细胞的原代培养
细胞的原代培养(Cell primary culture)
m: 稀释倍数
实验报告
1.简述体外培养细胞的形态特征。
2.淋巴细胞分离液的作用？ 3.细胞培养获得成功的关键要素是什么？ 4.实验结果：培养后淋巴细胞增加的数量、
提高百分率。
Thanks !
实验试剂：
（1）RPMI 1640 培养液 （2） 小牛血清 （3）肝素钠（180 IU／ml） （4） 青、链霉素 （5） PHA（2 mg/ml） （6） Hank’s液
（7） 5％NaHCO3
（9） 2％碘酒棉球
（8） 1N 盐酸
（10） 75％酒精棉球
（11） 1%台盼蓝
实验步骤
（1） 配培养液：
实验步骤
（7） 结果：培养3天后观察结果。
细胞计数：淋巴细胞增殖情况。
注意事项
1. 过滤消毒
2. 淋巴细胞的分离
3. 洗涤：Hank’s 液、RPMI 1640培养液4 ml
各洗涤一次。
4. 计数：浓度3-5×105个/ml，1 ml /10 ml瓶。
5.培养
原细胞悬液细胞数/ml=n/4×10 000×m n: 4大格中的细胞总数
RPMI 1640基础培养液 80％
小牛血清
肝素（180 IU／ml） PHA（2 mg/ ml） 青、链霉素
20％
3.6 IU/ml 40 g/ml 100 IU/ml 100 g/ml
调pH至6.8－7.2，0.22 m滤膜过滤除菌。
实验步骤
（2）采血：肝素抗凝，静脉采血。 （3）分离淋巴细胞 （4）洗涤淋巴细胞 （5）细胞计数、细胞活力检查 （6）稀释培养
跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳
定，有时难以和其他细胞相区别。
4、多型细胞型：
细胞原代培养实验具体步骤及方法
细胞原代培养实验具体步骤及方法将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。
但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
一、实验材料准备1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至1 000 ml。
Hank's液可以高压灭菌。
4℃下保存。
二、具体操作1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2. 用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。
8. 加入Hank's液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5x105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
注意1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法是指将从活体组织中分离出的未经连续传代或只进行过有限传代的原代细胞，在无菌条件下进行体外培养的技术。
以下是一般的原代细胞培养方法：
1. 组织分离：从生物体中取得需要培养的组织，如肺、肾等。
将组织切碎或用酶消化等方法进行细胞的分离。
2. 细胞悬浮液制备：将分离得到的细胞以适当的培养基和缓冲液混合，形成细胞悬浮液。
3. 培养基准备：根据细胞类型的不同，选择适当的培养基，并添加必要的营养物质、生长因子和抗生素等。
4. 培养皿涂层：将培养皿表面涂覆一层适当的基质，如胶原、明胶等，以促进细胞附着生长。
5. 细胞接种：将细胞悬浮液均匀地加入培养皿中，使细胞附着在培养皿表面。
6. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，控制适当的温度、湿度和气体组成等条件，提供细胞正常生长所需的环境。
7. 培养液更换：定期更换培养液，补充必要的营养物质和生长因子，以保持细胞的生长和增殖。
8. 细胞观察和记录：定期观察和记录细胞的形态、增殖情况和细胞数量等，评估细胞的健康状态。
需要注意的是，不同类型的细胞可能有特定的培养要求，如培养
基成分、pH值、气体组成、温度和湿度等。
因此，在进行原代细胞培养时，应根据具体的细胞类型和研究目的，选择合适的培养条件和方法。
实验报告-细胞原代培养实验
细胞生物学实验报告实验三细胞原代培养1引言1.1 实验目的1. 理解细胞原代培养原理。
2. 了解细胞原代培养的应用。
3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。
4. 巩固无菌操作技术。
1.2 实验原理细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚2.4 实验步骤A.鸡胚成纤维细胞的原代培养1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。
2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。
3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。
4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。
5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。
将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋壳。
