常见的生化与分子生物学技术大串讲
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生化(2)复习串讲(完整全)生物化学
酶催化的补充柠檬酸循环中间代谢物的供给的反应，例如由丙酮酸羧化生成草酰乙酸 的反应。 Cori循环
肌收缩（尤其是氧供应不足时）通过糖酵解产生乳酸，因为肌肉内糖异生活性低，所 以乳酸通过细胞膜弥散进入血液后，再入肝，在肝内异生为葡萄糖，葡萄糖入血后又可被 肌肉摄取，这就构成了一个循环，也称为乳酸循环。
3、 F-6-P磷酸化，生成1，6-二磷酸果糖（F-1，6-2P）
磷酸果糖激酶 是关键反应步骤，决定酵解速度，是一个限速 酶，该步反应再消耗一分子ATP★
4、 F-1，6-2P裂解成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮（DHAP）
醛缩酶 产生二个三碳糖，即一个醛糖和一个酮糖#
5、 磷酸三碳糖的异构化
磷酸丙糖异构酶
一、糖代谢
糖酵解（glycolysis）： 一个由10步酶促反应组成的糖分解代谢途径，通过该途径，一分子葡萄糖转换为两分
子丙酮酸，同时净生成两分子ATP和两分子NADH. 巴斯德效应（Pasteur effect）：
氧一存在、下糖，酵代解谢速度的放概慢的述现象。
底物水平磷酸化（substrate phosphorylation）： ADP或某些其它的核苷-5ˊ-二磷酸的磷酸化是通过来自一个非核苷酸底物的磷酰基的
丙酮酸羧化支路
PEP
CO2 GDP
GTP
Pyruvate
acetyl-CoA
CO2 + ATP
ADP + Pi
oxaloacetate
NADH+H+
NAD+
malate
Citrate
NADPH
Pyruvate
HMP途径
以6-P-G为起始物，经过两个阶段共8步反应，最后重新生成6-P-G的 过程。 HMP要循环一轮，必须有6个6-P-G同时进入循环，但最终只有 1个6-P-G被彻底分解为6CO2＋12（NADPH＋H＋）＋Pi。
肌收缩（尤其是氧供应不足时）通过糖酵解产生乳酸，因为肌肉内糖异生活性低，所 以乳酸通过细胞膜弥散进入血液后，再入肝，在肝内异生为葡萄糖，葡萄糖入血后又可被 肌肉摄取，这就构成了一个循环，也称为乳酸循环。
3、 F-6-P磷酸化，生成1，6-二磷酸果糖（F-1，6-2P）
磷酸果糖激酶 是关键反应步骤，决定酵解速度，是一个限速 酶，该步反应再消耗一分子ATP★
4、 F-1，6-2P裂解成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮（DHAP）
醛缩酶 产生二个三碳糖，即一个醛糖和一个酮糖#
5、 磷酸三碳糖的异构化
磷酸丙糖异构酶
一、糖代谢
糖酵解（glycolysis）： 一个由10步酶促反应组成的糖分解代谢途径，通过该途径，一分子葡萄糖转换为两分
子丙酮酸，同时净生成两分子ATP和两分子NADH. 巴斯德效应（Pasteur effect）：
氧一存在、下糖，酵代解谢速度的放概慢的述现象。
底物水平磷酸化（substrate phosphorylation）： ADP或某些其它的核苷-5ˊ-二磷酸的磷酸化是通过来自一个非核苷酸底物的磷酰基的
丙酮酸羧化支路
PEP
CO2 GDP
GTP
Pyruvate
acetyl-CoA
CO2 + ATP
ADP + Pi
oxaloacetate
NADH+H+
NAD+
malate
Citrate
NADPH
Pyruvate
HMP途径
以6-P-G为起始物，经过两个阶段共8步反应，最后重新生成6-P-G的 过程。 HMP要循环一轮，必须有6个6-P-G同时进入循环，但最终只有 1个6-P-G被彻底分解为6CO2＋12（NADPH＋H＋）＋Pi。
生物化学及分子生物学人卫第八版常用分子生物学技术的原理及应用公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件
第21页目录
（二）原位PCR技术
• 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片 上单个细胞内进行PCR反应，然后用特异性探 针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是 否在该组织或细胞中存在。
• 原位PCR办法填补了PCR技术和原位杂交技术 不足，是将目的基因扩增与定位相结合一个最 佳办法。
第56页目录
四、基因转移和基因剔除在医学 发展中作用
建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 •基因剔除 •取得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型
第57页目录
第八节
疾病相关基因克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
第58页目录
克隆疾病相关基因策略 • 功效克隆(functional cloning) • 定位克隆(positional cloning)
第59页目录
（一）功效克隆
定义 从对一个致病基因功效理解出发来克隆
该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表示产物较易得 到部分纯化遗传性疾病。
第60页目录
• 利用酵母系统从功效学角度鉴定致病基因。 • 用不同人DNA片段转化与人类遗传疾病含
第41页目录
一、蛋白质互相作用研究技术
