武汉大学医学部膜片钳安装培训V剖析

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华中科大仪博生命科学仪器 pc2c 膜片钳放大器说明书

3 安装…………………………………………………………………………………………...7
3.1 初始检查…………………………………………………………………………………..7 3.1.1 检查包装内的部件…………………………………………………………………...7 3.1.2 初始测试……………………………………………………………………………...7 3.2 膜片钳实验系统的安装…………………………………………………………………..9 3.2.1 安装探头……………………………………………………………………………...9 3.2.2 接地…………………………………………………………………………………...9 3.2.3 连接其他仪器设备………………………………………………………………….10 3.2.4 电极夹持器和电极银丝的处理…………………………………………………….11 3.2.5 浴池参考电极……………………………………………………………………….12
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华中科大仪博生命科学仪器有限公司
2 探头和主机面板
2.1 探头

PC2C 的探头装配在一个小的封闭金属壳体中，探头可根据用户所使用的微操纵器，通过本公司提供的有机玻璃绝缘垫块安装，一般需要在绝缘垫块的适当位置打孔，然后用螺钉固定探头。探头的前端可以直接与本公司提供的电极夹持器扣接，电极夹持器与记录微电极实现电连接，取得膜片钳信号，并将其输入到探头内部的前置放大器。探头内部包括实现电流－电压转换的高灵敏度前置放大器，实现 50GΩ/0.5GΩ电控切换的电子开关，以及向放大器注入补偿、测试信号的元件。在探头上有以下电连接器： 1. 输入插座（Input connecter）：这是一个聚四氟乙烯（Teflon）绝缘的标准Q9 型（与国际BNC型兼容）插座，本公司提供的H1 型电极夹持器（中国专利号：ZL 01 2 12489.3）可直接插入该插座。芯线为放大器信号输入线，屏蔽层接命令电压VP。注意：应避免手指直接接触探头的输入端芯线，因为人体所带静电可能会损害探头的输入电路。 2. 命令电压输出插座（REF. Output）：这是一个带有 1mm内径镀金插孔的红色塑料插座，与命令电压VP相连。该命令电压同时驱动探头的屏蔽外壳。注意： VP信号的输出电阻为 90Ω，过重的负载（过小的负载电阻）会使命令电压衰减过大，也就使电极电压过小。一般不能将此信号接于低于 10kΩ的负载电阻上，否则电极电压将明显低于主机电压表显示的电压值。特别需要注意，探头外壳不能与周边设备（如：微操纵器的探头安装平面等）有电接触，否则VP将会对地短路。 3. 地线插座（GND connecter）：这是一个带有 1mm 内径镀金插孔的黑色塑料插座，与整个放大器高质量的信号地线直接相连。该地线插座可用于连接浴池参考电极接地线和附近装置的屏蔽，这样连接不会形成地线环路，从而避免地线环流对放大信号产生的干扰。第 3 章将对接地有详细说明。注意：探头内部及电缆已经良好屏蔽，用户无需再对它做任何其他屏蔽。探头外壳的屏蔽并未与地线相连，而是与命令电压VP相连。

膜片钳常见问题解答讲解

膜片钳常见问题解答（一）1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。

由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。

膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。

采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。

从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。

随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。

2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S），旧称姆欧，即安培/伏特。

常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12 S，1,000 pS＝1 pA/mV。

3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么区别?答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。

后者的灵活度大，因此多采用。

目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output了。

若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。

4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。

膜片钳技术数据处理与分析 ppt课件

高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB 。
带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波。
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
23
膜片钳实验数据的处理
Notch 带阻滤波：削弱某一特定频率（如50 Hz交流）信号。中心频率（Center frequency）：10-3,000 Hz。频率宽度（–3dB width）：频率宽度。 -3dB width越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好。
8
膜片钳实验数据的处理
（3）Subtract fixed value（去除固定值法）
（4）Adjust manually（手工调零法）
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
9
膜片钳实验数据的处理
基线调零的注意事项（1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。（2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。（3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。建议最好在采集数据时就设法调整好基线。
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit演示Average Traces功能
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
30
膜片钳实验数据的处理
Analyze/Segmented Average 可对几个Trace中的某一相同时段（如Epoch A）或Cursor 1-2之间的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/Subtract Control功能中的Control File。

2023年细胞生理学和膜片钳技术解析

膜片钳技术
• 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流，从而了解离子运输、信号传递等信息。
基本原理
• 利用负反馈电子线路, 将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察, 从而研究其功能。
• Voltage clamp （电压钳技术）由 Cole 和 Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位； 1969 年，又证实 N － M 接触后的 Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。
通道蛋白——离子通道
• 环核苷酸门控通道气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，
产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。 • 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 • 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
• 1976年，德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。

