vero细胞无血清培养基培养技术与应用

V ero细胞是日本学者Yasumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴附依赖性细胞系, Vero一词由世界语中的verde(意为绿色的)和reno意为肾脏的)两个词合并而成。Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点:①来源方便，可连续传代，生长速度快;②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高;③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高;④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。疫苗的接种对象主要是大范围的健康人群，其质量和安全性一直是备受关注的首要问题。疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程。血清是一种组分复杂而尚不完全明确的混合物，至少含有1 000种不同的蛋白质，总蛋白量高达60~150g/L，它能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受Vero细胞自身的贴附依赖生长特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，本世纪之前的V ero细胞培养及病毒疫苗生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度;从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状脑炎的阮病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患阎。

由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括V ero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势问。2010年，美国、欧盟和日本等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。

Vero细胞无血清培养基的研究和商业开发

1.1 Vero细胞无血清培养基的研究

培养基是影响体外培养细胞生长代谢、增殖乃至生存的最直接和最重要的环境因素。Vero细胞无血清培养的技术关键在于无血清培养基的设计和优化。

设计Vero细胞无血清培养基组成配方的技术核心是筛选和确定具有促进细胞贴附生长、维持细胞存活、提高病毒扩殖效果的培养基组成成分。基于细胞生长和代谢的高通量分析及Plackett-Burman实验设计和Box-Behnken响应面设计是Vero细胞无血清培养基设计和优化的主要技术。V ero细胞的培养需要在适宜的介质表面贴附、铺展才开始有丝分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有赖于细胞的贴附生长状态。此外，在某些病毒疫苗(如流感病毒疫苗)的生产过程中，需要在培养基中加人一定浓度的胰蛋白酶以提高病毒的感染和增殖效率。另一方面，病毒的感染和增殖不仅是细胞代谢负荷不断加大的过程，也是细胞病变、以致凋亡和坏死、甚至裂解的渐进性过程。V ero细胞无血清培养基的设计和优化相对于应用于动物细胞悬浮培养工艺生产重组蛋白、特别是治疗性抗体生产的无血清培养基更具挑战性。

设计Vero细胞无血清培养基的较为便捷和有效的策略是以DMEM,F-12,M199和RPMI1640等商品化的合成培养基的单独使用或联合使用为基础培养基，以反映细胞生长和代谢的主要参数为评价指标，结合统计学方法确定向其中添加生长因子、激素、结合蛋白及豁附因子、微量元素、脂类和脂类前体物等的种类和浓度。无血清培养基中常用的黏附因子主要是存在于细胞间质和血清中的胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原等。其中，纤粘连蛋白和层粘连蛋白不仅具有提高细胞的砧附力及活力的作用，同时在促进有丝分裂中也起着重要的作用。某些含有精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)序列的短肤也能够有效地促进Vero细胞贴附到以聚苯乙烯和醋酸纤维素为材

料的介质表面。

Vero细胞无血清培养基的优化主要涉及以下两方面。其一，从提高病毒疫苗安全性的需要出发，以非动物来源成分替代动物来源成分、化学组分明确成分替代化学组分不确定成分，其二，从提高病毒疫苗生产效率的目的考虑，根据细胞生长和代谢动力学特征优化培养基的组成。

基因组学技术和蛋白质组学技术是近年来用于细胞培养研究的新工具，在分子水平对细胞培养过程认识的深人，可以更准确地预测和判断体外培养细胞的生长和代谢状态。另外，通过抗体芯片遴选参与细胞培养调控过程的细胞表面受体、黏附分子及信号通路相关生物分子，可以相应地确定在培养基中添加配体或其他生物分子来调控细胞增殖、凋亡、分化、黏附和外源基因表达。分子生物学技术在动物细胞培养基优化设计中的应用，不仅为有针对性和预见性的无血清培养基组分筛选提供了理论指导，也为无血清培养基组分筛选提供了高通量和精确灵敏的高效技术手段。目前，基因组学技术和蛋白质组学技术已成为国外大型培养基商业开发机构和生产商进行无血清培养基优化设计的主要技术手段。

1.2 Vero细胞无血清培养基的商业化开发

与添加血清的合成培养基相比，无血清培养基的细胞适用谱系窄，往往一种培养基只适用于一种细胞类型甚至某一特定的细胞系，适用于其他细胞系的商业化无血清培养基用于Vem细胞培养往往不能获得满意的效果。受Vero细胞无血清培养基市场需求的驱动，商品化的Vero细胞无血清培养基从数量到质量都在不断提高，MDSS2,VP-SFM,OptiPm SFM和EX-CELLVERO是较具代表性的产品。

MDSS2是由AXCELL Biotechnologies公司推出的最早商品化的Vero细胞无血清培养基之一，该培养基也可用于BHK和MDCK细胞培养，其支持细胞生长和病毒增殖的效果与含血清培养基相当。由于MDSS2的蛋白含量高达40 mg/L，且其中含有动物来源成分，其市场份额已基本丧失。VP-SFM(virus pro-duction-serum free media )是由世界上最大的细胞培养产品生产商GIBCO/Invitrogen公司推出的产品。该培养基的优点是不含动物来源成分、蛋白含量低、细胞生长速度快且不需要VP-SFM适应、病毒增殖效果，OptiPro SFM是GIBCO/Invitmgen公司推出的无动物来源成分、化学成分明确的无血清培养基，该培养基除用于V ero细胞的贴壁培养和微载体培养外，也适用于多种由肾组织衍生的病毒生产细胞，如MDBK,BHK-21,PK-15等细胞的培养，EX-CELL VERO是由JRH公司推出的用于Vero 细胞高密度培养的无血清培养基。该培养基含有重组蛋白和植物来源的水解物，蛋白含量低，不含动物来源成份、酚红和PlumnicF68o ，vero细胞在EX-CELL VERO中培养的细胞密度和病毒滴度与其在含血清培养基中达到的水平相当，但由含血清培养基转人EX-CELL VERO培养存在短暂的适应过程。

目前，商品化Vem细胞无血清培养基存在诸如培养基大多以液体的形式提供、价格昂贵、培养基的成分配方秘而不宣的问题。这在很大程度上限制了Vero细胞无血清培养基在病毒疫苗生产中的实际应用。针对这一现状，国外的疫苗生产企业往往选择由企业的研发部门结合特定细胞系和生产工艺设计出无血清培养基的组成配方，再委托培养基生产商生产的方式来降低无血清培养基的使用成本。

2 Vero细胞的无血清培养

2.1培养模式

Vero细胞在无血清培养基中的生长和代谢可能与其在含血清培养基中有所不同，但不存在培养模式的差异。Vero细胞的贴附依赖生长特性，决定了其需要在适宜的介质表面贴附、铺展为前提的贴壁培养(anchorage-dependent culture)模式。Vero细胞贴壁培养的最经典和简便的方法是以方瓶和转瓶的内表面为介质贴附生长。这些培养体系所能提供的细胞生长面积有限，细胞培养规模的放大只能依赖培养单元的增加，由此给疫苗生产带来诸如污染风