惯用蛋白质互相作用研究技术 • 酵母双杂交 • 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） • 荧光共振能量转换效应分析 • 噬菌体显示系统筛选
第42页目录
（一）标签蛋白沉淀
标签融合蛋白结合试验是一个基于亲和色谱 原理、分析蛋白质体外直接互相作用办法。
标签融合蛋白结合试验主要用于证实两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结 合详细结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合 未知分子。
（二）原位PCR技术
• 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片 上单个细胞内进行PCR反应，然后用特异性探 针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是 否在该组织或细胞中存在。
• 原位PCR办法填补了PCR技术和原位杂交技术 不足，是将目的基因扩增与定位相结合一个最 佳办法。
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四、基因转移和基因剔除在医学 发展中作用
建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 •基因剔除 •取得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型
第57页目录
第八节
疾病相关基因克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
第58页目录
克隆疾病相关基因策略 • 功效克隆(functional cloning) • 定位克隆(positional cloning)
第59页目录
（一）功效克隆
定义 从对一个致病基因功效理解出发来克隆
该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表示产物较易得 到部分纯化遗传性疾病。
第60页目录
• 利用酵母系统从功效学角度鉴定致病基因。 • 用不同人DNA片段转化与人类遗传疾病含
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一、蛋白质互相作用研究技术
惯用蛋白质互相作用研究技术 • 酵母双杂交 • 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） • 荧光共振能量转换效应分析 • 噬菌体显示系统筛选
第42页目录
（一）标签蛋白沉淀
标签融合蛋白结合试验是一个基于亲和色谱 原理、分析蛋白质体外直接互相作用办法。
标签融合蛋白结合试验主要用于证实两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结 合详细结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合 未知分子。
常见的生化与分子生物学技术大串讲
（2）化学法：N-端测定，C-端测定。纯品蛋白质应该具 有恒定的N-端或C-端组成。如果一种蛋白质只有一条 链组成，则只会检测到一种N-端或C-端氨基酸；
（3）仪器法：HPLC或质谱。如果一种蛋白质样品在HPLC 上只表现单一的峰，则可视为其为纯品；如果纯化的 是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量 与实际的值一致，那么也可认为它是纯品。
直接测定法 间接测定法：
先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通 用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。
表2 各种印迹技术
印迹类型 转移到膜 探针 上的分子
获得的信息
Southern DNA片段 Northern RNA Western 蛋白质
放射性标记的 互补RNA或 DNA
一般说来应用基因芯片分5步进行：（1）生物学问题的提出和芯 片设计与制备；（2）样品制备；（3）生物杂交反应；（4）结果 探测；（5）数据处理和建模。
使用基因芯片对正常干扰（RNAi）
RNA干扰是指通过双链RNA使目的mRNA降解，从而特异性地抑 制目的蛋白表达的现象。
等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极 之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的 作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位 置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质 之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI
蛋白质的双向电泳
蛋白质一级结构的测定
放射性标记的 互补RNA或 DNA
一级抗体和与 酶偶联的二级 抗体
基因结构等
特定RNA的大小、分布 和含量
特定蛋白质的大小、分 布和含量
Western印迹
基因芯片