膜片钳技术讲座幻灯92页PPT

谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
膜片钳技术讲座幻灯
1、合法而稳定的权力在使用得当时很少遇到抵抗。 ——塞 ·约翰逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感；权力不易确定之处始终存在着危险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金子可以拉着它的鼻子走。— —莎士比
Hale Waihona Puke

膜片钳技术(研究生平台课)

生物电现象研究简史
18 世纪末，意大利医生和生理学家 Galvani 首先在生物体 ( 蛙 ) 发现了生物电现象。 1902 年， Bernstein 提出了细胞生物电产生的膜学说。 1936年，英国剑桥Young描述了头足软体动物枪乌贼支配其外套膜肌的巨大轴突直径可达1mm。
电压门控离子通道（voltage-gated ion channels）的开启或关闭受膜电位的变化决定，具有电压依赖性，同时通道往往还与电位变化的时程有关，即具有时间依赖性。这类通道在决定细胞的兴奋性、不应期和传导性以及维持细胞正常体积等方面发挥重要作用。电压门控离子通道一般以最容易通过的离子命名，如钠离子通道、钙离子通道及钾离子通道等。

Patch clamp
Erwin Neher 1944~
Bert Sakmann 1942~
一、离子通道的概念二、离子通道的分子结构三、离子通道的分类四、离子通道的研究技术五、膜片钳实验方法六、与膜片钳技术相结合的其它研究方法

一、离子通道的概念

1955年，Hodgkin和Keens在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄孔洞的运动，并提出了“通道”（channel）的概念。细胞膜对离子通道的通透性（膜电导）的直接测定是从应用电压钳（ voltage clamp）技术以后开始的。

A.L.Hodgkin
A.F.Huxley
1914~1998
1917~

1972年Katz通过记录神经肌接头终板膜上乙酰胆碱噪声，发现ACh的量子性释放引起的终板电位及微终板电位，指出其与离子通道的电导、开放时间及开放频率的对应关系，获1970年诺贝尔生理学或医学奖。

武汉大学医学部膜片钳安装培训 V

膜片钳技术发展简介
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获 1991年诺贝尔奖。
Capillary Top channel Casptiollapry stop-extracellular Breather
Breather
Breather
Waste
REF
MEAS
BoRtetaorm(intrcahceallnulnare) l -intrfalocweclhluanlanerl
to be measured.
Patch of cell membrane with ion channel
刺激器示波器
屏蔽网
监视器
显微镜
微操
放大器 A/D转换器
headstage
防震台
刺激电极 headstage 微操作器
微机
pClamp10软件
MultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器
电压钳-电容的充放电波形
全细胞模式下等效电路
全细胞电压钳的各个电流波形
补偿原理：提供另一支路
快电容(电极电容)补偿
慢电容(膜电容)补偿
电流波形补偿全图（200B）
电流波形补偿全图（700B）
串联电阻??
串联电阻引起的钳位误差
串联电阻补偿(200B)
串联电阻补偿(700B)

武汉电生理膜片钳原理

武汉电生理膜片钳原理武汉电生理膜片钳原理是一种在细胞内用于夹取和定位膜片的技术。

这种技术使用精密的微电子设备，可以在细胞中操作小到几十微米到数毫米的膜片，并可以控制膜片的位置或者把膜片吸附到细胞表面上。

这种技术包括两个部分：一部分是使用一种叫做“微电子抓取”的微电子设备，它可以夹取细胞表面上的膜片；另一部分是使用一种叫做“光学抓取”的微电子设备，它可以夹取细胞内的膜片。