6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。
7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。
8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。
9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。
10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组织块接种到培养瓶内。
在培养瓶中放置10-15个组织块。
11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。
动物细胞原代培养名词解释
动物细胞原代培养名词解释1.引言1.1 概述动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，被广泛应用于生物学研究领域。
通过原代培养，科研人员可以将动物体内的细胞从组织或器官中分离出来，并在适当的培养条件下培养和繁殖这些细胞。
这种培养方法能够维持细胞的生长和功能，使其能够在体外环境下长期存活。
原代培养的过程可以分为两个主要阶段：细胞分离和细胞培养。
首先，需要将动物组织或器官进行机械或酶解分离，以获得单个的细胞悬浮液。
然后，将这些分离的细胞种植在含有适当培养基和营养物质的培养皿中，提供合适的温度、湿度和氧气条件，使细胞得以生长和分裂。
通过原代培养，科研人员可以获得大量的动物细胞来进行各种实验和研究。
这些细胞可以用于研究细胞的生理功能、细胞周期、细胞信号传导以及疾病模型的建立等。
此外，通过原代培养还可以进行细胞遗传学研究、药物筛选和细胞工程等领域的实验。
总而言之，动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，可以为科研人员提供源源不断的动物细胞来进行各种研究。
它为细胞生物学、医学研究以及药物开发等领域的进展提供了坚实的基础，并在解决许多科学问题中扮演着重要的角色。
文章结构指的是文章的组织框架和布局。
它的作用在于使读者能够清晰地理解整篇文章的内容和结构，从而更好地把握文章的主旨和论证思路。
本文按照以下结构进行组织和呈现：1. 引言1.1 概述在这一部分，将对动物细胞原代培养的基本概念和背景进行简要介绍，引起读者的兴趣，并提出研究的意义。
1.2 文章结构（即本节内容）在这一部分，将对整篇文章的结构进行概述，介绍各个章节的内容以及它们在整篇文章中的作用。
1.3 目的在这一部分，明确研究动物细胞原代培养的目的，说明研究的意义和价值，为读者提供清晰的导向。
2. 正文2.1 原代培养详细介绍什么是原代培养，原代培养的步骤和方法，以及原代培养在细胞研究中的重要性和应用领域。
2.2 动物细胞介绍动物细胞的结构和特点，包括细胞膜、细胞质、细胞核等重要组成部分，以及动物细胞在生物学研究和医学领域中的应用。
原代细胞培养实验报告
原代细胞培养实验报告实验名称：原代细胞培养实验实验目的：1.掌握原代细胞培养的基本技术和方法；2.观察和记录原代细胞在体外培养过程中的生长和变化；3.学习和探究细胞培养对细胞形态、功能和特性的影响。
实验材料和方法：1.实验材料：原代细胞，培养基，培养皿，培养瓶，培养箱等；2.实验方法：a.准备工作：消毒实验区域，准备适宜的培养条件；b.培养器皿预处理：将培养皿和培养瓶加热至高温，使其表面杀菌；c.细胞移植：用适量的培养基将原代细胞移植至培养皿或培养瓶中；d.细胞培养：将细胞培养在恒温恒湿的培养箱中，定期观察和记录细胞的生长情况；e.细胞传代：当细胞达到一定密度时，用消化液将细胞从原培养皿中剥离，并转移到新的培养皿中，促进细胞的继续生长和繁殖。
实验结果与分析：在进行原代细胞培养实验的过程中，我们发现原代细胞在培养基中可以维持一定的形态和生物活性。
经过一段时间的培养，细胞开始出现贴壁生长，并形成单层密集的细胞群。
这时，细胞的数量明显增加，可见其细胞分裂和增殖的效果。
细胞形态也逐渐变得规整，细胞质较为丰满，细胞核染色质着色精细。
随着培养的时间推移，细胞的代谢活动逐渐增强，细胞数量持续增加。
细胞形态和功能逐渐分化，并出现特定的细胞类型，如心肌细胞、肝细胞等。
这表明原代细胞在体外培养的过程中，依然能够保持其特定的细胞类型和功能特性。
然而，我们也发现在长时间的培养过程中，细胞的生长速度逐渐放缓，甚至停滞。
细胞形态也开始出现变异和退化，如细胞形状异常、质量变差等。
这可能是由于细胞的老化和突变导致，同时也与培养条件和传代的次数有关。
结论：通过本次实验，我们成功地进行了原代细胞的培养，并观察到了细胞在体外培养过程中的生长和变化。
我们发现原代细胞能够在适宜的培养条件下，维持其形态和功能的稳定性，并且能够分化成特定的细胞类型。
然而，在长时间的培养过程中，细胞的生长速度逐渐放缓，而细胞的形态也逐渐出现变异和退化。
因此，在进行原代细胞培养时，需要合理控制培养条件和适时进行细胞传代，以保持细胞的生长和特性。
原代细胞培养的名词解释
原代细胞培养的名词解释在细胞生物学领域里，原代细胞培养是一种常见的实验技术。
它是通过从一个生物体内分离和培养细胞，使其在体外继续生长和繁殖的过程。
通过原代细胞培养，我们可以研究细胞的生理特性、功能和互作，有助于我们深入了解生物体内组织和器官的基本构成和功能，以及与疾病相关的异常细胞行为。
