崂山茶树病害种类调查与生防菌的筛选研究

崂山茶树病害种类调查与生防菌的筛选研究
摘要对崂山茶树病害种类进行了调查，同时以茶云纹叶枯病为靶标菌进行生防菌的筛选研究。

调查结果表明，崂山茶场的主要病害为茶云纹叶枯病、茶赤叶病和茶轮纹病；从茶树上分离得到5种生防菌，对茶云纹叶枯病菌均有一定的抑制作用，初步鉴定为芽孢杆菌（bacillus spp.），为茶园病害的防治提供了新途径。

关键词茶树；病害种类；调查；拮抗细菌；筛选
中图分类号 s435.711 文献标识码a文章编号 1007-5739（2009）03-0112-02
茶叶是人们喜欢的健康饮料，具有清心明目、生津止渴的功效，是世界三大饮料（可可、咖啡、茶叶）之一。

中国茶叶种植面积居世界第一，产量居世界第二，品质第三，创汇第四。

造成这种状况有多种因素，农药的不合理使用是农药残留超标的主要原因。

而农药残留是当前茶叶出口创汇最大的卫生质量问题[1]。

要解决茶叶中农药残留问题，根本措施是合理使用化学农药防治茶园病虫害，研制高效、无公害农药。

而科学使用农药的前提是了解当地茶园的病虫害的发生情况。

崂山绿茶产区地处崂山山脉，具有独特的地域特点，纬度高，受海洋气候影响较大，形成崂山绿茶特有的品质，味浓、香高和耐冲泡等显著特点，深受消费者的欢迎[2，3]。

同时崂山的气候特点，也决定了茶园病害的发生特点。

笔者对崂山茶树病害种类进行调查，旨在摸清本地茶树病害的种类，以期为茶园病害综合治理提供科学依据。

1材料与方法
1.1茶园病害种类调查
在茶树生长季节，采取随机调查的方法，在茶园采集病害标本，并记录病害危害部位及发生程度，参考相关文献进行茶树病害种类鉴定[4，5]。

1.2茶树主要病害病原菌的分离与鉴定
根据病害症状，采集病叶，按常规方法分离病原菌，即在病叶的病健交界处取2~3mm组织块，每病斑3~5块置于培养皿中用70%的酒精消毒30~60s，然后用无菌水洗净3~4次。

经无菌吸水纸吸去多余水分，置于pda上25℃培养，2d后检查分离情况，并进一步纯化。

依据培养性状、形态观察和致病性确定病原菌，斜面保存备用[6]。

1.3拮抗菌的分离与纯化
采集不同品种（龙井、福安和福鼎）茶树的根、茎、叶等组织切碎，称量10g放到盛有90ml无菌水的三角瓶中，振荡30min后，再依次稀释为10-2、10-3、10-4等3个浓度梯度，每个浓度重复3次。

在na上培养48h后观察，挑取不同形态、色泽、大小的菌落在na培养基上纯化培养后转到斜面培养基上保存，备用。

1.4拮抗菌的筛选与初步鉴定
将纯化后的细菌分离物在na平板上28℃培养24h，用双向平板对峙法筛选对茶树云纹叶枯病菌有拮抗作用的细菌。

在pda平板的四周接上细菌分离物，平板中央接种培养48h，茶树云纹叶枯病菌
菌丝块直径为4mm，每处理重复4次，28℃培养3~5d，观察抑菌圈的产生情况，并对有抑制作用的细菌测量抑菌带的宽度、病原菌的菌落直径，计算拮抗菌的抑制率。

抑菌作用的大小以抑菌带和抑制率表示[7]。

抑菌带是指在对峙生长中生防菌和靶标病原真菌之间形成的一
种透明带。

抑菌率（%）＝[（对照的病原菌落半径-对峙培养中病原菌菌落半径）/对照的病原菌落半径]×100
拮抗细菌的鉴定通过革兰氏染色以及菌体的形态进行，以枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）为阳性菌，大肠杆菌（escherichia coli）为阴性菌，具体参考沈萍等[8]运用的方法。

2结果与分析
2.1崂山茶园病害种类调查结果
2006~2007年对不同田块茶园分别进行茶树病害的系统调查，结果见表1。

通过调查发现，有9种病害在崂山地区发生，其中茶云纹叶枯病为崂山茶园的主要病害，茶炭疽病、茶赤叶斑病为次要病害。

叶部病害发生普遍，根部发生较少。

2.2茶云纹叶枯病的分离与鉴定
从茶云纹叶枯病的病叶上分离获得的分离物，通过在显微镜下观察病原菌的菌丝和孢子以确定茶云纹叶枯病菌，采用孢子悬浮液回接到茶树叶片上，保湿48h，10~15d后，对发病的叶片再一次进行
病菌的分离。