微电子抓取是一种用于夹取膜片的方法，它使用一种叫做“微电子抓取”的微电子设备，可以夹取直径小于50微米的膜片，并将膜片放置到细胞表面上。

这种设备是一种微电子机械装置，它可以精确地夹取膜片，并将膜片放置到细胞表面上。

而光学抓取则是一种用于夹取膜片的方法，它使用一种叫做“光学抓取”的微电子设备，可以夹取直径小于50微米的膜片，并将膜片放置到细胞内的特定位置。

这种设备是一种光学机械装置，它可以精确地夹取膜片，并将膜片放置到细胞内的特定位置。

武汉电生理膜片钳原理也可以用于细胞内电生理实验，例如测量细胞内电位、电流和其他电生理变化，以及实时检测细胞内的信号转导途径。

由于膜片钳可以夹取精确的膜片，因此可以在细胞内进行更准确的电生理实验，从而更好地理解细胞内的电生理机制。

与传统的电生理膜片技术相比，武汉电生理膜片钳原理的优势在于可以夹取精确的膜片，而不是整块膜片，并且可以控制膜片的位置或者把膜片吸附到细胞表面上。

这样，可以更加精确地检测细胞内的电生理变化和信号转导途径，从而更好地理解细胞内的电生理机制。

总之，武汉电生理膜片钳原理是一种用于细胞内夹取和定位膜片的技术，可以更精确地检测细胞内的电生理变化和信号转导途径，从而更好地理解细胞内的电生理机制。

该技术的应用为细胞生物学研究提供了一种新的手段，进一步推动了细胞内电生理实验的研究。

Patchclamp膜片钳实验学习资料

Patch clamp膜片钳实验学习资料Patch clamp膜片钳实验学习资料2011-06-03 10：26历史1976~1981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin和Bert Sakmann所开创的膜片钳技术(patch clamp technique)为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化.两位科学家1991年荣获诺贝尔生理或医学奖.膜片钳技术是经微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，其值可小到pA(10-12A)量级，是一种典型的低噪声测量技术.应当注意，为测量膜通道电流，必须将膜钳制于某一固定的电位上.理论生物电信号测量基础电路中，基本组成元件为电阻器(R)、电感器(L)和电容器(C).在生物系统中，电流的值很微弱(pA,10-12A~nA,10-9A).当细胞膜Na+通道开放时，一毫秒有104Na+跨膜，相当于1.6pA.生物测量电路中存在两种导电机构(电子和离子)，需特制的电极和导电液体作为二者导电的接口.生物体中的电阻器和电容器等元件，可用欧姆定律描述，但呈严重非线性特性时，用曲线描述.几个基本定律：欧姆定律：电流I流经一电阻R时，将在其两端产生电位差V=IR基尔霍夫电流定律(KCL)：电路中，任何时刻，对任一节点，所以支路电流的代数和恒等于零.基尔霍夫电压定律(KVL)：电路中，任何时刻，沿任一回路内所有支路或元件电压的代数和等于零.电导器：电导是电导器对电流导电性能的电学量，用符号G表示，单位为西门子(S).而电阻是电路中电阻器对电流呈现阻力的电学量，用符号R表示，单位为欧姆(W).这两个电学量具有互补意义，互为倒数，即G=1/R.一个无穷大的电阻，其电导为零.电容器：电容是储存电荷的电容器的电学量，用符号C表示，单位为法拉(F).电容器的电容量与极板面积成正比，与极板之间的距离成反比，还与绝缘层的介电性质有关.当电容器两极板之间施加电压V时，则所存储的电荷Q=CV(单位：C-法拉，V-伏特，Q-库仑).细胞膜的电容常表示为每单位面积的电容量(比电容)，几乎所有的脂质双分子层约有1mF/cm2的电容量.在电容器两端外接电压时，两极板之间将产生电场.细胞膜厚度约为10nm，若电压为100mv，则在膜产生很大的电场强度105V/cm.可被电压门控型离子通道的敏感机构所检测.细胞膜电路参数特征表述：脂质双分子层的介电特性可用电容C表示，离子通道则用电导G表示.可兴奋细胞膜的等效电路：根据基尔霍夫电流定律(KCL)，可有Im=ic+Ii=Cm(dVm/dt)+(Vm-Er)/Rm=Cm(dVm/dt)+Gm(Vm-Er)其中，Vm-膜电位(V)；Im-总膜电流；ic-电容电流；Ii-离子通道电流(A/cm2)；Rm-膜的比电阻(W/cm2)；Gm-膜的比电导(S/cm2)；Cm-膜的比电容(F/cm2)；Er-静息电位，但某一离子形成Ii时，则Er被平衡电位Ei(对应于离子i)所替代.可见，离子电流Ii取决于总的膜电导Gm与驱动力(势)(Vm-Er)的乘积.