CaMK_Cre转基因小鼠模型的建立
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。
将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。
角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立-毛春明
皮肤是人体最大的器官, 它将人体内部与外界 隔开, 阻挡异物和细菌侵入, 防止体液丢失, 保持人 体内部环境稳定, 不受外界干扰, 是机体保护内部组 织免受外来伤害的第一道屏障。同时, 它还兼具调
节体温、感受外界刺激以及排泄等功能, 是机体重要 的器官之一。
在皮肤组织中特别是表皮层中的主要细胞成分 是角质细胞。由于所担负的功能不同, 角质细胞衍
角质素 5 是皮肤表皮层的角质细胞表达的一种 角质素, 它的缺失会导致皮肤基底细胞与旧基底膜 分离, 形成大疱[4] 。有研究证明, 角质素 5 具有在角 质细胞中特异表达的性质[ 5] , 是角质细胞的分子标 记物[ 6] , 在其他类型的组织和细胞中不表达。本研 究选用角质素 5( K5 ) 基因启动 子[ 7] , 用它指导 Cre 重组酶基因在角质细胞中表达, 并通过显微注射的 方法获得皮肤角质细胞特异性表达 Cre 重组酶的转 基因小鼠, 为应用 CrePloxP 系统研究目的基 因在皮 肤的发生、发育等生理和病理过程的功能创造条件。
PCR 产物的回收、DNA 的连接、转化、感受态大 肠杆菌的制备、质粒 DNA 的提取、DNA 片段的回收 等操作均按参考文献[ 10] 进行。
1. 3 受精卵的显微注射
回收并纯化注射片段, 按常规进行显微注射和 受精卵移植[ 11] 。实验 用昆明白小鼠由军事医学科 学院实验动物中心提供。
1. 4 转基因小鼠的基因型鉴定
( Genetic Laboratory of Devel opment and Diseases, Institute of Biotechnology , Academy of Military Medical Sci ences , Beijing 100071, China)
CaMKⅡα(基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建
Ｃ ａ ｇ— ｅ ，删 ｈｎ ｗｎ
Ｚ ａ ｈａ，Ｋ （ ｕａ ｅｉ ｌＵ ｉ ｒ Ｆｆ ｎＭ ｄｃ ｎ ｅ ｉ ｉ ａ ｖ ｓｙ ｕｈ ｕ３０ ０ ）
Ａｂ ｔａ ：Ｏｂｅｔ ｅ ｏ ｃｏ ｅ ａ ｄ ｃ ａａｔｒｚ ｈ ａ Ｉｃ ｒｍｏｅ ｎ ｏ ｃ ｎ ｔ ｃ ｅ ｒｎ — ｓ ｅｉｃ ｖ ｃｏ ｉｈ Ｃ ｅ ｓｒｃ ｔ ｉｃｉ ：Ｔ ｌｎ ｎ ｈ ｒｃｅ ｅ ｔｅ Ｃ ＭＫ ｌ ｔ ｏ ｔｒａ ｄ ｔ ｏ ｓｒ ｔａ ｎ ｕｏ ｖ ｉ ｐ ｕ ｐ ｃｆ ｅ ｔｒｗ ｔ ｒ ｉ ｒｃ ｍｂｎ ｓ ．Ｍｅｈ ｄ ：８ １ｃ ｆ ａ ５ ｌ ｎ ｉｇｒｇ ｌｔ ｎｒｇｏ ｓｏ ｔｉｅ ｙＰ Ｒ．Ｔ ｉ ｆ ｇ ｎ ａ ｕ ｃｏ ｅ ， ｐ ｒ ａ－ ｅｏ ｉａ ｅ ｔｏ ｓ ． ｂｏ ＭＫ ｌ ｌ Ｃ Ｉ ｆ ｋｎ ｕａｉ ｅｉｎｗａ ｂａｎ ｄｂ Ｃ ａ ｅ ｏ ｈｓ ｒ ｍｅ ｔｗ ｓｓｂ ｌｎ ｄ ａ ａｔ ｌ ｉ
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Cre小鼠模型构建策略及方法特点
Cre小鼠模型构建策略及方法特点目前有四种常见Cre小鼠模型构建策略及方法，虽然每种方法都有其优势与不足，也很难说哪种策略方法，能够适合或满足所有研究目的。
所以，最终选择哪种方法，还是要根据研究目的具体情况决定。
1. 质粒表达载体的转基因Cre小鼠模型：认为是Cre小鼠构建的传统方法，因为最初的Cre小鼠模型，多是应用特定启动子加Cre基因cDNA的质粒载体，通过受精卵原核注射法，获得Cre随机插入基因组的转基因小鼠。
由于启动子大小的限制，只选择了一定范围的表达调控元件序列，构建Cre表达载体，加上转基因随机插入基因组的位置效应影响、拷贝数的差异、以及内源基因可能破坏等因素，使每个Cre首建鼠存在个体差异，且需要通过对每个首建鼠特征进行筛选与鉴定，获得特定理想的Cre转基因小鼠模型。
因此，通过传统转基因技术构建的Cre 小鼠模型，出现所谓Cre作用的“脱靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。
2. 定点敲入Cre小鼠模型：将Cre基因定点敲入相关内源基因位点，借助内源性基因调控序列确定Cre表达特征，已成为传统转基因Cre小鼠构建的替代选择，也增加了Cre基因表达活性的精确性。
应用CRISPR/Cas技术方法，将单拷贝Cre定点敲入相关内源基因位点，按以下几种策略方式敲入：（1）特定内源基因翻译启始位点; （2）借助IRES序列连接，将Cre基因敲入内源基因的3’ UTR区域；（3）借助2A“自切割”肽连接，将Cre基因替换并敲入内源基因的终止密码处。
一般而言，直接将Cre敲入特定内源基因的翻译启始位点的策略，往往会同时破坏了该基因的表达。
有研究发现，因Cre敲入到生长发育或疾病通路等至关重要相关基因中，导致相应Cre小鼠，出现影响基因功能的潜在非特异性表型。
比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，杂合Cre小鼠即出现小鼠前脑发育障碍。
所以，该策略只适合于哪些杂合缺失无表型的相关基因。
而应用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre 特定位点敲入，可能引起的杂合缺失表型的不足。