基因芯片是随着“人类基因组计划”和其它模式生物基因组计划 的进展而发展起来一门新技术，也叫DNA芯片、DNA微阵列或寡核 苷酸阵列，它采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探 针固定在支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后，与标记的 样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对生物样品进行 快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相 支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之 为基因芯片技术。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快 速和准确地分析基因的本领，在基因组功能研究、临床诊断及新 药开发等方面显示出巨大的威力，已成为人类研究和维护生命的 一大利器，因此，被誉为是基因功能研究领域最伟大的发明之一。
（3）仪器法：HPLC或质谱。如果一种蛋白质样品在HPLC 上只表现单一的峰，则可视为其为纯品；如果纯化的 是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量 与实际的值一致，那么也可认为它是纯品。
直接测定法 间接测定法：
先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通 用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。
表2 各种印迹技术
印迹类型 转移到膜 探针 上的分子
获得的信息
Southern DNA片段 Northern RNA Western 蛋白质
放射性标记的 互补RNA或 DNA
一般说来应用基因芯片分5步进行：（1）生物学问题的提出和芯 片设计与制备；（2）样品制备；（3）生物杂交反应；（4）结果 探测；（5）数据处理和建模。
使用基因芯片对正常干扰（RNAi）
RNA干扰是指通过双链RNA使目的mRNA降解，从而特异性地抑 制目的蛋白表达的现象。
等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极 之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的 作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位 置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质 之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI
蛋白质的双向电泳
蛋白质一级结构的测定
放射性标记的 互补RNA或 DNA
一级抗体和与 酶偶联的二级 抗体
基因结构等
特定RNA的大小、分布 和含量
特定蛋白质的大小、分 布和含量
Western印迹
基因芯片
基因芯片是随着“人类基因组计划”和其它模式生物基因组计划 的进展而发展起来一门新技术，也叫DNA芯片、DNA微阵列或寡核 苷酸阵列，它采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探 针固定在支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后，与标记的 样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对生物样品进行 快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相 支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之 为基因芯片技术。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快 速和准确地分析基因的本领，在基因组功能研究、临床诊断及新 药开发等方面显示出巨大的威力，已成为人类研究和维护生命的 一大利器，因此，被誉为是基因功能研究领域最伟大的发明之一。
生物化学学习方法和串讲
生物化学的学习方法和串讲首先;花一个月的时间详细看一遍,力求有个大致的印象(基础不太好的),基础好的力求看懂每个章节的类容.特别是代谢的部分(也就是动态生化部分),以及分子生物学部分.一定要看懂每个代谢的过程和分子生物学中的机理,假说.第二步,基础差的继续看书,这一遍务必看懂,否则,无法进行下一步.要直到看懂为止.下一步:在看懂的基础上,开始练习(这之前,不要练习,那是事倍功半.做也是白做,因为你根本没弄懂),一边练习,一边思考.还要自己进行归纳,总结.之后:还要对对全书有个清醒的知识结构.譬如:全书分三部分:静态,动态和分子生物学部分.静态部分:糖类,脂类,氨基酸和蛋白质,核酸,酶.糖类部分:糖的分类,性质,结构及作用等. 就是在自己的大脑里有个知识网络结构. 最后:还要定期将书进行浏览,每次你都会有新的收获........我想这得至少将书看5或6遍,这是无法超越的过程.生化串讲我们来讲讲具体的内容：第一部分生物大分子的结构及功能1 20种氨基酸的三自符号如果记不下来就不要记了（当然记下来更好），我当时就对这件事耿耿与怀--总是记不住---但是后来也没考到。
小蚂蚁化学社区* D Y7 A% C1 ]& g2 谷光甘肽的概念及作用要总结一下，最好写下来。
蛋白质的变性是重点，名词解释跟辨析里经常考。
3 蛋白质的四级结构的概念跟各级种维持镜象的化学键相必大家很熟了。
这里要提醒大家的是结构域的概念，亚基与蛋白质三级结构这两个概念的辨析。