一般来说，细胞膜的离子电流是单个电流之和，即Ii=INa+Ik+ICl+×.每种离子产生的电流分量如INa=GNa(Vm-ENa).微电极与导电溶液微电极是生物测量中的传感器.从导电角度来看，某些含水的离子溶液，如血液，胞浆及海水均遵守欧姆定律.电流由两种离子运载，即阳离子和阴离子.当电流流过细胞膜离子通道时，选择性由一部分离子运载.电极上的电子与溶液中的离子进行变换可能会出现误差.常用电极为银/氯化银电极.细胞膜离子通道分类电压门控通道：膜受体门控通道：胞内第二信使激活的通道：通道电流的记录模式(recording configuration)细胞贴附式：用于单通道记录全细胞记录式：研究胞内第二信使时有着特殊的优势(但破膜后细胞变形，影响记录结果，可用穿孔膜片钳技术)膜外朝外式：用于单通道记录膜内朝外式：用于单通道记录膜片钳实验系统的组成机械部件：防震工作台，屏蔽罩，仪器设备架光学部件：显微镜，视频监视器，单色光系统电子部件：膜片钳放大器，刺激器，数据采集设备，计算机系统微操纵器：机械式，机电式，液压式玻璃微电极工艺玻璃毛坯管：有软玻璃(苏打玻璃，电石玻璃)和硬玻璃(硼硅玻璃，铝硅玻璃，石英玻璃)之分.软玻璃熔点低，易抛光，但1KHz的电导率是膜片记录的主要热噪声源(有较大的介电松弛特性)硬玻璃拉制后有较窄的末梢(较高的电阻)；硼硅和硅硅玻璃有较好的噪声和介电松弛特性；石英玻璃特别适用于低噪声记录，但需激光源拉制.玻璃微电极拉制工艺：垂直式拉制仪，水平拉制仪电极熔锻仪和优化处理：一是为减小电极内部与溶液之间的电容(电极末梢数微米涂敷疏水材料硅酮树脂，以阻止液膜上爬)；二是为了对电极尖端作优化处理(热抛光使电极尖端光滑，以提高封接成功率).电极流灌：为防止灰尘污染，置有盖容器内并需2~3小时内使用；电极内液充灌前最好用滤纸过滤.电极夹持器：可用甲醇清洗保持清洁浴池电极：浴池电极应该有一个稳定的电极电位并且不扰乱浴液成分.通常裸露的Ag/AgCl丝作为一种良好的浴池电极.然而Ag+仅能为某些细胞所承受，需用琼脂盐桥改善.技术膜片钳的工作模式(operating mode)电压钳模式(voltage clamp,VC)：电流钳模式(current clamp,CC)：用已知恒定的或者时变的电流作用于细胞，测量作用电流引起的膜电位的变化.实验前准备工作细胞活性状态：活细胞寿命比较短溶液准备：一般来说，浴液模仿自然的胞外环境，电极内液取代细胞溶质(胞液).胞外用浴液以公升为单位存放于冰箱，胞内用液以小容量(5~10ml)为单位冻存，实验前解冻.必须注意pH值和渗透压，亦需过滤.某些实验前的短时间内，需要向小容积(100~500ml)的电极充灌液中补加冻存物(如ATP,GTP,荧光染料，多种第二信使等)到一个Eppendorf管.实验步骤：两个重要环节高阻封接：电极与细胞膜形成封接的过程，可用示波器来观测当对电极施加一脉冲电压时的电极电流.在电极未入液前，可观测到一平坦的电流波形，混杂有电极和夹持器的杂散电容所形成的瞬态电流；当电极入液后，2mV的脉冲将产生1mA的电流通过约2MW的电极.当电极趋近细胞膜，并形成吉欧封接，将进一步增加电极电阻和减小电极电流.为证实吉欧封接的形成，可增加放大器的增益，观察到除脉冲电压的首尾两端电容性脉冲尖端电流外，电流波形仍呈平坦状.数据记录：以全细胞记录为例吸破膜片：负压或高电压脉冲参数补偿：从电路角度观察，当施加脉冲电压时，电极入口处因电极电容，入口电阻和膜电容的存在，构成一个较复杂的RC网络.当外加测试脉冲电压或命令电压时，将产生瞬态电流响应，严重干扰预期的测试结果.因此实验记录之前需要进行参数补偿，以获得实际的结果.为了消除这些参数的瞬态影响，膜片钳放大器均设有补偿电路.快电容补偿：电极电容Cp极小，仅几个pF，相应的电路时间常数很小，故对于Cp瞬态补偿称之.慢电容补偿：细胞膜电容约为1mF/cm2，此时的充电电流需流经串联电阻Rs(约几MW)，时间常数较大(约100mS)，故Cm的补偿称为慢电容补偿.串联电阻补偿：串联电阻跨接于Cp与Cm之间，当有电流经过时，产生可观的压降(如Rs=5MW，Ip=2mA，其导致钳制电位误差达10mV).因此需要消除这种误差的电路措施.数据记录：设置适当的放大器的带宽注意事项溶液：浴池和电极溶液渗透压和pH值；浴液中的二价离子具有屏蔽表面膜电荷的作用；许多有机化合物不易溶于水；氯离子Cl-是水溶液和Ag/AgCl丝电极之间的主要电荷传递离子(电子导电和离子导电的接口作用)；失调电压(放大器的失调电压，电极电位，液结电位等)；电极流灌液补加ATP等以维持细胞信号转导或某些离子电流的衰减；来自于容器，注射器，管子，针具及非高纯度化学试剂的污染.