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。
利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。
只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。
特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。
随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。
使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。
2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。
图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。
通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。
（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。
2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。
默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。
浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。
生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。
例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。
转基因小鼠技术
---转基因小鼠的构建
李懿萍
2010.05.20
2019/1/6
1
基因打靶的简易程序
2019/1/6
2
胚胎干细胞（ES细胞）法
优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、 表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛 选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
细菌-动物细胞-转基因动物
2019/1/6 38
转基因动物生物反应器研制
乳腺生物反应器具有以下特点： ⑴乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循 环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响； ⑵乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器； 一头奶牛一年可生产乳蛋白250—300Kg，一只绵羊或山羊 一年可生产乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代 换成医用蛋白，产量十分可观。 ⑶乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋 白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性 接近天然产品； ⑷在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖 生产群体。
17. 1996年 -- “百慕大法则”
公共基因组序列数据
18. 1998年 -- 克隆鼠
1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出 了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。
2019/1/6
32
小鼠的历史
19. 1999年 -- 小鼠基因组测序协会
人类基因组三个主要测序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute, The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一个相互协作的小鼠基因 组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC)
人心肌肌钙蛋白C两种突变转基因小鼠模型建立与对比分析
人心肌肌钙蛋白C两种突变转基因小鼠模型建立与对比分析高珊;陈伟;刘宁;葛文萍;高翔;吕丹;张连峰;董伟【摘要】Objective To established cardiac-specific transgenic mice of the cTnC D145E and cTnCG159D and compare the HCM and theDCM.Methods The cTnCD145E and cTnCG159D were generated by site-directed mutagenesis and the transgenic plasmids were constructed by insertion of the mutant genes under the control of α-MHC, which is a myocardium specific promoter.The transgenic mice were generated by microinjection