密度，然后使用光吸 收值和消光系数计算 浓度。
11.富含GC的 模板
于GC含量>50%的模 板，使用PCRx Enhancer Solution。
12. 镁离子浓度 太低
从1mM到3mM，间隔 0.5mM进行一系列反 应，确定对于每个模 板和引物对的最佳镁 离子浓度。注意：对 实时定量PCR，使用 3mM到5mM的镁离子 浓度。
13.退火温度 太高
问题五：信号高于预期，在低于 预期的循环中即可检出产物?
1、 反应中加的样品太多：降低模板的浓度。 2、 模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试
剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准 备反应，使用抗气溶胶的吸头。
问题六：电泳后出现意外的条带 RNA?
原因
1.被基因组DNA污染
2.用于第一链合成的寡聚dT或随机 引物
对策
1. 常规PCR步骤中减少模板 cDNA的量 2. 提取高质量RNA，防止被 DNA污染 3. 减少引物的用量 4. 优化PCR反应条件，减少 PCR的循环次数 5. 提高退火温度，防止非特 异性的起始及延伸
问题四：灵敏度低，须在比预期 更高的循环中检出产物?
1、 初始模板RNA不充分：增加模板RNA的浓度。
1 RT-PCR反应步骤： 第一，RNA提纯； 第二，RT逆转录； 第三，PCR聚合酶反应
2 RT-PCR方法
2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管 内完成， 有助于减少污染，灵敏度更高
2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进 行，首先从RNA模板反转录得到cDNA， 得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR 反应。
RT-PCR常见问题分 析
一 、 RT-PCR反应原理与方法
RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转 录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR） 相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合 成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途 广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平， 细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因 cDNA序列等研究。
3.在开始几个循环使用 较高的退火温度，然 后使用较低的退火温 度。
4.使用热启动Taq DNA 酶进行PCR，提高反 应的特异性。
2.基因特异性引 物设计较差
遵循用于扩增引物设 计的同样原则
3.RNA中有基 因组DNA的污染
1.使用扩增级DNase 1 处理RNA。
2.设置没有逆转录的对 照反应检测DNA污染
3.5 如果由于模板有二级结构，导致扩增效果不好， 可提高逆转录反应温度。
3.6 设计引物时，避免在引物3´端含有互补序列，避 免可以形成内部发卡结构的序列。
RT-PCR常见问题
问题一：RT-PCR仅有少量或没有产物
1.RNA被降解物
分离无污染或高质量的 RNA；提取RNA材料要尽 量新鲜，防止RNA降解。
RNA提取后，应储存在 100％甲酰胺中，如果使 用RNase抑制剂，加热时 ＜45℃；pH＜8.0，否则 抑制剂会释放所有结合的 RNase。而且，在 ≥0.8mM DTT时加入 RNase抑制剂，一定要存 在DTT。
2. RNA中包含 逆转录抑制剂
过乙醇沉淀RNA除去抑制 剂。用70%(v/v)乙醇对 RNA沉淀进行清洗。可以 加入糖元(0.25μg到 0.4μg/μl)以帮助小量样品 RNA的恢复;逆转录抑制剂 包括：SDS，EDTA，甘 油，焦磷酸钠，亚精胺， 甲酰胺和胍盐;将对照RNA 同样品混合，同对照RNA 反应比较产量以检验抑制 剂;