第二章 生产菌种的选育
发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
第二章 酒精生产所用的微生物菌种
2-1-2 酒精发酵菌种
二、糖蜜原料生产酒精常用酵母菌 F396（台湾396）、As.2.1189（古巴Ⅰ） As.2.1189（古巴 Ⅱ）Rasse
5
2-1-3 菌种培养基的制备
米曲汁培养基的制备（霉菌、酵母）
大米→浸泡→蒸米→冷却→接种→培养→米曲
→加水→保温糖化→过滤 →米曲汁 麦芽汁培养基的制备（霉菌、酵母） 麦芽粉→加水→保温糖化→过滤→麦芽汁
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第二章 酒精生产所用的微生物菌种
第一节 常用菌种及其培养特性 第二节 生产菌种的选育、保藏与复壮1Βιβλιοθήκη 2-1 常用菌种及其培养特性
2-1-1 淀粉糖化菌种 一、曲霉 1.黑曲霉 UV-11(As.3.4309),萌发期较 长;UV11-48,萌发期较短 2.乌沙米曲霉 东酒一号的出发菌株、含丹 宁酶、耐酸 3.黄曲霉 4.米曲霉 As3.951（沪酿3042） 蛋白酶活性较强，常用于制造酱油及制备米曲汁
2
2-1-1 淀粉糖化菌种
二、根霉 黑根霉 米根霉 华根霉 三、细菌 枯草杆菌BF7658主要生产α-淀粉酶 发酵运动单胞菌-通过ED途径发酵葡萄糖、 蔗糖生产乙醇 耐热纤梭菌-直接利用纤维素、半纤维素产 乙醇 耐热糖梭菌-利用五碳糖产乙醇
3
2-1-2 酒精发酵菌种
一、淀粉质原料常用的酵母菌 1.拉斯2号（RasseⅡ）发酵玉米，有泡沫 2.拉斯12号（Rasse Ⅻ） 3.K字酵母 多用于薯干、高粱等原料 4. 1300（南阳5号酵母） 5. 1308（南阳混合酵母）适于含丹宁的原料 6.H5-2 耐高温酵母，达40度，发酵速度快 7.耐高温活性干酵母（Angel 安琪-湖北宜昌）
6
2-1-3 菌种培养基的制备
察氏合成培养基的制备 （霉菌) 蔗糖3.0 NaNO30.3 K2HPO40.1 KCL0.05 MgSO40.05 FeSO40.001 小米试管培养基的制备 （霉菌)
第二章 兽医生物制品菌(毒)种的选育与构建
■ 由于 DNA 上核苷酸碱基的改变，而导致遗传性 状突变的结果。
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（二）弱菌（毒）种选育
弱毒（菌）种的选育
自然弱毒株的分离
同源 动物
异源 动物
人工诱变致弱
化学 途径
物理 途径
生物 途径
亚
高
适毒力强， 抗原性好， 性状稳定的菌毒株， 经增殖后进行冻干保存， 冻干菌种于 4℃保存， 冻干病毒毒种于零下 20℃以下， 可保存多年。
冻干菌/毒种一经动物传代，即应重新分离、鉴定和 检测后使用。
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（二）弱菌（毒）种选育
■ 弱菌 （毒）种用于弱毒活疫苗，部分诊断制品和 抗血清的制造。
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强菌（毒）种选育
②抗原性测定 反应原性多采用血清学方法， 以抗体滴度或效
价表示。 免疫原性多采用定量原强菌（毒）株的菌（毒）
液攻击免疫动物， 以保护率表示。
均应设对照，否则无效
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强菌（毒）种选育
③稳定性测定 ■ 毒力 （致病力）和抗原性还要进行稳定性测定，
以证明后代特性不变， 才有使用价值， 并参与筛 选择优。
■ 提高稳定性的方法：挑选和纯化
■ 如羊痘鸡胚化毒种在经过羊体传代2-4代复 壮、纯化后方能用于疫苗制备。
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4. 良好的反应原性和免疫原 性
■ 要求菌（毒）种具有良好的免疫原性，接种后能诱发机体的 体液免疫和细胞免疫，并持续较长的时间，使免疫动物获得 强效的免疫力。
■ 一般来说，动物接种后产生80%以上的保护即认为具有良好 的免疫原性。
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3. 初选依据
■ 细菌菌落特征的变异 ■ 病毒蚀斑的变异 ■ 对温度敏感性变异 ■ 对药物敏感性变异 ■ 对营养要求变异 ■ 对宿主动物易感性变异
第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT
筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法
第二章 菌种的筛选、选育和保藏
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
第二章菌种的选育
体的筛选方案与操作步骤：
进行综合、具体问题分析来决定。
2. 快中子 快中子的生物学效应是由其撞击原
子核后产生的质子产生的。 能够引起较多的点突变和染色体变， 而产生诱变育种的效应。
3.氮芥(p40) 机理：氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠
反应释放出氮芥子气，再与细胞作 用引起染色体发生畸变。
使用方法： 活化剂和解毒剂的配置 氮芥的盐酸盐配置 诱变作用 诱变终止
第二章菌种的选育
内容 1.菌种的来源 2. 菌种的选育 3. 菌种的保藏
2.1 菌种的来源 微生物具有的五大特性 1.种类多,分布广; 2.比面积大,代谢能力强; 3.生长迅速,繁殖快; 4.适应性强,容易培养; 5.易变异.
2.1.1生物物质产生菌的筛选 2.1.1.1微生物---生物产物的来源 两个成功因素
分生孢子
4.重组体的形成 异核体菌落在生长过程中，染色体
重叠的两节段（二体区）的不同位置发 生交换后能 产生重组体孢子。
+ 重组体
2.6.2.1放线菌的杂交技术 1.混合培养法 a.选择性平板法 b.异核系分析法
2.平板杂交法