and were all maintained on a C57BL/6J genetic backgroud .The cardiac structure and function of the transgenic mice were compared and analysized by echocardiographic and pathological observation at different ages .Results The cTnCD145E and cTnCG159D transgenic mice were established and developed to HCM and DCM, respectively, with aging.The left ventricular end-systolic volume (ESV) and left ventricular end-diastolic volume ( EDV) decreased and ejection fraction ( EF) and left ventricular end-systolic posterior wall thickness (ESPWT) increased in the cTnCD145E transgenic mice, while EDV and ESV increased and EF and ESPWT decreased in the cTnCG159D transgenic mice at 12 months of age.Conclusions Cardiac-specific human cTnCD145E transgenic mice showed HCM phenotypes , and cardiac-specific human cTnC G159D transgenic mice showed DCM phenotypes , which can be used as different models for comparative study of the pathogenesis of cardiomyopathy .%目的：为建立心肌组织特异性表达人cTnCD145E和cTnCG159D突变基因转基因小鼠，为对比分析两种不同心肌病的发生发展建立模型。
转基因鼠构建原理与流程
转基因鼠构建原理与流程
1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。
整合基因的拷贝数可能在不同的首代转基因鼠中也不同。
因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。
由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。
2、原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。
3、F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。
4、对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。
微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征
微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征马登磊;张旭;罗艺;黄蕊;李雅莉;李林;张兰【摘要】目的构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型.方法将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau的细胞模型.引进并繁育rTg4510小鼠(P301L突变tau转基因小鼠)以及PS19小鼠(P301S突变tau转基因小鼠).通过Western blotting法检测总tau及磷酸化tau蛋白的表达,应用免疫组织化学的方法检测转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白的表达情况,应用免疫荧光的方法检测HEK293细胞微管形态的变化.结果本研究成功构建过表达tau蛋白的细胞模型,繁育了两种tau转基因小鼠,在这些模型中tau蛋白表达及tau蛋白的磷酸化水平显著高于对照组.在不同突变类型的细胞和动物模型中,tau蛋白不同位点的磷酸化水平变化以及微管形态变化略有差异.结论本研究成功构建了P301L/P301S突变tau蛋白的细胞和动物模型,这些模型均表现了显著的tau蛋白过度磷酸化的病变,并引起了细胞微管形态或tau蛋白病理的变化,进而为包括AD在内的tau蛋白病变提供了实验模型.【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】6页(P582-587)【关键词】微管相关蛋白tau;细胞转染模型;转基因动物模型;微管【作者】马登磊;张旭;罗艺;黄蕊;李雅莉;李林;张兰【作者单位】首都医科大学宣武医院药学部,北京100053;神经变性病教育部重点实验室,北京100053;北京市神经药物工程研究中心,北京100053;神经变性病教育部重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院中心实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院药学部,北京100053;神经变性病教育部重点实验室,北京100053;北京市神经药物工程研究中心,北京100053;首都医科大学宣武医院药学部,北京100053;神经变性病教育部重点实验室,北京100053;北京市神经药物工程研究中心,北京100053;首都医科大学宣武医院药学部,北京100053;神经变性病教育部重点实验室,北京100053;北京市神经药物工程研究中心,北京100053;首都医科大学宣武医院药学部,北京100053;神经变性病教育部重点实验室,北京100053;北京市神经药物工程研究中心,北京100053;首都医科大学宣武医院药学部,北京100053;神经变性病教育部重点实验室,北京100053;北京市神经药物工程研究中心,北京100053【正文语种】中文【中图分类】R592微管相关蛋白tau(microtubule-associated protein tau，MAPT)是一种微管结合蛋白，在细胞中发挥正常的生理功能。