电极：电极本身的AgCl涂层受损；电极与生理盐水之间的电位问题(电极有气泡?电极与探头虚接?浴池电极未接通等)数据采集：存在问题有泄漏校正，保持电位的选择和刺激方案，采样频率的正确选择和滤波器设置.应用单通道电流记录技术细胞贴附式记录模式：细胞贴附式是最早使用的记录模式.由于单通道电流非常微弱，因此抑制噪声非常重要.膜片钳系统中的噪声成分除电子仪器噪声，电极噪声外，尚有封接噪声.因此高阻封接或吉欧封接是技术关键.为实现高阻封接，必须注意：细胞膜表面光洁，浴液干净无杂质和灰尘污染；电极材料宜用硬质玻璃，最好抛光并涂硅酮树脂以改良介电特性，降低噪声；具体封接技术经验非常重要(电极尖粘污灰尘；电极仅用一次；酶处理细胞浴液表面残渣；电极内液含Ca2+，则必须用HEPES缓冲液，以防止其与磷酸盐形成结晶；低渗透的(10%)电极溶液比较容易形成高阻封接).离体膜片的单通道电流记录在细胞贴附式记录模式基础上，派生出的膜外朝外式和膜内朝外式，因只剩下一个微小而独立的膜片，故称之为离体膜片(cell-free patch).此时细胞内，外环境均可人工控制，自由地对膜片上的单一离子通道进行调控和实验研究.离子通道的辨识可以通过门控机制，药物激活或阻塞来辨识.单一离子电流的记录数据所有的离子通道的开放和关闭处于一种随机和突变性的状态.也就是说，通道在导通和非导通两种状态下随机变化，其开放(关闭)概率由跨膜电压或配体结合所控制.从数学观点来看，这种特性是非确定的，不能用确切的明显的数学方程来描述.而只有用随机分析方法来处理(阈值检测法；直方图-幅度直方图和开关持续时间直方图).全细胞记录技术基本实验步骤：进行全细胞记录(whole-cell recording,WCR)时，电极内液应是低Ca2+的.电极尖端与细胞膜接触并形成吉欧封接使膜吸穿后，电极电位随即变为负值.将幅值几毫伏的阶跃电压通过电极作用于细胞膜，立即出现电容暂态响应.调节C-fast以消除电极电容(快电容)引起的暂态误差.对电极内腔施加一脉冲负压，直到细胞膜封接区吸破，以至电流大增，噪声也加大.进行膜电容补偿.一旦WCR模式形成之后，可将微电极稍微提升以减轻对细胞的压力.WCR实验可持续至少1小时而无衰变现象.若细胞紧贴培养皿，移开微电极时，有可能形成膜外朝外式.可以开拓应用：1.此方法对所选定细胞产生最少的膜损伤，而达到改变细胞内液目的；2.仅需更换微电极对某一细胞进行连续的不同内液的全细胞记录；3.借助此方法可以在一个实验中获得宏观的和单通道的数据.全细胞记录模式中的电极充灌：标准的电极内液：pH缓冲液(10mMHEPES，调节pH2.4)；Ca缓冲液(10mM EGTA+1mM Ca，给定Cai 10nM)；MgATP(~2mM；使ATP酶保持活性)；自由Mg2+(~1mM，在许多胞液过程中，作为一种辅助因子)；GTP(~0.1mM)用于涉及研究G蛋白的实验.ATP和GTP是不稳定的.电极内液含有核苷酸时应将其保持在冰冻状态，实验过程中，融化了液体必须置于冰块上.对于长程记录(30min)，应使用ATP再生式系统，以避免ATP在电极中衰减.细胞通常含有谷胱甘肽，K+和Na+通道的失活依赖于电极内液的氧化还原电位，应当灌注5mM谷胱甘肽以防止产生异常现象.谷氨酸盐，MOPS和羟乙磺酸盐可替代胞内标准阴离子(Cl-)以保持负平衡电位.F-也可作为胞内阴离子，也穿透Cl-可通透的通道.F-优于Cl-地方在于形成封接和记录的稳定性.F-与Al3+形成AlF4，它是一种G蛋白有效激活剂；F-也是一种Ca2+缓冲剂，干涉Ca依赖性过程.因此对于涉及G蛋白和胞内信使的过程，使用F-是不合适的.穿孔膜片钳技术：为克服某未知因子进入电极而使细胞功能被冲洗的缺点，在细胞贴附模式下，应用穿孔剂而形成穿孔膜片钳(perforated patch clamp).胞内的关键扩散分子不能跨越膜上生成的孔道以避免冲洗现象的发生.常用穿孔剂：制霉菌素(Nystatin)和两性霉素(Amphotericin B)Nystatin是一种多烯抗生素类药物.Nystatin孔道具有特殊的性质.Nystatin对细胞封接的抑制作用(封接时电极尖端不能有穿孔剂).Nystatin不溶于水，对光线敏感(溶液必须进行超声处理和光屏蔽).全细胞记录技术的应用：离子通道宏观性质的分析(离子通道的性质和分类-电压门控通道，膜受体激活通道，配体门控通道，胞内第二信使激活通道等)；离子通道微观性质分析(单一离子通道活动的测定，离子通道的构造，分布和机能分布等)；膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究；胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测；组织切片的全细胞记录；植物细胞的电生理研究.