免费|考研|资料|试题|笔记|课件|复试|分数线|调剂|排名+ H5 d0 X1 Q5 h& u) x4 血红蛋白的结构不要求，但里面的概念一定要掌握：别构效应，Bohr效应。
相应的专业外语词汇也要掌握5 蛋白质的分离与纯化是我们强调的第一个重点。
生化专业的硕士研究生无非就是做这些工作。
这部分内容容易出问答题。
建议大家逐字逐字背下来。
6 氨基酸测序里大家要知道几种方法的名字。
生物化学总结串讲
Biochemistry
4．四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、 空间排布及亚基间相互作用力。其维系键 为非共价键。 亚基是指参与构成蛋白质四级结构的而 又具有独立三级结构的多肽链。
四、蛋白质的理化性质
Biochemistry
1．两性解离与等电点： 2．蛋白质的胶体性质： 3．蛋白质的紫外吸收： 4．蛋白质的变性：
Biochemistry
糖的有氧酵解：TCA循环 TCA循环途径、关键酶、ATP的生成等 磷酸戊糖途径（HMS）生理意义
生物能学与生物氧化
Biochemistry
Biochemistry
物质在生物体内进行氧化称生物氧化，主 要指糖、脂肪、蛋白质等在体内分解时逐 步释放能量，最终生成CO2 和 H2O的过程。
•乙酰CoA羧化酶包括生物素羧基载体（BCCP）、 生物素羧化酶、羧基转移酶。
氨基酸代谢
Biochemistry
Biochemistry
脱氨基方式： 氧化脱氨基：指氨基酸在酶的作用下伴有氧化的
3.等电点（pI） 等电点的计算源自中性氨基酸pI pK
COOH
pK NH3 Biochemistry
2
酸性氨基酸pI pK COOH pKRCOOH 2
碱性氨基酸pI pK NH3 pKRNH3 2
氨基酸在等电点状态下，溶解度最小
不同pH时的电泳行为
实测得NADH呼吸链： P/O~ 2.5 实测得FADH2呼吸链： P/O~ 1.5
各种呼吸链抑制剂的阻断位点
Biochemistry
阻断电子从Cyt aa3 向O2传递
抑制电子从Cyt b向Cyt c1传递
粘噻唑 抗霉素A
生物化学总结串讲
生物化学总结串讲生物化学是一门研究生物体化学组成和生命过程中化学变化的科学。
它涵盖了从分子水平理解生命现象的众多方面，对于我们理解生命的奥秘至关重要。
首先，让我们来谈谈生物大分子。
蛋白质是生命活动的主要执行者，由氨基酸通过肽键连接而成。
其结构层次包括一级结构（氨基酸的线性排列）、二级结构（如α螺旋和β折叠）、三级结构（多肽链的三维折叠）和四级结构（多个亚基的组合）。
蛋白质的功能多种多样，如催化化学反应（酶）、运输物质（血红蛋白）、免疫防御（抗体）等。
核酸是另一种重要的生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
DNA 是遗传信息的携带者，具有双螺旋结构。
RNA 则在遗传信息的表达中发挥关键作用，如信使 RNA（mRNA）传递遗传信息，核糖体 RNA（rRNA）参与蛋白质合成，转运 RNA（tRNA）携带氨基酸。
糖类在生物体内也具有重要作用。
单糖是糖类的基本单位，如葡萄糖、果糖等。
多糖则包括淀粉（植物中的储能物质）、糖原（动物中的储能物质）和纤维素（植物细胞壁的主要成分）。
脂质是生物体内不溶于水而溶于有机溶剂的一类化合物。
常见的脂质有脂肪（储能和保温）、磷脂（构成生物膜的主要成分）和胆固醇（参与细胞膜的稳定和激素合成）。
接下来，我们看看生物体内的物质代谢。
新陈代谢包括物质的合成代谢和分解代谢。
糖代谢是重要的代谢途径之一，例如糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径。
糖酵解在无氧条件下将葡萄糖转化为丙酮酸，产生少量ATP。
三羧酸循环则是有氧呼吸的核心环节，产生大量能量。
脂代谢包括脂肪的分解和合成。
脂肪分解产生脂肪酸和甘油，脂肪酸通过β氧化产生能量。
蛋白质代谢涉及蛋白质的合成和分解。
在合成过程中，mRNA 上的遗传信息被翻译成多肽链，经过加工形成有活性的蛋白质。
分解时，蛋白质被水解为氨基酸，可用于重新合成蛋白质或通过脱氨作用产生能量。
生物氧化是指物质在生物体内的氧化过程，主要通过呼吸链进行，最终产生大量的 ATP。
生化常用分子生物学技术的原理及应用
与DNA和RNA印迹相似之处
首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小 分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质 的位置可保持在胶中的原位上。
与DNA和RNA印迹不同之处
蛋白质的转移只有靠电转移
蛋白质的检测以抗体作探针
用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（ HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋 白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结 合以提高敏感度。
探针（probe）
是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片 段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基 因序列的DNA或RNA片段。
探针的种类
寡核苷酸 基因组DNA cDNA片段
RNA片段
标记物
放射性同位素 生物素 荧光染料
Southern印迹杂交的基本步骤
待测DNA样品的限制性内切酶消化 酶切DNA样品的电泳分离 凝胶中DNA的变性和Southern转移 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测