一、原代细胞的选择和分离方法要进行原代细胞培养，第一步是选择适合的原代细胞。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的初代细胞，与体内的细胞相似，具有原始的细胞特性。
常用的原代细胞包括人类和动物的肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞等。
原代细胞的分离通常通过组织分块法或酶处理法进行。
组织分块法是将组织样本切割成小块，然后用细胞培养基将其浸泡，通过适当的培养条件，细胞会从组织中游离出来并生长扩增。
酶处理法则是使用特定的酶来消化组织，使细胞从基质中分离出来。
二、原代细胞培养的技术和条件原代细胞的培养需要提供适合其生长和繁殖的环境。
培养基是最基本的条件，通常包括营养物质、生长因子、补体和抗生素等。
细胞培养基中的成分要根据细胞类型的不同而调整，以满足其特定的营养需求。
细胞培养的环境因素也很重要。
温度、湿度和气体组成是常见的调节参数。
温度需要恒定在37摄氏度左右，以模拟体内的正常生理条件。
湿度的控制可以减少蒸发和细胞表面的沉积。
气体组成通常是5％二氧化碳和95％空气，以稳定酸碱平衡。
在原代细胞培养中，还需要注意细胞的传代。
传代是指将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿中，以保证细胞的生长和更新。
传代时要遵循适当的规程和技术，以确保细胞的稳定和增殖。
三、原代细胞培养的应用原代细胞培养在细胞生物学研究中具有广泛的应用。
通过原代细胞培养，我们可以研究细胞的分化、增殖、凋亡和信号传导等基本生理过程。
这对于揭示细胞发育和组织构建的机制非常重要。
此外，原代细胞培养还可以用于研究疾病的发生机制和治疗方法。
通过比较病变组织和正常组织的原代细胞，我们可以发现细胞中的异常变化，从而揭示疾病的发生和发展规律。
原代细胞培养技术的发展及其应用
原代细胞培养技术的发展及其应用原代细胞是一类在体内或体外原始组织中分离出来的、未经处理的细胞。
它们具有许多特性，如自我更新、多向分化能力等。
因此，原代细胞很重要，可以用于研究发育生物学、细胞生物学等。
而原代细胞培养技术是指将原代细胞分离并将其在无血清（serum-free）的条件下培养并增殖。
本文将对原代细胞培养技术的发展及其应用进行探讨。
一、原代细胞培养技术的发展原代细胞培养技术最早是在二十世纪五十年代产生的。
当时的液体培养基中添加着牛胎血清作为营养源。
但是，牛胎血清中含有数千种成分，其中包括了生长因子、细胞因子、激素等。
这些成分可能会影响到原代细胞的分化和增殖，从而对研究结果产生负面影响。
因此，无血清培养基应运而生。
无血清培养基不仅可以避免血清中的干扰因素，还可以节省成本并提高可重复性和可比性。
目前，无血清培养基的种类越来越多，并在细胞培养领域中得到了广泛的应用。
二、原代细胞培养技术的应用应用原代细胞培养技术，可以研究许多生物学问题。
例如，原代细胞培养技术可以用于：1. 研究细胞增殖和分化的分子机制原代细胞在培养基中具有保持其体内发育状态的能力，因此可以用来研究细胞增殖和分化的分子机制。
特别是，在无血清培养基中培养原代细胞，可以清除牛血清中可能干扰实验结果的成分。
2. 临床应用原代细胞可以用于組織工程学和干细胞治療的研究。
例如，科学家们可以用培养原代细胞的方法来制作新的人体器官，以更好地理解和治疗器官移植过程中的问题。
另外，原代细胞培养技术也可以用于生产一些医用生物制品，如蛋白质、疫苗等。
3. 药物筛选原代细胞更好地代表了体内的细胞状态和作用。
因此，原代细胞培养技术被广泛地用于药物相互作用的研究。
例如，将原代细胞培养于带有小分子阻滞剂的培养基中，可以用于筛选约束肿瘤药物，从而提高药物筛选的效率和准确性。
三、问题及未来的展望然而，原代细胞培养技术也存在着一些问题。
例如，由于培养基存在着个体差异，因此选取适合自己研究对象的原代细胞比较困难。
细胞原代培养PPT课件
3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
原代细胞培养
机械分离
消化分离
体外培养细胞的纯化
原代细胞培养往往含有的细胞种类较多，多是实验需要纯化的细胞进行建系。而细浮细胞纯化和贴壁细胞纯化。
悬浮细胞的纯化
密度梯度离心的方法是悬浮细胞纯化的常用方法，其基本原理是细胞密度不同，大小不同，离心式的沉降速率也就不同。在离心过程中沉降速率不同的细胞，可在不同的密度梯度界面上停留，使各类细胞相互分开。此外，还可根据细胞表面抗原种类的不同分离细胞。该技术要事先制备只对目的细胞的特异性抗体，让后将抗体纯化和固化，当要分离的细胞与固化抗体接触时便可将其捕捉，从而达到分离纯化的目的。目前许多市售的免疫细胞分离柱，如依据CD4和CD8表面抗原的细胞分离柱、B细胞分离柱、T细胞分离柱、巨噬细胞分离柱等。
组织块原代培养：
组织块培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织。组织块培养操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动收到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养可按下列程序操作：
1.组织块修整：将取材得到的组织块用平衡盐溶液反复冲洗，然后置于灭菌的平皿或小瓶中用眼科剪剪碎，小块的直径一般小于1mm，剪碎的组织块京自然沉降富集备用。
依据贴壁速度的细胞纯化
原代细胞培养初期或细胞传代时均可依据细胞贴壁速度来分离不同类型的细胞。如原代培养的巨噬细胞群中往往含有淋巴细胞，中性粒细胞，成纤维细胞等，根据大多数巨噬细胞有极易于附着在玻璃表面的特性，先将细胞群至于玻璃培养容器中数小时，此后再用培养液或PBS冲洗去除尚未附着的其他细胞，借此可得到较纯的巨噬细胞。