3.玻璃纸转移法 成功报道：金霉素、土霉素、新霉素、红 霉素、新霉素等抗生素杂交育种方面。
1. 指示菌 大肠杆菌BR513(ATCC33313) 2.指示微生物培养 3.指示微生物倒固体检测平板 入ß-半乳糖苷酶的生色基质混合物 （84mg褪蓝RR和14mg6-溴-2萘-β-D半乳糖吡喃糖苷于2ml二甲基亚砜中）， 再加入琼脂静置，观察颜色变化情况。
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
第二章微生物育种的原理和方法
第二章 微生物育种的原理和方法微生物育种原理和方法微生物育种筛选方法微生物育种原理和方法一、微生物育种原理方法：突变、体内重组体外重组（基因工程）1、从自然界中获得新菌种微生物资源分布：土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所2、分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤3、典型的微生物采样和筛选方法生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制不会有代谢产物的积累解除或突破微生物的代谢调节控制目的产物积累微生物育种的目的直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。
往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产二、诱变育种方法1、物理诱变：紫外线2、化学诱变：5-溴尿密啶1）紫外线诱变机理：造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应2）诱变过程中需要注意光复活作用：微生物等生物的细胞内存在光复活酶，光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物（此时的光复活酶没有活性），可见光光能（300-500nm）激活光复活打开二聚体，将DNA复原。
暗修复：细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。
紫外诱变的特点：方便、诱变效果很好的常用诱变剂由此说明紫外线照射引起微生物突体形成是一个复杂的生物学过程。
紫外线引起DNA结构的改变仅仅使微生物，于亚稳定状态，点亚稳定到稳定的突变体的形成需要“定时间和过程，所以在实际诱变工作中要采取某些措施避免以上的修复作用，要注意避光或加入某些物质，提高突变的频率。
因此，用紫外线进行诱变时，照射或分离均应在红光下进行。
3）化学诱变剂诱变机理：5-溴尿嘧啶诱变——碱基类似物机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应注意的参数：参数：浓度、时间、缓冲液三、诱变育种的基本过程诱变育种的基本过程如下：1）出发菌株的选择A、一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
第二章 微生物菌种选育
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
生产菌种的选育培养—生产菌种的选育方法
3. 毕赤酵母属（Pichia） 含丰富的蛋白质、维生素、酶，制造单细胞蛋白、酿酒
霉菌及其代谢产物
1. 曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus）
细菌及其代谢产物
醋杆菌属（Acetobacter）：醋酸、山梨醇 乳杆菌属（Lactobacillus）：乳酸、乳制品 芽孢杆菌属（Bacillus）：丙酮、乙醇、丁醇、淀粉 酶、蛋白酶、果胶酶
假单胞菌属（Pseudomonas ）：维生素B12、色素 黄单胞菌属（Xanthomonas）：维生素B12、黄原胶
2. 青霉属（Penicillum） 3. 根霉属（Rhizopus ）
米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis） 4. 红曲霉属（Monascus）
其它微生物
1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom） 2. 藻类（alga）
工业生产中对菌种的要求：
第二节 生产菌种的选育方法
菌种的来源：
●根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； ●从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
菌种选育的目的：改良菌种的特性，符合生产的需要。
菌种选育
选种 育种
方法：
选种——分离筛选 育种——诱变或杂交
一、发酵工业中的常用微生物
1、细菌 2、放线菌 3、酵母菌 4、霉菌
原生质体融合
1. 去除细胞壁。
2. 通过一定的手段 促使两个原生质 体融合。
代谢控制育种
原理：通过目的产物的生物合成途径、遗传控制及代谢调节机制的研究， 进行定向诱变，提高诱变效率。
菌种的选育
土曲霉 土曲霉 链霉菌
金色链霉菌
35.9
54
5、后培养
表型迟延现象
生理性
分离性
遗传物质经诱变处理后发生的突变，必
须经复制才能养才能稳定
变异，使菌株表现出高的突变频率。
55
6、变异菌株的筛选
由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，
必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。
5
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透
明圈法初筛. 在选择培养基中加入碳 酸 钙 ，使平板呈混浊
状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成 清晰的透明圈.
6
透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在 深 层 培 养 中 的 产 酶 单 位 与 平 板 上
