微生物与酶工程制药复习2

二、问答

4. 如何从环境中筛选稀有放线菌中的小单孢菌，并说明各步骤的作用？

（一）所谓的稀有放线菌：即为除链霉菌属外的其它属的放线菌。

如：小单孢菌、小双孢菌、马杜拉放线菌等。

选择培养分离——微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：

（1）抑制大多数其它微生物的生长。

（2）使待分离的微生物生长更快。

→使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。

（3）使待分离的微生物生长“突出”。

→直接挑取分离的微生物的菌落获得纯培养。

1）①利用选择培养法进行直接分离：Ⅰ、高温下培养：分离嗜热细菌。

Ⅱ、培养基中不含N：分离固氮菌。

Ⅲ、培养基加抗生素：分离抗性菌。

②利用选择平板进行直接分离：Ⅰ、牛奶平板：分离蛋白酶产生菌。

Ⅱ、颜色反应：分离特定的菌株。

Ⅲ、利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化。

2）富集培养：特定的环境条件→仅适应于该条件的微生物旺盛生长

→待分离微生物在群落中的数量大大增加→从自然界中分离到所需的特定微生物（二）高选择性分离小单孢菌的程序：

土样自然风干→制成土壤悬浮液→1~5%苯酚处理→涂布平板

（HV琼脂+萘啶酸20mg/L+衣霉素20mg/L）衣霉素和萘啶酸作为细菌、真菌和非目的放线菌的抑制剂。

6. 如何利用同位素标记法研究微生物药物生物合成的机理？

将同位素标记可疑前体物质加到培养基中→培养后分离目的代谢产物

→测定终产物中同位素含量和分布情况→判断可疑前体物质是否参与代谢产物的合成16. 如想开发生产葡萄糖苷酶的基因工程菌，该如何构建？如想进一步提高该酶的表达量，该如何进行？假如重组表达的酶以包涵体形式存在，以你学到的知识分析应该采取什么措施？

基因工程酶（蛋白）的构建

（1）基因的获取（通过NCBI搜索欲构建的葡萄糖苷酶的基因序列，再设计引物，以所需的cDNA为模板PCR获得）。

（2）目的基因与表达载体的体外重组。

（3）导入宿主细胞。

（4）筛选和验证。

（5）目的基因的表达。

提高表达量：（1）利用高效表达质粒（强启动子和高拷贝）。

（2）优化密码子。

（3）优化翻译起始区的二级结构。

（4）使ATG和SD序列之间距离为9bp。

（5）优化表达条件。

减少包涵体：（1）降低培养温度。

（2）减少诱导剂的使用量。

（3）

12. 论述抗生素的作用机理？

（1）抑制细菌细胞壁的合成。

（2）增加细菌细胞膜的通透性。

（3）抑制细菌蛋白质的合成。

（4）抑制细菌核酸的合成。

（5）干扰细菌的能量代谢。

（6）增强吞噬细胞的功能。

13. 从你的观点谈谈细菌耐药性的控制策略？

（1）合理使用抗菌药物，加强对细菌耐药性的监测。

（2）严格执行消毒隔离制度，应对耐药菌感染的患者隔离；避免医院内交叉感染。（3）加强药政管理，严格执行抗菌药物凭处方供应。

（4）加强新抗菌药物的研制。

（5）加强质粒消除剂的研制。

（6）抗菌药物的“轮休”有计划地将抗菌药物分期分批交替使用，对控制细菌耐药性有一定作用。

15. 请简述微生物来源的抗肿瘤药物研发的一般过程。

微生物药物研发的一般程序

微生物药物研究的一般程序：

（1）微生物药物产生菌、有效菌株的筛选、保藏及选育。

（2）发酵。

（3）药物的分离纯化。

（4）药物的化学鉴别和结构测定。

（5）药理与临床评价。

（6）工业化研究。

（7）基础研究。

微生物药物研究开发的一般程序

9. 在微生物制药的种子扩大培养过程中，需要考虑到哪些方面的问题？

（一）种子培养的目的与要求：

（1）种子扩培的目的：1）接种量的需要。

2）菌种的驯化。

3）缩短发酵时间、保证生产水平。

（2）种子的要求：1）活力强，移种至发酵后能够迅速生长，迟缓期短。

2）生理状况稳定，个体与群体。

3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。

4）无杂菌污染。

5）保持稳定的生产能力。

（3）种子制备过程：斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵

（二）种子制备的技术概要：

（1）实验室阶段：

1）培养物选择的原则：

目的——种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为2类：

①对于不产孢子和芽孢的微生物：获得一定数量和质量的菌体

②对于产孢子的微生物：Ⅰ、获得一定数量和质量的孢子

Ⅱ、获得一定数量和质量的菌丝体

2）培养基选择的原则：培养基的选择应该是有利于菌体的生长，

对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。

培养基的原料一般都比较精细

（实验室种子培养阶段，规模一般比较小，为了保证培养基的质量）

3）起始接种物的传代问题：①细菌：保藏斜面→活化斜面

②产孢子：保藏→母斜面→子斜面

原则：使菌种的传代次数尽可能的少。

***孢子培养：

*母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去除变异株。所以接种时要稀一点，便于纯化生长到单菌落。

*子瓶：大量繁殖，得到大量孢子。

*接种：❶从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落。

❷接种时密一点，得到大量的孢子。

（2）生产车间阶段：

1）培养物的选择原则：菌丝体比孢子要有利——①缩短发酵时间

②有利于获得好的发酵结果

2）培养基选择的原则：

目的——获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。

在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，2方面原因：

①成本；②驯化

（3）发酵级数的确定：

一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。***发酵级数确定的依据：❶级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。

❷级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2~4级。

❸在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。

（4）接种量的确定：接种量=

移入种子的体积接种后培养液的体积

过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7~15%。但是一般认为大一点好。

***双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。

***倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。

（5）种龄：是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

1）种龄短：菌体太少；2）种龄长：易老化

原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。

（6）种子的质量要求：1）量：要求达到一定的浓度

2）质：①菌丝形态、培养液外观（生长处于某个阶段、均匀等等）

②C、N、P的含量，pH值，酶活等

③无污染（无杂菌）

（7）影响种子质量的因素：1）固体种子：①培养基

②培养条件：温度、湿度、培养时间、冷藏时间

③接种量