离散细胞原代培养
动物细胞在体内有严密的组织结构，群体细胞之间以固有的分化方式相互联系，相互依存。离体之后仍保持原有的组织结构特性，多数组织的形态是固体结构，细胞与细胞或细胞与细胞间质之间联系紧密，要得到大量的离散细胞，必须采取必要的措施进行人工分离（消化培养）。部分组织的细胞自然状态下士松散的，从体内取出后不经处理（如血细胞）或稍加处理（如脾细胞）就可制成细胞悬液。细胞离散后，由于每个细胞都能与赖于生长的支持物接触，营养供应均匀，因而具有适应快、增殖快、建系快等优点。
原代细胞培养
大，而且细胞分散效果差。
（二）消化分离法
• 组织消化法是把组织剪切成小块，应用酶的生 化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥 连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状， 再结合机械法（用吸管吹打分散或电磁搅拌） 使细胞团块得以较充分的分散，制成细胞悬液。
1、酶消化分离法
• 常采用胰蛋白酶和胶原酶 （1）胰蛋白酶 • 胰酶是一种胰脏制品，使细胞间质中的蛋白质水解而
使细胞分散。 • 影响胰酶消化细胞能力的因素： • ①细胞类型 • 适于消化细胞间质较少的软组织（肝、肾、胚胎组织、
上皮组织）。 • 对含结缔组织较丰富的组织单用无效（如 乳腺、滑
膜、子宫、肿瘤组织），需与胶原酶合用。 • ②酶的活力：新鲜配制，低温保存
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC) 即外周血中具有单个核的细胞， 包括淋巴细胞和单核细胞
TA）于37℃中作用适当时间 • （4）弃去消化液 倾斜自然沉降或低速离心法 • （5）漂洗 将含有血清、钙、镁的培养基沿瓶
壁缓缓加入，中止消化反应，漂洗2-3次后， 加入完全培养基。 • （6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细 胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、 镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
二、实体组织材料的分离方法
• 实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细 胞充分分散，形成细胞悬液，可采用：
• （一）机械分散法 • （二）消化分离法
（一）机械分散法
• 适用组织：纤维成分少的软组织。如脑组织，部 分胚胎组织
细胞原代培养
细胞
一细胞培养
（一）原代培养
○1胰蛋白酶消化法
1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下
3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块过细胞筛，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟
4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀
5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基
7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养
○2组织块法
1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距
3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基
仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱
试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
动物细胞原代培养流程
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原代培养_实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉细胞培养所需的设备和试剂。
3. 了解细胞培养过程中可能遇到的问题及解决方法。
二、实验原理原代培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理条件，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上具有相似性，适用于研究细胞生长、代谢、分化等生物学特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠、大鼠等。
2. 组织：肝脏、脾脏、皮肤等。
3. 试剂：胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清、DMEM培养基等。
4. 设备：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机等。
四、实验步骤1. 组织块制备（1）取动物组织，用生理盐水清洗，去除血污。
（2）将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。