二、蛋白质芯片 (protein chip)
又称蛋白质阵列 (protein array)
将高度密集排列的蛋白分子作为探 针点阵固定在固相支持物上，当与待测 蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋 白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和 定量分析的一种技术。
基本原理：
蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特 异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原或 受体与配体之间的特异性结合。
内切酶
1 2M
基因组DNA
重物
纸巾
10×SSC 转 移缓冲液
500g
支持物
DNA酶切片段
玻璃板 Whatman滤纸 NC膜或尼龙膜 凝胶 Whatman滤纸
12
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
最新生化与分子生物学实践教学讲义ppt课件
5、 打开电源开关，将功率调节旋钮调节到最 大，仪器进入加热状态。
6、当油水出口有油水混合物流出时，可调节功 率控制油水混合物的蒸馏速度。
课外小知识
植物芳香油散发出的芬芳气味，使人身 心爽快，有助于消除疲劳，恢复精力， 还可以不同程度地提高人体神经系统、 内分泌系统的功能，帮助人体提高免疫 力，具有保健、美容、治疗的作用。
植物芳香油的提取方法
1、水蒸气蒸馏法 原理：利用水蒸气将挥发性较强的芳香油 携带出来，形成油水混合物，冷却后混合物 又重新分出油层和水层。
分类：水上蒸馏、水中蒸馏和水气蒸馏
应用：普遍原料适用
2、压榨法 原理：通过机械加压，压榨出果皮中的芳香 油 应用：适用于易焦糊原料的提取
3、有机溶剂萃取法 原理：使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶 剂后就可获得芳香油 应用：适用范围广，要求原料的颗粒要尽可 能细小，能充分浸泡在有机溶液中。
长 的 时 间 隧 道，袅
生化与分子生物学实践
生命活动的主要承担者，一 切性状的体现者是什么？
蛋白质 蛋白质存在于生物体的组织中，
不同的生物体组织细胞所含的 蛋白质种类、数量也不尽相同， 所以，要研究它就必须将其分 离、纯化出来。因此，蛋白质 的分离与纯化技术是蛋白质研 究的重要技术。
一、蛋白质的分离与纯化
PCR反应中的主要成份
1. 引物（两种寡核甘酸） 2. 反应物（4种脱氧核苷酸） 3. DNA聚合酶（常用Taq 聚合酶） 4. 模板DNA 5. Mg 2+ （提供反应的离子条件） 6. 反应缓冲液（提供反应的溶液体系）
3、使用水蒸气蒸馏装置的注意 事项有哪些？ 1）安装仪器时一般按自下而上，从 左到右的顺序，拆卸仪器的顺序与 安装时相反。保证冷凝管下进上出。
6、当油水出口有油水混合物流出时，可调节功 率控制油水混合物的蒸馏速度。
课外小知识
植物芳香油散发出的芬芳气味，使人身 心爽快，有助于消除疲劳，恢复精力， 还可以不同程度地提高人体神经系统、 内分泌系统的功能，帮助人体提高免疫 力，具有保健、美容、治疗的作用。
植物芳香油的提取方法
1、水蒸气蒸馏法 原理：利用水蒸气将挥发性较强的芳香油 携带出来，形成油水混合物，冷却后混合物 又重新分出油层和水层。
分类：水上蒸馏、水中蒸馏和水气蒸馏
应用：普遍原料适用
2、压榨法 原理：通过机械加压，压榨出果皮中的芳香 油 应用：适用于易焦糊原料的提取
3、有机溶剂萃取法 原理：使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶 剂后就可获得芳香油 应用：适用范围广，要求原料的颗粒要尽可 能细小，能充分浸泡在有机溶液中。
长 的 时 间 隧 道，袅
生化与分子生物学实践
生命活动的主要承担者，一 切性状的体现者是什么？
蛋白质 蛋白质存在于生物体的组织中，
不同的生物体组织细胞所含的 蛋白质种类、数量也不尽相同， 所以，要研究它就必须将其分 离、纯化出来。因此，蛋白质 的分离与纯化技术是蛋白质研 究的重要技术。
一、蛋白质的分离与纯化
PCR反应中的主要成份
1. 引物（两种寡核甘酸） 2. 反应物（4种脱氧核苷酸） 3. DNA聚合酶（常用Taq 聚合酶） 4. 模板DNA 5. Mg 2+ （提供反应的离子条件） 6. 反应缓冲液（提供反应的溶液体系）
3、使用水蒸气蒸馏装置的注意 事项有哪些？ 1）安装仪器时一般按自下而上，从 左到右的顺序，拆卸仪器的顺序与 安装时相反。保证冷凝管下进上出。
生物化学和分子生物学详解演示文稿
第十二页，共96页。
氨基酸分类
极性氨基酸 甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸
非极性氨基酸 除了酸性碱性氨基酸和极性氨基酸之外的 氨基酸。
第十三页，共96页。
氨基酸的两性性质
等电点（pI）
第十四页，共96页。
肽
两个氨基酸通过肽键连接起来的化合物。 二肽 寡肽（少于10AA） 多肽 肽也具有两性性质。 如谷胱甘肽。
蛋白间产生盐键。
第四十六页，共96页。
DNA的二级结构——多态性
以上所介绍的DNA结构是Watson-Crick研 究，事实上是B-DNA。
在不同湿度和盐溶液中，DNA有A、B、C、 D、E等不同构象。（详见参考书）
左旋DNA（Z-DNA） 三股螺旋DNA
第四十七页，共96页。
DNA三级结构
蛋白质的合成