可诱导性组织特异性转基因小鼠构建技术原理
可诱导性组织特异性转基因小鼠构建技术原理
制作转基因小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。
DNA 原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。
使用PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
可诱导性/组织特异性转基因小鼠
将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因小鼠模型，转基因在正常情况下并不表达，只有与相应的组织特异性表达Cre/CreERT2小鼠杂交后，因Stop终止序列在特定的组织中被去除，从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达的目的。
转基因小鼠制备实验具体步骤及详细说明
转基因小鼠制备实验具体步骤及详细说明遗传的基本物质是DNA，基因是位于染色体上有遗传效应的DNA片段，对于储存在生物全套染色体中的全部遗传信息，可称其为基因组。
不同种类、不同个体的生物基因组成是不同的，对动物个体来说，非自身的基因成分属于外源基因，如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中，这个外源基因就被称为转基因(transgene)(即转移来的基因)，这种动物就是转基因动物。
实验步骤1. 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。
2. 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3. 第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4. 10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3 mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5. 仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5%CO2，37℃培养箱培养。
6. 在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7. 安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8. 在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37℃培养箱培养。
9. 将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01 ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
顶端外胚层嵴表达Cre重组酶转基因小鼠的鉴定
顶端外胚层嵴表达Cre重组酶转基因小鼠的鉴定【摘要】顶端外胚层嵴（AER）是中胚层间质细胞诱导其外侧的外胚层细胞形成突起结构，位于肢芽的远端边缘背腹交界处，是肢体生长发育的主要信号中心。
利用转基因技术构建在AER中表达Cre重组酶的转基因小鼠（Col10a1-Cre），使Cre重组酶在AER中特异性表达，从而可以特异性地在AER中敲除被LoxP 序列锚定的目的基因。
确定此转基因小鼠Cre重组酶的表达的时间和空间特异性。
实验结果证明Cre重组酶在顶端外胚层嵴中能够特异性表达并能介导LoxP 间的重组。
在顶端外胚层嵴发现特异性的蓝染，将Cre重组酶的表达范围限定在此区域。
【关键词】顶端外胚层嵴;Cre重组酶;LoxP;特异性敲除1.实验原理1.1顶端外胚层嵴（apical ectodermal ridge，AER）概述AER是由中胚层细胞诱导其外侧的外胚层形成，它位于肢芽的远端边缘、背腹之交界处，是肢体生长的主要信号中心。
多指症、并指症、无肢症、短指症等先天性肢体畸形的发生与AER发育的异常和功能的失调都有着密切的联系。
1.2 Col10a1-Cre转基因小鼠我们构建了在8.2 kb小鼠X型胶原基因（Col10a1）启动子和3.2 kb小鼠X 型胶原基因第二内含子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠品系（Col10a1-Cre）。
采用显微注射法将14.7 kb的转基因片段导入小鼠基因组，获得了3只在基因组上整合有Cre重组酶基因。