圈的大小之间并不完全成正比。
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4、自然选育的特点
自然选育简单 易行，可以达 到纯化菌种、 防止菌种衰退、 稳定生产、提 高产量等目的。
自然选育的最 大缺点是效率 低、进展慢， 很难使生产水 平大幅度提高。
25
用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质
（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过
筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。
基因突变
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光复活作用
切补修复
损伤修复
重组修复 SOS修复系统 DNA多聚酶的校正作用
30
前 突 变 ——诱 变 剂 所 造 成 D N A 分 子 的 某 一 位
臵的结构改变。
31
光复活作用
具有校正差错 切补修复 的性质，不利于 突变的诱发。
DNA多聚酶校正 作用
32
重组修复
具有引起差错的 性质，利于突变
发酵工程第2章2 菌种的选育与保藏
2.3传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的 生长温度下生长和保存的传代保藏方法。
可用于实验室中若干菌种的保藏。 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。
2.3 传代培养法
实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于 厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保存期。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常 用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏，便于运输。
培养物的冻干过程
冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 灭菌
菌种 培养 制备菌悬液
分装安培瓶 预冻
真空干燥 测定水分
操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，
用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置 4C˚冰箱中包藏。
保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保 存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月， 假单胞菌两周传代一次。
此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易 被污染。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。
在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检 测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。
成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括：在 保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中 试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极 为重要。
工业发酵菌种选育
纯种分离的方法有稀释分离法、划线分离法等
现代发酵技术
稀释分离法
现代发酵技术
平皿划线分离法
a.分区划线分离法
b.连续划线分离法
现代发酵技术
菌种筛选（初筛+复筛）
（1）平板筛选（初筛）
从产物角度出发
根据产物的性质有目的地设计培养基来筛选菌种
从形态角度出发
现代发酵技术
抑菌圈法
测试菌苔 含药物滤纸
抑菌圈
琼脂培养基
现代发酵技术
其他鉴定—毒性试验
自然界天然微生物可能产生毒素
据规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲
霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作 为与食品工业有关的菌种，均需通过两年以上的毒性试验。
现代发酵技术
2、诱变育种
从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
现代发酵技术
二、菌种选育的主要目的
提高产量
改进质量
增加新品种 改善工艺条件
现代发酵技术
实
例
工业生产菌
不再分泌黄色色素
原始产生菌 青霉素产生菌产黄色色素
土霉素产生菌产大量泡沫
泡沫减少
红霉素产生菌不耐噬菌体
2、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单
遗传性能相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性低
生产特性要符合工艺要求
现代发酵技术
3、理想的生产菌种
生长繁殖迅速； 产量高； 易培养； 发酵周期短； 耐噬菌体； 纯种。
如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
菌种选育理论及技术
渗漏缺陷型:是遗传性障碍不完全的营养缺陷 型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全 丧失，能少量地合成某一代谢产物。
(2)筛选结构类似物抗性突变株