（3）将组织块置于含有胰蛋白酶的消毒培养皿中，37℃水浴消化15-20分钟。
（4）加入适量胎牛血清终止消化，用吸管吹打组织块，使其分散成单个细胞。
2. 细胞接种（1）将分散后的细胞悬液移至含有DMEM培养基的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。
（2）观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。
3. 细胞传代（1）待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞。
（2）收集消化后的细胞，加入胎牛血清终止消化。
（3）将细胞悬液接种至新的培养瓶中，继续培养。
4. 细胞观察（1）使用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。
（2）对细胞进行染色，如台盼蓝染色、Giemsa染色等，观察细胞核、细胞器等结构。
五、实验结果1. 原代细胞在培养过程中呈现典型的贴壁生长，细胞形态为多边形、梭形等。
2. 细胞生长速度较快，2-3天即可达到80%的融合度。
3. 细胞传代过程中，细胞生长状态良好，无明显形态变化。
六、实验讨论1. 原代细胞培养过程中，无菌操作至关重要。
应确保所有操作均在超净工作台内进行，避免污染。
2. 培养基的配制和质量直接影响细胞生长。
应严格按照试剂说明书配制培养基，并确保其质量。
实验二_原代细胞培养
三、细胞培养的条件要求 1）细胞密度 原代细胞：4-6×105个/ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱl 传代细胞：2-3×105个/ml 2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.67.8 3）培养温度
四、操作步骤
1. 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和 酒精消毒气室部。
10.轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每 瓶约0.2-0.5ml，补加DMEM生长液至 10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上 盖子，置于37℃恒温箱中培养。
11.细胞计数方法 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸
（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min， 充分振荡后进行计数。
2. 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜， 穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚 放于灭菌平皿中。
3. 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用 无血清的DMEM冲冼2次。
4. 将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳 糜状。
5. 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml无血 清 DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗 液。如此重复1次。
实验二 原代细胞培养
（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形
态，掌握鸡胚成纤维细胞
的制备与培养方法。
A
B
A 上皮细胞 B 成纤维细胞
二、材料 1. 9-12日龄鸡胚 2. 照蛋灯与蛋座 3. 碘酊棉球与酒精棉球 4. 大剪子、眼科剪、小镊子 5. 平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6. 0.25%胰酶 7. 基础培养液：DMEM
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数 （N）。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。
面做好标志，注明细胞、组别及日期。
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细胞原代培养
【实验目的】
1.理解细胞原代培养原理
2.熟悉细胞原代培养方法与过程
3.了解细胞原代培养的应用
4.独立进行细胞原代培养操作
【实验原理】
1、原代培养实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：
a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大
小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块
贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的
0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用
几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上