需要的因子 核糖体、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成 酶、辅助蛋白因子（起始因子、延伸因子、 释放因子）
需要的能量 主要供给者是GTP，而不是ATP。
第六十三页，共96页。
氨酰tRNA合成酶
该酶催化tRNA和其相应的氨基酸结合。 为了正确合成蛋白质，tRNA必须与其相
应的蛋白质正确连接。
第六十四页，共96页。
遗传密码——三联体密码
41 42 43
第六十五页，共96页。
密码子的性质
密码子不重叠
密码子的通用性
有通用就有特殊！ 线粒体中：UAG不是终止密码子，而是Trp的密码子；AUA不是Ile的密码 子，而是Met的密码子；AGAห้องสมุดไป่ตู้AGG不是Arg的密码子，而是终止密码子。
密码子的简并性 除了色氨酸和甲硫氨酸各有一个对应的密码子外，其它的氨基酸均具 有两个以上密码子。亮氨酸、精氨酸、丝氨酸最多，达到6个。
氨基酸分类
极性氨基酸 甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸
非极性氨基酸 除了酸性碱性氨基酸和极性氨基酸之外的 氨基酸。
第十三页，共96页。
氨基酸的两性性质
等电点（pI）
第十四页，共96页。
肽
两个氨基酸通过肽键连接起来的化合物。 二肽 寡肽（少于10AA） 多肽 肽也具有两性性质。 如谷胱甘肽。
蛋白间产生盐键。
第四十六页，共96页。
DNA的二级结构——多态性
以上所介绍的DNA结构是Watson-Crick研 究，事实上是B-DNA。
在不同湿度和盐溶液中，DNA有A、B、C、 D、E等不同构象。（详见参考书）
左旋DNA（Z-DNA） 三股螺旋DNA
第四十七页，共96页。
DNA三级结构
蛋白质的合成
需要的因子 核糖体、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成 酶、辅助蛋白因子（起始因子、延伸因子、 释放因子）
需要的能量 主要供给者是GTP，而不是ATP。
第六十三页，共96页。
氨酰tRNA合成酶
该酶催化tRNA和其相应的氨基酸结合。 为了正确合成蛋白质，tRNA必须与其相
应的蛋白质正确连接。
第六十四页，共96页。
遗传密码——三联体密码
41 42 43
第六十五页，共96页。
密码子的性质
密码子不重叠
密码子的通用性
有通用就有特殊！ 线粒体中：UAG不是终止密码子，而是Trp的密码子；AUA不是Ile的密码 子，而是Met的密码子；AGAห้องสมุดไป่ตู้AGG不是Arg的密码子，而是终止密码子。
密码子的简并性 除了色氨酸和甲硫氨酸各有一个对应的密码子外，其它的氨基酸均具 有两个以上密码子。亮氨酸、精氨酸、丝氨酸最多，达到6个。
常用分子生物学技术课件
印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
(1)Southern blotting
1975年，英国Edwen Southern创建 检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上， 用探针进行检测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析、基因诊断、分子克 隆、法医学等
⑦原位PCR技术
(三)
分子杂交技术
1.基本原理
核酸分子杂交的基本原理：具有互
补序列的两条核酸单链在一定条件 下，按碱基配对原则形成双链的过 程。
2.常见杂交方式
(1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到 硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA, 探针为DNA或RNA。 (2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤 维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或
连接方法：粘末端连接、平末端连接、同 聚物加尾连接、人工接头连接、衔接物 连接法。
4.将DNA重组体导入宿主细胞
目的基因序列和载体连接后，要导入细胞 中才能繁殖扩增，在经过筛选，才能获得重组 DNA克隆。不同载体在不同宿主细胞中繁殖， 导入细胞的方法也不相同。方法有转化、转染、 感染、显微注射等。
RNA提取
1.样品细胞的有效破碎 2.使核蛋白复合体变性 3.对内源RNA酶的有效抑制 4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离
（3）斑点印迹杂交(dot bloting)
将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼 龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样 品 应用：确定DNA样品之间的同源性
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管电泳等，纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。 如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则应该特别小心， 因为SDS能够破坏蛋白质的四级结构，如果一种蛋白质 由不同的亚基组成，则会出现几条带。此外，电泳法 检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两侧 的两个不同的pH 值分别进行检测，这样得出的结论才