结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终 产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物 （终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物 质
（二）DNA损伤修复
光修复作用（光复活作用） 切补修复
四种酶的作用：核酸内切酶 、核酸外 切酶 、DNA多聚 酶 、DNA连接酶
重组修复 SOS修复系统 DNA聚合酶的矫正作用
（三）前突变到突变的过程
校正差错：光复活作用、切补修复和DNA多聚酶校正
作用
引起差错：重组修复和SOS修复系统 一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由
抵抗不良培养条件 简化生产工艺条件，缩短生产周期
适应新的原材料 提高产量
青霉素生产菌种的选育
Hale Waihona Puke 目前工业发酵水平经诱变
85000 U／ml
1943年，发霉的甜瓜
WisQ176，900 U／ml
产黄青霉，20 U／ml 1928年，Fleming
点青霉，2 U／ml
菌种选育的基本方法
根据菌种自然变异而进行的自然选育。 用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种，再按
第二章 菌种选育理论与技术
微生物工业化发酵生产中，决定生产水平高低的主要有
三个方面：菌种选育（strain improving）、发酵工艺 （fermentation techniques）和分离提取工艺 （separation and extraction techniques）
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
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第二章生产菌种的选育
工业化菌种的要求
❑能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物
❑有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强
❑遗传性能要相对稳定
❑不易感染它种微生物或噬菌体
❑产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）
❑生产特性要符合工艺要求
生产菌种的育种方法
第一节工业微生物的分离筛选 (Separation and screening)
一、菌种的来源
❝根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；❝从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤
从自然界中分离筛选菌种的目的是高效地获取一株高产目的产物的微生物。
具体步骤如下：
1.采样：有针对性地采集样；
2.富集培养：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能；
3.纯种分离：纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落；
4.菌落的选择：利用筛选模型，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株；
5.生产性能测定：测定代谢产物或其它目的性状。
采样
1、采样对象
以采集土壤为主。
根据微生物营养类型。
根据微生物的生理特性。
极端环境条件下。
❝2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
❝3、采土方式：
在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛
入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件
等，以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分
批寄回，以便及时分离。
富集方法（enrichement）
物理方法：加热、膜过滤等
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连
续）后使目的微生物在种群中占优势。
纯种分离
1．稀释分离法
2．平板划线分离法
⑴涂菌：
⑵划线分离：
菌株分离（seperation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进
行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。
菌落的筛选-筛选依据
菌落的筛选方法——分初筛和复筛
❝初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。
如菌落直接涂布法
❝复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。
因此在具体方法上就有差异。
❝一般是将初筛菌株接入液体培养，当目的产物达到高峰时期，终止培养，用精确的检测手段，进行目的产物的定量测定。
❝变色圈法: 例糖苷酶抑制剂产生菌的筛选，该模型是将放线菌发酵液浸润的小圆纸片，置于能产生糖苷酶而利用淀粉的酵母琼脂平板上，培养过夜后，平板培养基中的淀粉被酵母利用，当向平板中注入碘液时，如果在纸片周围出现蓝色的显色圈，说明纸片上存在糖苷酶抑制剂，抑制了淀粉的水解，并可根据显色圈的大小判断菌株产生的该抑制剂的活性高低。
❝透明圈法:在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基浑浊,能分解底物的微生物便会在菌落周围形成透明圈。
❝例. -淀粉酶的筛选
❝将适当稀释的样品，涂布在以淀粉为碳源的培养基上，生长后可见水解圈，碘染色后水解圈更清晰可见，根据圈的大小，选择菌落。