通过分离纯化以及致病性测定确定分离物即为茶树云纹叶枯病菌。

茶云纹叶枯病主要危害叶片，以成叶为主，病斑初为黄色水浸状，后期颜色加深，有波浪形波纹，病斑中央为灰白色，上生小黑点，沿轮纹排列，病斑多在叶尖或叶缘发生。

病斑上的小黑点为分生孢子盘，分生孢子为单胞。

2.3拮抗细菌的筛选与鉴定
从茶树根际土壤和茎叶等健康组织中分离得到细菌131株。

以茶云纹叶枯病菌为靶标菌一共筛选出了5种抑制率大于50%的拮抗细菌，编号分别是l1、l2、l3、la和lb。

其中，以la的抑制效果最佳，抑菌带宽度和抑菌率分别达到0.72cm和77.3%。

其他4株拮抗菌对茶云纹叶枯病菌也有一定的效果，其抑制率分别为71.2%、54.8%、52.0%和65.5%（见表2）。

对5株拮抗菌进行了培养性状和形态鉴定，la、lb、l1、l3等4个菌株的菌落是凸起的，而l2的菌落是平展的；在5株拮抗菌中仅有lb产生红色色素，其余4个菌株不产生色素。

5株拮抗菌细胞均为长杆状且产生芽孢，通过革兰氏染色均为是革兰氏阳性菌
（g+）。

初步鉴定认为，这5株拮抗菌为芽孢杆菌（bacillus spp.）。

3结论与讨论
茶树病害在我国各地均有不同程度地发生和危害，对茶叶的产量和品质有一定影响。

据不完全统计，全世界已有记载的茶树病害达
380多种，常见的约有30多种。

通过对崂山茶场的茶树病害的系统调查，摸清了崂山茶场的主要病害为茶树云纹叶枯病，同时茶炭疽病和茶赤叶斑病也有一定程度发生。

茶树叶部病害发生较为普遍，根部和枝部病害发生较少，这和冯明祥等[8]的报道一致。

在调查中还发现不同茶树品种对不同病害抗性不同，可以种植抗性品种进行病害的防治。

这些结论为进一步制定崂山茶园病害的综合防治措施提供了依据。

茶叶无公害生产，关键性技术是要解决好病虫害防治与农药残留的矛盾，以期获得优质和高产的茶叶。

绿色农药的研究与开发是解决农药残留问题的根本措施之一，所以研究和利用拮抗菌来防治茶树病害有着良好的应用前景[9]。

本研究从茶树的根际和叶围分离获得了5株芽孢杆菌，对茶树云纹叶枯病菌具有较好的抑制作用，具有作为生防菌的潜能。

这些菌株的作用机理、活性物质等还有待进一步研究。

4参考文献
[1] 陈宗懋.解读世界各国制订的茶叶中农药最大残留限量（mrl）标准及其应对措施[j].中国植保导刊，2007，27（9）：30-33.
[2] 汪东风，杜德红，江晓红，等.崂山绿茶微生物污染情况及控制关键技术[j].茶叶，2004，30（1）：40-42.
[3] 胡维军，侯君合，刘学才，等.崂山绿茶不同产区茶园土壤与灌溉水安全质量分析[j].山东农业科学，2007（2）：83-85. [4] 陈雪芬.茶树病虫害防治[m].北京：金盾出版社，1996.
[5] 陈宗懋，陈雪芬.茶树病害的诊断和防治[m].上海：上海科学技术出版社，1990.
[6] 方中达.植病研究方法[m].北京：中国农业出版社，1998.
[7] 罗兰，袁忠林，陈茎.小麦全蚀病菌拮抗细菌的筛选及鉴定[j].莱阳农学院学报，2006，23（3）：205-207.
[8] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第3版）[m].北京：高等教育出版社，1996.
[9] 冯明祥，王佩圣，姜瑞德.崂山茶区茶树病虫害记述[j].中国茶叶，2002，24（2）：14-15.
[10] 卢东升，吴小芹.茶园有益微生物及其微生态效应研究进展[j].信阳师范学院学报（自然科学版），2005，18（1）：117-121.。