一个典型的蛋白质纯化方案开始于完整的组织，一般
经过四个阶段：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；
（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或
聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（4）鉴定，包括
纯度、大小或pI的测定。教学ppt
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蛋白质纯度的鉴定
（1）电泳法：如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细
再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相
移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反
之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越
慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单
一组份，从而达到分离各组份的目的。
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表1 主要的层析方法及其原理
名称
分离原理
吸附层析 各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同
（SDS-PAGE）
3.它的pI是多少？
（等电聚焦）
4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？
（Western印迹）
5. 其一级结构如何？
（序列分析）
6.其三维结构又如何？
X-射线衍射和核磁共教振学ppt
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蛋白质纯化
一、准备工作：要解决三个问题：
（1）纯化蛋白质的目的；
（2）目标蛋白的测活方法；
（3）纯化蛋白质的原料。
二、纯化步骤：
（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；
（2）去除残渣（离心）；
（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；
（4）纯化（层析）；
（5）鉴定
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蛋白质和酶纯化的 常见方法和方案设计
分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性 质，例如溶解性、质量和形状、表面电荷、表面疏水 性、与特定配体结合的性质等。
更可靠；
（2）化学法：N-端测定，C-端测定。纯品蛋白质应该具 有恒定的N-端或C-端组成。如果一种蛋白质只有一条 链组成，则只会检测到一种N-端或C-端氨基酸；
（3）仪器法：HPLC或质谱。如果一种蛋白质样品在HPLC 上只表现单一的峰，则可视为其为纯品；如果纯化的 是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量
电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其 分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两 大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、 以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与 凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的 凝胶电泳。
等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二
维电泳、脉冲场凝胶电教泳学p。pt
常见的生化与分子生物学技术
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电泳
电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下， 向带相反电荷的电极作定向移动的现象。显然，带 电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等 都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子 带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异， 使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用 电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。
分配层析 各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同
离子交换层析 凝胶层析 疏水层析 亲和层析
固定相是离子交换树脂，各组份因所带电荷状况不同与离子交换树脂的 亲和力不同