❝抑菌圈法：抗生素的筛选。
工具菌采用抗生素敏感菌，将待筛选菌涂布于（或用纸片浸润发酵液贴于）含有工具菌的平板上，若待筛选菌能分泌抗菌物质，在菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。
❝浓度梯度法
❝产物合成能力与抗自身产物能力有关
❝有毒物质的降解能力与抗此毒物能力有关
❝
❝第二节工业微生物的诱变育种
❝
❝
❝自然选育在工业生产上的意义
❝自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。
❝纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量
（一）诱变育种的一般步骤
出发菌株
同步培养
使菌细胞处于相同或接近的生理状态，一般为对数生长期单细胞（或单孢子）菌悬液的制备
酵母或霉菌孢子106 /ml
细菌108 /ml
诱变剂的选择及其剂量的确定
以致死率为90％～99％为宜
诱变处理
①物理诱变剂
②化学诱变剂
（二）、筛选的方法
代谢控制育种
❝目的代谢产物大量累积
人为打破自动调节，改变代谢流向
减少或切断支路产物的形成
提高细胞膜的通透性
❝减少育种的盲目性
初级代谢产物生产，成效显著
次生代谢产物生产，效果不明显
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
营养缺陷型突变体：auxotroph
野生型菌株失去合成某种生长及代谢所需物质（生长因子）的能力，只有在基本
培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长的突变株。
营养缺陷型可以使发生障碍的前一步的中间代谢产物大量积累。
营养缺陷型在生物合成中发生障碍，合成反应不能完成，可通限量过外加缺陷
的营养物，克服生长障碍，使终产物不致于积累到引起反馈调节的浓度,解除了终
产物反馈阻抑，而有利于中间产物或另一途径终产物的积累。
1 筛选用培养基
⑴基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，
称为基本培养基；常以‘[-]’表示；MM
⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质
如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培
养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；CM
⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相
应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成
分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。
SM
2．营养缺陷型菌株筛选的一般方法
（1）诱变剂处理
（2）淘汰野生型菌株
①抗生素法
②菌丝过滤法
（3）检出营养缺陷型
（4）鉴定营养缺陷型
淘汰野生型
❝抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。
由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。
一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。
❝菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。
检出缺陷型
❝原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。
❝具体方法：影印法、点种法、夹层法、限量补充培养法
代谢调节控制育种例2
❝抗牲突变株的选育
❝芽孢杆菌属的许多种类是重要的酶制剂生产菌。
根据有关学者观察和动力学分析，产酶高峰和芽孢的形成有一定的关系。
一般培养到一定阶段后就会产生芽孢，芽孢数量达到高峰，就停止产酶．故如能延迟或不产生芽孢，酶的产量便可提高。
如蜡状芽孢杆菌产淀粉酶菌株，菌种选育时发现在抗利福平的突变型中往往有较多的无孢子突变株，把该菌用诱变剂处理，涂布在含利福平的干板培养基上，长出的菌落薄而透明（无芽孢突变型的特怔），镜捡或使用产生芽孢的培养基进行验证，结果得到的是无芽孢突变型。
淀粉酶产量以7倍高于亲株。
这也是一个药物抗性突变型应用的实例。
❝是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，则可获得目的基因产物或表现出有益性状。
基因工程(gene engineering) 常和以下名称混用:
⏹遗传工程(genetic engineering);
⏹基因克隆(gene cloning);
⏹分子克隆(molecular cloning);
⏹基因操作(gene manipulation);
⏹重组DNA技术(recombination DNA technique)
载体(vector) DNA
用于传递运载外源DNA序列进入宿主细胞的DNA分子功能：
为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。
为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。
为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。
理想载体的基本条件：
可转移性
合适的复制位点
多克隆位点：广泛、特异
选择标志，便于筛选和鉴定
分子较小，可容纳较大的外源DNA
载体的种类
质粒(plasmid)
噬菌体(phagemids):λ噬菌体、M13噬菌体
穿梭质粒(Shuttle vector)
柯斯质粒(Cosmid vector)
限制性内切酶(restriction endonuclease)是存在于微生物细胞内用于分解外源DNA的一种酶。
本章小节：。