细胞计数法

细胞计数法

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

1、制备细胞悬液

对于悬液培养的细胞，可直接进行下面的步骤2（计数与计算过程）。如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物制备成细胞悬液。

1）、终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。

2）、给培养瓶内加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化1-3min 。期间在镜下观察。当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。

3）、加入一定量的培养液（如果这些培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。

2、计数与计算过程

1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4）、按下式计数细胞悬液的密度：

细胞密度＝（4个大正方格细胞总数/4）×稀释倍数×104个/ml

注：稀释倍数（至少乘以2，因与trypanblue等体积混合）

表示不计数：

范例：

T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。（其实取20ul即可）

活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2

细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106

细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

存活率：225/243

注意事项：

1）、务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。

2）、显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200个/10mm2或>500个/10 mm2

时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。

0.4%w/v trypan blue（GibcoBRL15250-061 ）

Erythrosin bluish（SigmaE-9259）

细胞计数及活力测定

一、原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）

2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇

3、材料：细胞悬液

三、操作步骤

（一）细胞计数

1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×稀释倍数×10-4

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（二）细胞活力

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。（其实取20ul即可）

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。（三）MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。

2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。

3、37℃下保温2小时。

4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。

5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。

注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

附：1、0.4%台盼兰染液配制：

台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。

2、MTT配制：

MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。

3、酸化异丙醇配制：

异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。