实验五 拟南芥T DNA插入突变纯合体的鉴定
纯合体鉴定的原理及方法_
1.T-DNA插入突变体的鉴定T-DNA插入突变体从拟南芥资源中心（Ohio State University，Columbus）索要。
种子被播种在含有卡那霉素（Kan＋）的MS筛选培养基上，待萌发后10天左右，把生长正常的幼苗移置营养土中。
然后取10天后的叶片提取DNA，PCR进一步鉴定。
其原理如下图所示（图5-1）：LP，RP分别为基因的左边界和右边界，LB为T-DNA上的序列。
用三条引物进行PCR扩增，结果如右图所示。
用LP和RP扩不出条带，而用RP和LB能扩出条带的为突变体纯合株。
图5-1 突变体鉴定原理图纯合体鉴定的原理及方法图1：T-DNA插入的位置图2：纯合体鉴定所示条带By using the three primers (LBb1.3+LP+RP) for SALK lines, users for WT (Wild Type - no insertion)should get a product of about 900-1100 bps ( from LP to RP ), for HM (Homozygous lines - insertions in both chromosomes) will get a band of 410+N bps ( from RP to insertion site 300+N bases, plus 110 bases from LBb1.3 to the left border of the vector), and for HZ (Heterozygous lines - one of the pair chromosomes with insertion) will get both bands. The product size should be 200 base larger if using LBa1 instead of LBb1.3. However, the protocol requires the same or similiar TM values for all the LB, LP and RP primers.纯合体鉴定共需两次才能判定是否是真正的纯合体。
t-DNA插入突变体检测
2.2.3.7.取出凝胶，放入EB（溴乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色10-15分钟；
2.2.3.8.之后放入凝胶成像仪中，观察DNA跑胶的情况。
3.结果
3.1.第一次
TPS法提取44号样品DNA，以DL2000为Marker。
DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）
4.2.实验分析
4.2.1.加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。
4.2.2.DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。
T-DNA插入鉴定实验报告
T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
拟南芥atcwinv1基因T_DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
河南农业科学,2011,40(5):62 66Jour nal of H enan Ag ricultural Sciences拟南芥atcwinv1基因T DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔*,张 莹,王 波(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866)摘要:以拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异。
结果表明:拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5 88个百分点;突变体在44d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20 84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62 27个,较野生型降低11 00%;单株果荚种粒数平均45 87粒,较野生型降低21 46%;突变体的单果荚长度平均14 52cm,较野生型降低10 24%;单株果质量平均50 83mg,较野生型降低23 70%。
拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10 44cm,较野生型下降21 03%;主根长平均7 62cm,较野生型下降14 96%;单株莲座叶面积平均3 16cm2,较野生型下降13 90%;单株地上部分鲜质量平均81 81m g,较野生型下降11 11%;单株根鲜质量平均6 21m g,较野生型下降17 64%;单株地上部分干质量平均6 17m g,较野生型下降15 60%;单株根干质量平均0 55mg,较野生型下降6 78%。
拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18 78cm,较野生型增加4 22%;主根长平均16 48cm,较野生型下降5 88%;单株莲座叶面积平均6 80cm2,较野生型下降6 21%;单株地上部分鲜质量平均129 85mg,较野生型下降9 69%;单株根鲜质量平均9 97mg,较野生型下降13 23%;单株地上部分干质量平均9 22mg,较野生型下降4 16%;单株根干质量平均0 70mg,较野生型下降6 67%。
实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
ＰＣＲ ｄ ｎ ｉｉａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｐｈ ｎ ｔ ｐ ｃ Ｏｂ ｅ ｖ ｔｏ ｆａ ｃ ｉ ｖ Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｎ ｅ ｏ ｙ ｉ ｓ ｒ ａ ｉ ｎ ｏ ｔｗ ｎ ｌ Ｇｅ ｅ Ｔ— ｎ ＤＮＡ ｎ ｅ ｔｏ ａ ｕ ａ ｔｏ ｒ ｂ ｄｏ ｉ Ｉ ｓ ｒ ｉ ｎ ｌＭ ｔ ｎ ｆＡ ａ ｉ ｐｓｓ
ｕ ｅ ｏ ｃ ｍ ｐａ ｅ ｐ ａ ｓ ｄ ｔ ｏ ｒ ｌ ｎｔｍｏｒ ｈｏｌ ｉ ａ ｉｆ ｒ ｎｃ ｓ ｉ ｈｅ ｐｅ ｉ ｇｅ ａ ｉ ｅ ｇ ｏｗｔ ｎｄ ｒ ｐｒ ｄｕｃ ｐ ｏｇ ｃ ｌｄ ｆ ｅ ｅ ｅ ｎ ｔ ｒｏｄ ｏｆｖｅ ｔ ｔｖ ｒ ｈ ａ ｅ ｏ — ｔｖ ｏ ｈ． ｉ ｅ ｇｒ ｗｔ Ｔｈｅｒ ｓ ｔ ｈ ｅ ｕｌｓ ｓ ｏｗｅ ｈａ ｏ ｐ ｒ ｄ ｔ ｈｅ ｗｉｄ ｔ ｐｅ ｔ ｒ ｉ ａ ｉ ｎ ｒ ｔ ｆａｔｗｉ ｌ ｄ ｔ ｔｃ ｍ ａ ｅ ｏ ｔ ｌ ｙ ｈｅ ｇｅ ｍ ｎ ｔｏ ａ ｅ ｏ ｃ ｎｖ ａ ｅ ａ ｅ ｙ ｄｅ ｒ ａ ｅ ５ ｖ ｒ ｇ ｌ ｃ ｅ ｓ ｄ ｂｙ ．８８ ｐｅ ｃ ｎｔ ｇｅ ｐ ｎ ｓ； ｏｍｐａ ｅ ｏ ｈ ｗｉｄ ｔ ｅ， ｌｉ ｉ ｅ ｆ ａｒ－ ｒ ｅ ａ ｏｉ ｔ ｃ ｒ ｄ ｔ ｔ ｅ ｌ ｙｐ ｂｏ ｔｎｇ ｔｍ ｏ ｃ
植物DNA提取——拟南芥
【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。
2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。
3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。
4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。
【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。
在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。
研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。
此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。
β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。
经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。
分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。
抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。
Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 (2)
琼脂糖凝胶电泳
（1）
电泳流程
TAE-配方
PCR产物中加入适量的londing buffer,加入点 样孔。
电压：150V 电流：30mA 功率： 45W
30cycle
PCR-体系
10*buffer dNTPs 2 0.3 0.3*2 0.2 13.9 3 *20=40 6 6*2 4 278 单加