重要概念小结：全细胞记录技术是四种记录模式中应用最广泛的一种.建立全细胞模式的电路模型，可以对其功能进行电学分析，包括暂态分析，其时间常数近似为t=RsCm.对于复杂的神经细胞分析，可以采用分段建模的概念来解决.在全细胞记录模式中，电极内液与胞液之间的物质扩散与平衡，同样可以用分段建模的化学方法来分析.穿孔膜片钳是全细胞记录的派生模式，可以防止细胞内物质的流失而影响其功能.脑切片膜片钳技术优点：无需酶处理；应用高分辨率的记录技术在可分辨的神经元进行试验(组织结构相对完整)；可与其它方法结合(胞内离子荧光测量，常规荧光成像，共聚焦激光扫描成象，多光子激光扫描成像)脑切片脑切片的制备与维护断头开颅切脑区置冰冷充氧盐水(1min)组织冷却(10min)修剪组织粘贴到切片台，并冰液覆盖振动切片(60~400mm,10min)切片孵育(备用(25℃以下，10h以内)，实验用(32~37℃孵育约30min))(也可37℃孵育约30min 后转入25℃备用)脑组织的不同部位制备切片原则-保持神经元活性和树突不受损伤；依据所要研究的神经细胞确定切片的定位方向动物的品种与年龄新生动物-颅骨软，方便快速取出脑组织；脑组织小，置入冰冷生理盐水冷却快成年动物-脑组织坚韧，对缺氧敏感；组织髓鞘质多易致切片损伤脑切片膜片钳记录技术仪器设备样品器皿，记录腔，铂金丝，显微镜(差分干涉对比度显微镜DIC differential interference contrast或亮场光学显微镜BFO bright-field optics)(采用长波长的红外线可提高分辨率)电极内液和外液的配制标准电极外液：(mM,NaCl 125,KCl 2.5,CaCl2 2,MgCl2 1,NaH2PO4 1.25,NaHCO3 26,葡萄糖20)标准电极内液：依据实验目的(mM,KCl 140,MgCl2 2,CaCl2 1,EGTA 10,ATP 2,HEPES 10)切片上神经元和神经蚀质细胞的辨识视觉辨识：浅表细胞-显微镜下直接辨识；深层细胞-IR-DIC显微镜观察(也局限于4-0~50mm)荧光染料标记：染料从全细胞记录微电极注入；也可细胞浴液渗入.记录前的准备工作细胞清洗：对较深在的细胞，可用流体冲洗方法.选择细胞：好的细胞表面光滑，对比度好.记录用电极：电极相对细长以避免与物镜相触.电极阻值过大难于破膜，入口电阻(串联电阻Rs)大，也限制电极内液与细胞内部之间的物质交换.几种记录模式举例细胞贴附式：全细胞记录：膜外朝外式：双电极记录：脑切片膜片钳技术与其它方法的结合常规成像技术紫外光源(UV)照射到切片的某一区域.细胞载入荧光染料(Fura-2)后，其反射光特性发生变化.检测器可用CCD摄像机或光电倍增管PMT，均可测量细胞内钙离子浓度，荧光强度与钙通道电流.CCD的优点在于可以获得被测细胞(神经元)各个部分的图像.共聚焦成像技术激光源激发试样中的钙离子染料(Fura-2)，其反射的荧光被检测.因激发光和荧光反射光在一特定的平面聚焦(共聚焦平面).因试样中的荧光仅为一薄的光学平面被检测(薄层光学断层)，提高了空间分辨率，优于常规的荧光成像技术.多光子成像与常规荧光成像技术相比，提高三维分辨率；与菜聚焦成像相比，不依赖于特殊的光学设计，着眼于荧光染料的激发方式(激光源类型，波长).二-光子成像：由于激发光的波长较长，因而其散射和被吸收的概率很低；散射光子稀少以致其激发只限于一局部的焦点容积内.由于无需抑制聚焦平面以外的信息，所有的荧光光子都位于目镜之下并形成图像信息.多光子成像的优点：避免了紫外光照射对细胞的损伤(因低能量的激发波长在试样内狭窄聚焦平面内照射)；减少了染料光漂白和细胞的光中毒损伤(因染料仅在试样的小范围内受照射)；成像范围大(因激光波长大，穿透较深，可在样品深处收集图像信息).重要概念小结脑切片膜片钳技术是研究脑科学，特别是神经科学的重要方法.脑切片是从动物的脑区直接取出切割，其厚度可达500mm，常用的以200~300mm为宜.操作过程中，必须保持切片的活性.脑组织的结构复杂，为分清神经元的胞体，树突，突触等形态，以便于记录电极封接和记录，需要使用若干方法进行辨识(视觉辨识，荧光染料标记等).与单细胞记录类似，脑切片膜片钳记录也有细胞贴附式，全细胞，膜外朝外式等.膜片钳与成像技术结合可以得到更深入全面的信息(常规荧光成像，共聚焦激光扫描成像和多光子激光扫描成像).转自电生理网站。