图1-1 Col10a1-Cre转基因载体构建图1.3 条件基因打靶技术运用Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件基因打靶，靶基因或重要功能域片段被两个LoxP序列锚定，经同源重组被引入ES细胞，通过显微注射获得靶基因被两个LoxP序列锚定的条件打靶小鼠，该小鼠只有在与组织或细胞特异性表达Cre的转基因小鼠交配后，Cre介导的重组发生在特定的组织活细胞中，导致这些组织活细胞中靶基因被删除，而其他组织或细胞中由于Cre不表达，靶基因不会被改变[1,2]。
CaMK_在学习和记忆中的作用
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学习能力不受损 ,但是恐惧条件记忆 (fear condition2 ing memory) 减退 ; 抑制 CaMK Ⅱ2Asp2286 表达 ,仍然 可以恢复恐惧条件记忆[9] . 因此 ,CaMK Ⅱ通过不同 的信号转导通路和不同的大脑部位参与不同的学习 记忆过程 。
Ⅱ磷酸化而被激活 ,活化的 CaMK Ⅱ自身磷酸化 ,因 此 ,即使脑内 Ca + + 下降后 CaMK Ⅱ仍能保持活化状 态[3 ,4] 。于是 ,人们推测 CaMK Ⅱ可能是记忆的分子 基础 。
1 CaMK Ⅱ与学习和记忆
111 CaMK Ⅱ是空间学习和记忆的分子基础 CaMK Ⅱα亚基是神经系统特异表达的蛋白 ,并
雏鸡经过味觉被动回避训练后 ,在形成短时记 忆的鸡左半球中 ,IMHV 和 LPO 两个部位的 CaMK Ⅱ Thr286 自身磷酸化都增加 ;而在形成长时记忆的鸡 左半球中 ,只有 LPO 部位的 CaMK Ⅱ自身磷酸化增 加[13] 。这些结果提示 ,不同部位的 CaMK Ⅱ可能在 记忆的不同时相起不同作用 。
1971 年 ,O′Keefe 和 Dostrovshy 发现了海马部位 有“Place Cell”,即当动物处在不同位置时 ,海马部位 不同的锥体细胞群放电 。当动物移动位置时 ,原来 放电的细胞停止放电 ,一些未放电的细胞开始放电 。 当动物进入新的环境几分种 ,新的位置细胞立即形 成 ,并且稳定存在几周至几月 。为了研究 Place Cell 与空间学习记忆的关系 ,Rotenberg 等用转基因方法 得 CaMK Ⅱ2Asp2286 突变小鼠 ,该小鼠 Place Cell 数 量减少 ,放电细胞群形成的图谱不如野生型小鼠清 晰 ,Place Cell 一 旦 形 成 , 稳 定 存 在 的 时 间 减 少[7] 。 以上实验结果表明 ,CaMK Ⅱ可能参与空间学习和记 忆过程 。
CaMK_基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建
Chang - w en, LIN Zhao - hua, KE Q i. (Fujian M edica l University, Fuzhou 350004 ) Abstrac: t O b jective : To clone and characte rize the C a MK pro m o ter and to construct a neuron - specific vector w ith C re recomb inase . M ethods : 8 1kb o fC a MK 5 flank ing regu lation reg ion w as obta ined by PCR. T his fragmentw as subc loned , partial ly sequenced , then reconstructed w ith pCre- I RES- EGFP plasm id . R esults : R estr iction endonuc lease digestion confir m ed that the restr iction s ite o f the 8 1kb frag m en t co rresponded w ith tho se o f the reported sequence fro m the mouse line C57BL /6J, of wh ich the se quence fu ll o f cis- acting ele m ents w ere the sa m e as tho se repo rted. T his 8 1kb fragm ent was exactly inse rted a t upstrea m fro m the Cre recomb inase . T he transgene v ector w as constructed and na m ed as pCa MK - Cre- IRES- EGFP. Conc lusion: construction of the pCa MK - Cre- IRES- EGFP lays the foundation for the g eneration o f the m ice express ing C re in forebra in neuron, and is he lp fu l to the research o f ne rvous syste m re lated d iseases . Key words : P rom oter ; C lone ; Cre recomb inase ; T ransgene construct; N euron- spec ific Cre- loxP 系统介导的条件 性基因 敲除技 术是基 因功能 研究的重要手段之一 。该技术 需要制备两种 遗传工程 小鼠 , 一种是组织特异性表 达 C re的转 基因小 鼠 , 另 一种是 目的基 因片断两侧带有 loxP 位点的基因打靶小鼠 , 通过两种鼠系的 杂交 , 可实现时间与空间特异性的基 因敲除。