20ml
Primer Taq dd H₂O DNA
PCR-产物
用LP+RP产生大片段：1107bp 用LB+RP产生小片段：560-860bp
DNA的琼脂糖凝胶电泳
T-DNA插入鉴定的原理
（以拟南芥为例）
叶片 研磨
离心 冰浴 离心
DNA 提取液
上层溶 液
洗涤 干燥
细胞裂 解
异丙醇 沉淀
DNA 溶液
具体步骤
提取缓冲液：200mM Tris-Hcl(PH7.4);
25mM
EDTA(PH8.0); 250mM Nacl; 0.5%SDS (1) 取拟南芥两片叶子，置于1.5ml离心管中，加入700ml 提取缓冲液； （2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验目的
•
提取植物基因组DNA的方法 PCR操作方法 琼脂糖凝胶分离核酸方法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
•
•
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鉴定纯合子为进一步实验做准备
Ti-质粒与植物基因组的相互作用
Ti质粒和T-DNA
Ti质粒毒性区基因激活及 T-DNA复合物生成
1: a：农杆菌结合到宿主细胞壁； b：ChvE／VirA识别植物源信号，并形成大量 VirG—P蛋白： 2：VirG—P激活毒蛋白基因的转录； 3：转移底物和VirB复合物的形成； 4：转移底物与VirB复合物的结合及转移至植物细 胞： 5：T一复合物形成及转移至细胞核整合到基因组 6：T—DNA整合到宿主基因组； 7：VirB复合物
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
➢植株形态个体小，高度只有30cm左右；➢生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；➢种子多，每株可产生数千粒种子；➢形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；➢遗传转化简单，转化效率高；➢基因组小，只有5对染色体，125MB；➢在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥
姓名沈一鸣班级生技3班同组人无科目遗传学实验题目拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定组别无—————————————————————————————————————————————————————一、实验目的1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异；2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）：十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物拟南芥特点：1)植株形态个体小，高度只有30cm左右；2)生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；3)种子多，每株可产生数千粒种子；4)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；5)遗传转化简单，转化效率高；6)基因组小，只有5对染色体，125MB；7)在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物突变体是遗传学研究的最重要材料。
自然突变突变体的获得人工诱变拟南芥诱变常用方法：EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
T-DNA插入突变原理：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA（transferred DNA ）。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体：农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
2012.11.28
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模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组 （n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色 体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科 学家就可以准确定位插入DNA的位置。
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
201L2.O11G.2O8
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实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
2012.11.28
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实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下： 在上面的search内查找 基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟 南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以
得到基因在拟南芥内的系
统名称：AT1G69120
T-DNA插入双突鉴定
DNA 提取液
上层溶 液
洗涤 干燥
细胞裂 解
异丙醇 沉淀
DNA 溶液
具体步骤
提取缓冲液：200mM Tris-Hcl(PH7.4);
25mM EDTA(PH8.0); 250mM Nacl; 0.5%SDS (1) 取拟南芥两片叶子，置于1.5ml离心管中，加入700ml 提取缓冲液； （2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色； （3）在台式离心机上12000 rpm离心10分钟； （4）离心后将上清转移至一个新的1.5 ml离心管中； （5）在上清中加入700ml异丙醇，混匀后放入-20℃ 30分钟 然后12000 rpm条件下，离心10分钟； （6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温过夜干燥； （7）100 ml dd H₂O
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验目的
提取植物基因组DNA的方法 PCR操作方法 琼脂糖凝胶分离核酸方法
鉴定纯ห้องสมุดไป่ตู้子为进一步实验做准备
Ti-质粒与植物基因组的相互作用
Ti质粒和T-DNA
Ti质粒毒性区基因激活及 T-DNA复合物生成
T-DNA插入鉴定的原理
（以拟南芥为例）
叶片 研磨 离心 冰浴 离心
PCR-引物设计
/tdnaprimers.2 .html
以salk_080951为例： LP： TTCACAGTTTCAACGTTGTGG RP： GTAGCGTGATTTCGAGTTTGG
BP：
PCR-原理与程序
Condition 94 ℃ 5 min 94 ℃ 15sec 56 ℃ 15sec 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever
模式植物拟南芥tdna插入突变体的鉴定
模式植物拟南芥tdna插入突变体的鉴定姓名系年级学号日期科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。
本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。
实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。
现广泛应用于核酸的研究中。
引言Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
这使农杆菌Ti 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。
反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。
实验五 拟南芥T DNA插入突变纯合体的鉴定
点击突变体编号后进入的网页
进入网站/cgi-bin/tdnaexpress 查找基因突变体及插入方向
实验设计
T-DNA方向
3’引物
基因方向
5’引物
引物设计
• 基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥 网站/tdnaprimers.html进行 自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一 般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp 以上为宜，即300+N bp。