清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】
1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱
2.材料：孕鼠
3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u
／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％
酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】
(一)小鼠胚胎的准备:
1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
2.无菌条件下暴露子宫。
3.用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。
4.取出整个子宫，置于盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。
用PBS 洗涤3次，弃除表面残余血迹。
5.沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。
充分洗涤，清洗表面。
6.用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜。
用PBS洗涤3次。
7.去除胚胎头部、内脏和四肢。
将躯干部置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM 培养液的培养皿内。
用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞。
(二)小鼠胚胎成纤维细胞的培养：
1.用无菌眼科小剪刀或剃须刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。
2.室温下静置1min。
弃上层液，留下胚胎组织碎块。
3.添加胎牛血清接种到培养瓶内。
每5-30个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。
静置5min后，倒置加入适量培养液，并倒置在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。
4.2-3小时后,将培养瓶翻转过来，使培养液覆盖植块。
继续在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。
5.培养开始的前两天不要晃动培养瓶。
第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出细胞。
补充培养液，继续培养，每天倒置在显微镜下观察。
过4天后在倒置显微镜下观察拍片。
【实验结果】
图二小鼠胚胎成纤维细胞原代培养
【结果分析】
从照片来看，细胞原代培养较成功，大部分细胞活性较好，呈梭形附着与瓶壁上，密度适中，死细胞较少。
可继续进行后续传代培养。
【注意事项】
1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。
2.要注意无菌操作。
其要求应高于外科手术。
3.运用消化法时胰酶温度应小于370C，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。
因为此过程不像消化培养细胞时的1—10分钟，而是至少20分钟，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中可存活10分钟以上。
如果胰酶作用过强，则这些细胞膜易被损伤而不易生存。
4.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。
翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。
如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。
【思考题】
一、如何提高原代细胞培养的成功率？
答：
1.在选择材料的时候一定要注意选取比较健康的小鼠。
在处理胚胎的时候要干
净利落。
不要把胳膊等部位的细胞混进去了。
2.操作一定要无菌，不能污染。
在剪碎细胞的时候，一定要注意尽量剪得碎一
点。
3..运用消化法时胰酶温度应小于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半
4.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接
触。
翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。
5.取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，
尽可能减少对细胞的机械损伤。
二、为克服微生物污染应采取那些措施？
答：
超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用洗涤液拭擦双手消毒。
用75%酒精擦双手、移液器消毒。
枪头要灭过菌才可用。
滴管以及试管等要过酒精灯火焰。
枪头伸进容器内后最好更换之后再取别的液体。
要注意更换剪刀，培养皿等实验工具。
不能够交叉污染。
再者，不能够在实验的时候将手从实验台中拿出，随意的摸其它东西。