为了 研究成年 小鼠大脑的基因功能 , 选择一个在特定大 脑亚区和 特定时间 指导 Cre表达的启动子是至关重要的。 目前 , 被广泛使用 的神经 系统 特异 性启动 子有 许多 种 , 其中包括 Ca MK 基因启动 子。 Ca MK ) 由 10~ 12个 ( C a2+ / calmodu lin 和 亚单位组 - Dependent P rote in K inase 1. 材料和试剂 DH 5 和 J M 109 菌 株 由 本 室 保 存。 LA PCR 试 剂 盒、 pMD 18- T 载体、 限制性 内切酶、 胶回 收试剂 盒和 DNA b lun ting k it购自 TAKARA 公司 ; PCR 和测序引物 由上海生工生物 工程技术服务有限公司合成 , 并 由该公司完成基因序列测定 ; DNA 分子量标 记物购 自 Fer m entas 公 司; pCre- I RES- EGFP 质粒由本实验室江一平教授馈赠 ; 其余试剂均为国产分析纯。 2. 方法 ( 1) 长 片 段 PCR 扩 增 根 据 公 布 的 C57BL /6J 小 鼠 Ca M K 基因序列设计引物 , 分别扩增 5. 26kb 和 4 . 9kb 片段。 5 . 26kb 片段正向和反向引物序列分别为 A3 : 5 - CTAAAAG CAGAGGGCAGAGGAAAAG - 3 和 A 2 : 5 - GCACTGGGCAG GCAGGCGA - 3 。 4. 9kb 片段 正 向 和反 向 引物 序 列 分 别为 B1: 5 - TGGCT CGCCTGGCTGATTAT - 3 和 B2: 5 - GATG TAGGGACTGCCTTTGGTAGA - 3 。 50 l 的 PCR 反 应 体 系 为 : 25 l 2 ∀ G C buffer , dNTP ( 2. 5 mm o l/L ) 8. 0 , l 正、 反向引 物 ( 20 m ol/L ) 各 0 . 5 ,l 1 g C57BL /J6 小鼠 基因 组 DNA 和 2. 5 U LA T aq 酶。 PCR 扩增 条件 : 94# 预变 性 1m in; 94# 变 性 30s , 60# 退 火 30s , 72# 延 伸 6m in, 30 个 循环 ; 72# 延 伸
平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立
[收稿日期] 2004-12-31[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(30230180);国家杰出人才基金(30025028,30128013)[作者简介] 杨蕾蕾(1978-),女,山东省招远市人,在读硕士生。
吴 壮(1975-),男,吉林省长春市人,在读博士生。
┼并列第一作者3通讯联系人,杨 晓,Tel:010*********,E 2mail:yangx@nic .bm i .ac .cn;徐 军,Tel:020*********,E 2mail:xufeili@vi p.平滑肌细胞特异表达Cre 重组酶转基因小鼠的建立杨蕾蕾1,吴 壮2┼,程 萱1,徐 军23,杨 晓13(1.军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071;2.广州医学院第一附属医院 广州呼吸疾病研究所,广州 510120)[摘要] 目的:建立平滑肌细胞特异表达Cre 重组酶的转基因小鼠。
方法:用分子克隆的方法构建含有α平滑肌肌动蛋白(α2S MA )启动子、Cre 重组酶基因和poly A 的转基因载体α2S MA 2Cre 。
以显微注射的方法将5.3kb 的转基因片段引入小鼠基因组。
通过PCR 和LacZ 染色以检测Cre 重组酶在体内介导重组的功能。
结果:共注射282枚受精卵,移植至10只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠19只,经PCR 鉴定有4只小鼠在基因组上整合有Cre 基因,整合率为21%。
将该小鼠与基因组上携带L oxP 位点的Sm ad4条件基因打靶小鼠交配,通过PCR 在所有含有平滑肌细胞的组织基因组DNA 中检测到重组后的234bp 特异条带。
与“报告”小鼠—ROS A26交配,LacZ 染色后小肠壁平滑肌细胞中特异地检测到Cre 重组酶活性。
结论:成功构建了平滑肌细胞特异表达Cre 重组酶的转基因小鼠,该小鼠在平滑肌细胞中特异表达Cre 重组酶,并能在体内成功地介导L oxP 位点间的重组。
转基因小鼠模型的建立和应用
一、概述二、显微注射法转基因小鼠模型制备，一般由专业技术人员来进行技术操作。
首先要设计好转基因的载体。
构建转基因载体，有几个必要的因素。
首先，要找到所需要表达蛋白的基因，或者是 CDNA 序列。
其次选择特异性的启动子，该特异性的启动子，可以决定基因的表达效果或者表达的组织。
如果要求超水平表达，还可以加增强子，提高启动子的活性，增加表达水平。
另外，还需要在所设计的 CDNA 的序列后面，加上 PolyA 尾巴，来增加表达的稳定性。
然后将这些 DNA 片段，共同构建入子粒载体。
上图是常规的转基因子粒载体，从图上可以看到，该载体包括增强子、启动子、CDNA 及 PolyA 。
将其串联起来，共同形成转基因载体。
（一）、启动子类型在设计单纯转基因动物的过程中，启动子的类型非常重要，因为根据实验的目的，如果超水平表达，可以选择构成性的表达启动子。
这类启动子可以不受调控，在所转入的细胞进行高水平的表达。
如 CMV 启动子，SV40 启动子，这两个启动子是常用于超水平表达特定的基因。
第二类是组织特异性表达启动子，这类启动子由于组织特异性活性，只在特定的组织细胞有活性，来启动特定基因的转录。