固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞 的程度不同
固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂 的结合能力不同
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透析教方学法ppt示意图
6Байду номын сангаас
超滤方法示意图
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沉淀与离心
☺ 沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它 们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法。 它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中沉淀出来。 这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。
☺ 实现选择性沉淀的方法有改变pH 或改变离子强度或者 加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉 淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。
常用的方法有：沉淀（溶解性）； 离子交换（电荷）； 聚焦层析（电荷）；凝胶过滤（大小和形状）；疏水 作用层析（疏水性）；亲和层析（与特定配体的特异 性结合）。
蛋白质纯化的准备工作。在进行蛋白质纯化之前首先 要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目 标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。
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电泳法分教离学三ppt种不同的氨基酸
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透析和超滤
☺ 透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透 膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化 的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子 溶液中的小分子物质。
☺ 超滤 对透析原理进行了改进，它利用具有一 定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压 条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子 保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水 过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液 的目的。
固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组 份分离的目的
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离子交换教树学脂ppt 分离氨基酸
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分子筛示意图
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亲和层析示意图
蛋白质研究方法
假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X
1. 如何得到这种蛋白质?
蛋白质的分离、纯化技术
2. 这种蛋白质的大小？
☺ 离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一 种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有 可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质 溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作 用下通过溶液发生沉降。
☺ 差速离心和密度梯度离心
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层析
层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：
一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定在
固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成
的流动相，如水和各种溶剂。当待分离样品随着流动
相通过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各
自与两相发生相互作用（如吸附、溶解或结合等）的
能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且
随着流动相向前移动，各组份会不断地在两相中进行