膜片钳PPT课件

2021
（二）受体:细胞膜或细胞内能与某些化学物质(递质、调质、激素) 特
异性结合并产生生物效应的特殊分子。细胞膜上涉及到离子通道的主要受体：
Glu能离子型受体
激动剂
拮抗剂
AMPA
GluR1 Glu
CNQX
GluR2 AMPA
GluR3
GluR4
Kainate
GluR5 Glu
CNQX
GluR6 KA
• 配制切片液及灌流液ACSF，冻存切片液至冰水混合态 • 二元气饱和ACSF • 动物麻醉、断头、取脑、切片 • ACSF中孵育脑片至少30min • 拉制玻璃电极 • 脑片入记录槽，持续ACSF灌流1-3ml/min • 低倍镜定位，IR-DIC镜选择靶细胞
2021
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• 玻璃微电极充灌电极内液(预配)，并固定于电极夹持器 • 维持电极正压，入液，补偿液接电位 • 操纵电极尖端至靶细胞上方，压之有凹痕（快） • 撤正压，予负压，予半量钳制电压，GΩ（1min 内）封接
1. 结构研究：生化确定蛋白质氨基酸序列+X线衍射确定结构+……
2.功能研究：电生理技术（膜片钳） +……
3.结构和功能相结合：电生理技术（膜片钳） +转基因技术+……
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电流钳----测电压
向细胞内注入恒定或变化的电流，记录相应膜电位变化
电压钳----测电流
为负反馈系统。注入电流，同时钳制电压于固定的某值，此时注入电流恰好与离子通道开放产生的离子流大小相等，方向相反，以此得知该离子流大小及方向。
后予全量钳制电压
• 补偿C-fast，破膜 • 补偿C-slow，稳定10-15min

通过膜片钳玻璃微电极内插管进行胞内透析

Ａｓｒｃ：ｂｔａｔＩｈｓｐｐｒｒｓｎｎｃｓｌｖｉｂｅｍｅｈｆｎｒｃｌｌｒｄａｙｉｖａａｍｉｒｃｔ — ｎｔｉａｅｐｅｅｔａａｔａａｌｌｔｅｏｔｅｌａｉｌｓｓｉｃｏａｈｗｅｙａｄｉａｕ
０１ｍｍ、ｍａｅｆｏｈｎｖｒａｐｐｔｒｔｙｈｎ — ｒｗｉｇｐｓｅｎｔｋｕｆｅｈｌｅｕ．ｄｒｍｔｅｕｉｅｓｌｉｅｔｉｂａｄｄａｎｓｓａｄｓｃｓｏｔｏｄｒｍｏｔｅｐａｉｏｔｈｈｉｒｌｌｉｈ — ｅｌｃｏｅＷｉｙｌｇｏｎｃｅｈｃｏａｅｅ，ｓｂｔｕｉｎｏ — ｎｐａｌｔｔｅＡｇＡｇｌｅｅｔｄａｅｗｈｒｈｔａｓｒｎｅｃｎｅｔｄｔｔｅｍｉｒｃｔｔｒｕｓｔｔｆｎｏｈｉｏｉ
李国华，李之望 ” ，王士端，魏劲波郏先科一，，
华中科技大学同济医学院神经生物学系，汉４０３；武３００郧阳医学院生理教研室，十堰４２０；４００武汉大学医学院
生理教研室，汉４０７武３０１
摘
要：本文介绍了一种膜片钳微电极内插管进行胞内透析的方法。利用通用的微电极夹持器在其抽吸负压
ｐｐｔｅｉｅｔ
Ｌｕ — ａ一，Ｌｈ— ａｇ，，ＷＡＩＧｏＨｕＩＺｉＷｎ “ ＮＧＳｉａ，ＷＥｉ — ｏ，Ｚｈ— ＤｕｎＩＪｎＢＨＥＮＧａ．ＸｉｎＫｅ