身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。 2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基
因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。
046号突变体的鉴定（1-6组）
30ml反应体系1：
30ml反应体系3：
2 ml 植物基因组DNA样品（WT）
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
3 ml 10×扩增缓冲液
30ml反应体系3： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
T-DNA插入基因的基因组序列
点击基因编号进入网页
点击sequence viewer进入
点击nucleotide view进入
1 ml 0463’引物（10mmol/L）
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
2 ml 植物基因组DNA样品WT
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
拟南芥T-DNA插入突变
（3）筛选纯和突变体 3、实突验变原体理鉴定原理
三引物法
“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、LB）进行PCR扩增。
野生型植株（WT）目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR产物仅有1种，片段大小为基因的长度（即 从LP到RP的长度）
The complex that comprises of the T-DNA bound to the binding protein then moves into the nucleus and is integrated into the nuclear genome.
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
• (1) 生长周期短, 6周内完成; • (2) 基因组小, 仅有5 条染色体,113 亿个碱基对,但是它的大多数基因与
其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，
• (3) 具有双子叶植物的所有特性
• (4) 有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源; • (5) 在有限的空间内可大量种植，体形小, 占地少 • (6) 收获大量的种子，每株拟南芥可产生多达5000 粒种子； • (7) 生活力强，用普通培养基就可作人工培养。
研究基因功能的方法
• 1、转基因技术 • 2、基因敲除 • 3、基因敲入 • 4、基因诱导超表达 • 5、基因诱捕技术 • 6、 RNAi干扰 • 7、生物信息学分析 • 8、反义技术
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染 双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感 染能力。
• 1.确定所要研究的基因 通过生物信息学的方法推测出一些可能具 有赤霉素糖基转移酶的基因。
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T-DNA插入基因的基因组序列
点击基因编号进入网页
点击sequence viewer进入
点击nucleotide view进入
件下，离心5分钟； （6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀； （7）100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。
（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）
PCR鉴定
30ml反应体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10×扩增缓冲液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L）
2ml 植物基因组DNA样品（WT） 2ml 植物基因组DNA样品（111）
3ml 10×扩增缓冲液
3ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
30ml反应体系3： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10 mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10 mmol/L）
1 ml LBamol/L）
135号突变体的鉴定（7-11组）
30ml反应体系1： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突
变体的方法。
T-DNA插入鉴定的原理
突变体鉴定的步骤
1. T-DNA插入基因的基因组序列； 2. T-DNA插入方向的确定； 3. T-DNA插入位置的确定； 4. 引物设计； 5. PCR扩增； 6. 电泳检测。
3 ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10mmol/L）
0.5 ml dNTP（10mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10mmol/L）
1 ml 0463’引物（10mmol/L）
1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
1ml LBa 引物（10 mmol/L）
1ml LBa 引物（10 mmol/L）
电泳检测
• 每个大组选两个人点样，电泳结果扫描保 存，下次课看结果。
身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。 2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基
因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。
046号突变体的鉴定（1-6组）
30ml反应体系1：
30ml反应体系3：
2 ml 植物基因组DNA样品（WT）
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
3 ml 10×扩增缓冲液
点击突变体编号后进入的网页
进入网站/cgi-bin/tdnaexpress 查找基因突变体及插入方向
实验设计
T-DNA方向
3’引物
基因方向
5’引物
引物设计
• 基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥 网站/tdnaprimers.html进行 自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一 般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp 以上为宜，即300+N bp。
1 ml 0463’引物（10mmol/L）
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
2 ml 植物基因组DNA样品WT
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
3 ml 10×扩增缓冲液
3 ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
用无菌水补足体积。
PCR反应条件
94℃ 3min 30循环 （94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min）； 72℃ 延伸10min。
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和 引物的性质进行合适的调整。
PCR安排
每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下： 1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自
• LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
植物基因组DNA的快速提取
（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加 入400 ml提取缓冲液；
（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色； （3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟； （4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中； （5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条