比较典型的有只在内皮细胞有活性的 TIE2 启动子，还有只在星形细胞有活性的GFAP 启动子。
如果需要制备一个只在某一个组织器官特异性表达的基因，可以首先去选择只在这个组织器官有特异性活性的启动子。
第三类，是诱导性表达的启动子。
有时需要表达的靶基因只是在某个时项，如在成年或者在某一阶段开始表达。
可以选择一些启动子，该启动子只是在外源性化合物，给入诱导的情况下，才能够具有表达活性。
如四环素诱导的启动子，只有给小鼠注入四环素的情况下才能够使该启动子具有表达活性，从而来控制靶基因的表达。
（二）、转基因注射流程上图是转基因小鼠制备的主要流程。
当构建转基因载体后，需要把转基因载体通过分子生物学的手段进行扩增、存放，然后将环状的质粒载体，进行线性化。
肌酸缺乏综合征基因检测
催化剂
AGAT
甲基化
胍基乙酸 GAMT(催化)
鸟氨酸
S-腺苷高半氨酸
肌酸
转运体
CRTR
进入细胞
英文缩写 AGAT GAMT CRTR
中文名 甘氨酸脒基转移酶 N-胍基乙酸甲基转移酶 氯依赖性肌酸转运体
编码基因 GATM GAMT SLC6A8
胍基乙酸的堆积 会产生毒害效应 3
2
1
生物学指标检测
血浆 胍基乙酸 肌酸
治疗效果
时间 1周之后
效果 运动能力显著提升，能够独自爬楼梯
血清和尿液中的肌酸和胍基乙酸水平恢复正常，大脑 中的肌酸增长显著。上下楼梯不再有任何困难。
3个月后 语言能力有了显著提升，与家人的交流更多了。
睡眠比以前更安静，除了流唾液没有其他任何异常行 为。
一年后
停止流唾液，行为和正常小孩一样
现在（9岁） 在学校表现正常，成绩高于平均水平
杂合
杂合
未发现变异
治疗方法
• 每天限制精氨酸饮食，每天精氨酸摄入量小于20-25g。 • 在限制精氨酸饮食一周后，每天补充一剂量肌酸粉末
400mg/kg。 • Special therapeutic nutrition Cyclinex-2 and Pro-Phree,
mixed with Orange Fanta, was administered twice per day • 治疗两个月以后，给患者补充鸟氨酸，每天10g，一 天三次。
Nestin-Cre小鼠： 在神经系统中广 泛表达Cre
Lck-Cre小鼠： 在胸腺、胰腺、 淋巴中表达Cre
Tie2-Cre小鼠： 在血管内皮细胞 广泛表达Cre
实验结果
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制备方法学院：动物科技学院专业班级：学生姓名：学号：指导老师：时间：2015年12月17日老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。
从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。
这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。
转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。
现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。
关键词医学模型；试验方法；应用前景Methods and Applications of Transgenic Mice(Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling,Shaanxi,712100,China )Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental the 1980’ of di fferent genes have been transferred to the various strains of helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice.Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备显微注射法这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管，使胚胎在养母体发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。
也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。
表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。
亦可取胚胎进行分析。
显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。
我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。
基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的胚团（inner cell mass）中分离出来的。
它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。
这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。
因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。
正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。