常见的生化与分子生物学技术大串讲

更可靠；
（2）化学法：N-端测定，C-端测定。纯品蛋白质应该具 有恒定的N-端或C-端组成。如果一种蛋白质只有一条 链组成，则只会检测到一种N-端或C-端氨基酸；
（3）仪器法：HPLC或质谱。如果一种蛋白质样品在HPLC 上只表现单一的峰，则可视为其为纯品；如果纯化的 是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量
（SDS-PAGE）
3.它的pI是多少？
（等电聚焦）
4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？
（Western印迹）
5. 其一级结构如何？
（序列分析）
6.其三维结构又如何？
X-射线衍射和核磁共教振学ppt
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蛋白质纯化
一、准备工作：要解决三个问题：
（1）纯化蛋白质来自百度文库目的；
（2）目标蛋白的测活方法；
（3）纯化蛋白质的原料。
一个典型的蛋白质纯化方案开始于完整的组织，一般
经过四个阶段：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；
（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或
聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（4）鉴定，包括
纯度、大小或pI的测定。教学ppt
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蛋白质纯度的鉴定
（1）电泳法：如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细
一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定在
固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成
的流动相，如水和各种溶剂。当待分离样品随着流动
相通过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各
自与两相发生相互作用（如吸附、溶解或结合等）的
能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且
随着流动相向前移动，各组份会不断地在两相中进行
分配层析 各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同
离子交换层析 凝胶层析 疏水层析 亲和层析
固定相是离子交换树脂，各组份因所带电荷状况不同与离子交换树脂的 亲和力不同
固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞 的程度不同
固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂 的结合能力不同
管电泳等，纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。 如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则应该特别小心， 因为SDS能够破坏蛋白质的四级结构，如果一种蛋白质 由不同的亚基组成，则会出现几条带。此外，电泳法 检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两侧 的两个不同的pH 值分别进行检测，这样得出的结论才
电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其 分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两 大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、 以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与 凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的 凝胶电泳。
等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二
维电泳、脉冲场凝胶电教泳学p。pt
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电泳法分教离学三ppt种不同的氨基酸
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透析和超滤
☺ 透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透 膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化 的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子 溶液中的小分子物质。
☺ 超滤 对透析原理进行了改进，它利用具有一 定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压 条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子 保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水 过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液 的目的。
固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组 份分离的目的
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离子交换教树学脂ppt 分离氨基酸
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分子筛示意图
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亲和层析示意图
蛋白质研究方法
假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X
1. 如何得到这种蛋白质?
蛋白质的分离、纯化技术
2. 这种蛋白质的大小？
二、纯化步骤：
（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；
（2）去除残渣（离心）；
（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；
（4）纯化（层析）；
（5）鉴定
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蛋白质和酶纯化的 常见方法和方案设计
分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性 质，例如溶解性、质量和形状、表面电荷、表面疏水 性、与特定配体结合的性质等。
常见的生化与分子生物学技术
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电泳
电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下， 向带相反电荷的电极作定向移动的现象。显然，带 电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等 都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子 带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异， 使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用 电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。
☺ 离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一 种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有 可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质 溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作 用下通过溶液发生沉降。
☺ 差速离心和密度梯度离心
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层析
层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：
常用的方法有：沉淀（溶解性）； 离子交换（电荷）； 聚焦层析（电荷）；凝胶过滤（大小和形状）；疏水 作用层析（疏水性）；亲和层析（与特定配体的特异 性结合）。
蛋白质纯化的准备工作。在进行蛋白质纯化之前首先 要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目 标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。
再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相
移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反
之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越
慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单
一组份，从而达到分离各组份的目的。
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表1 主要的层析方法及其原理
名称
分离原理
吸附层析 各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同
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透析教方学法ppt示意图
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超滤方法示意图
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沉淀与离心
☺ 沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它 们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法。 它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中沉淀出来。 这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。
☺ 实现选择性沉淀的方法有改变pH 或改变离子强度或者 加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉 淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。