对医学生开展膜片钳技术实验教学的体会

2019 年第 5 卷增刊 Med Edu Mgt 2019, Vol.5, Supp.
医学教育管理
DOI: 10.3969/j.issn.2096-045X.2019.S.008
·实验教学·
对医学生开展膜片钳技术实验教学的体会
魏华李华许晴薛奋勤刘丽娜薛冰
（首都医科大学中心实验室，北京 100069）
【摘要】随着对离子通道、离子通道病以及各种生物电现象的不断关注，膜片钳技术在医学研究中的应用日益广泛。作为现代电生理实验技术，膜片钳技术的实践在医学生培养方面发挥着越来越重要的作用。膜片钳实验技术要求高，仪器精密复杂，选择适合的教学方法和不同层次的教学内容、提高带教老师自身业务能力、引导学生自主学习等，是提高膜片钳技术实验教学质量的有效手段，可以为医学生在未来的科研工作中正确熟练地应用该项技术打下坚实基础。【关键词】膜片钳；实验教学；医学生
大多数学生在之前的学习中没有接触过膜片钳技术，对实验中所使用的各个仪器都不熟悉。因此，在介绍完膜片钳技术的基本知识之后，先带领学生参观膜片钳实验室，了解膜片钳实验的特点及其对周围环境的要求，熟悉实验中要用到的膜片钳放大器、微操纵器、电极拉制仪等仪器，讲解各仪器的基本原理及其在实验中所发挥的作用，让学生建立起对膜片钳实验的整体印象。然后，按照实验的主要流程，分别从玻璃微电极的制备、细胞高阻封接的形成、全细胞记录模式的形成等几个方面，详细讲述各步骤的基本知识、操作方法和注意事项。操作时由老师先做示范，同时讲解每一步的要点，再由学生轮流实际操作，使其掌握基本的膜片钳技术操作。这是本科生和所有开展实验的人员都要掌握的内容。
电生理学，作为生理学的重要分支，是研究生物电现象和生物电信号的一门学科，是生命科学的基础。电生理学概念和技术从建立至今已有 2 个多世纪，20 世纪 70 年代膜片钳（patch clamp）技术的创建，更是对电生理学发展作出了划时代的贡献。它是通过玻璃微电极和细胞膜之间形成紧密接触，采用电压钳或电流钳技术对生物膜上的离子通道进行观察，尤其可记录到单个离子通道的皮安级（pA）电流，从而可以在单个蛋白质分子水平上观察其电活动 [1]，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。目前膜片钳技术广泛应用于生物学、医学、药学等多学科领域的研究 [2]。

中国生理学会循环专业委员会细胞膜片钳实验技术培训班通知

中国生理学会循环专业委员会细胞膜片钳实验技术培训班通知佚名
【期刊名称】《生理通讯》
【年(卷),期】2012(031)002
【摘要】为推广医学电生理研究新成果和新技术手段，培养科技人才和服务社会，2011年由泸州医学院心肌电生理学研究室成功承办了第一届细胞膜片钳实验技术培训班，效果良好，反应强烈。

应广大生理学、药理学和病理生理学，特别是从事电生理研究领域人员的需求，中国生理学会循环生理专业委员会决定于2012年7月8日至13日在四川I泸州医学院举办第二届“细胞膜片钳实验技术培训班”。

【总页数】1页(P57-57)
【正文语种】中文
【中图分类】Q4-27
【相关文献】
1.中国生理学会“生理学实验和研究技术培训班”通知 [J],
2.中国生理学会“生理学实验和研究技术培训班”通知 [J],
3.中国生理学会循环生理专业委员会细胞膜片钳实验技术培训班在泸州医学院举办[J], 黄文俊;杨艳
4.中国生理学会高级机能实验室技术培训班通知 [J],
5.中国生理学会高级机能实验室技术培训班通知（再次刊登） [J],
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电生理膜片钳技术教学中的一些心得_林显光

给出细胞电生理等效模式图指出当细胞膜内外电压发生变化时细胞作为电路中的等效电阻电容并联体系阻会有电流通过电容会有充放电反应也就是产生了电阻电流和电容电流于这种电流干扰是不能简单地通过平移曲线来消除其影响因此需要引入pn漏减的方法在向细胞给出幅度跃电压其电压为向相同也可以选择相反这样将这些阶跃电压所得的被动反应电流加和就可以得到在幅度为阶跃时候会产生的漏电流通过曲线间加减法即可消除漏电流的影响
位。但是，其实用这种记录方式来描述常见的动作电位记录是不准确的。目前使用膜片钳系统进行的动作电位记录，大多数是单电极测试，也就是从同一根探头给出去极化刺激并且同时检测膜电流的变化来测定动作电位。这两种情况下，动作电位产生的原理是相同的，可以说反映了类似的细胞活动，但是不能完全等同起来，后者的采集过程中，细胞处于一个较长时间的胞内电势去极化的状态，主要用来测试细胞动作电位的发放频率（Fire rate），而前者主要用来测试细胞对于某种短促刺激的响应能力，这里需要着重给学生分析清楚。
而对于一些针对特别具体实验的内容，如怎样制备大鼠脑片、怎样进行海马脑片记录、怎样在新生大鼠离体脑干——脊髓标本上进行实验等，则不必列入课程范围内，因为在学生可以查找到的文献中有更新、更完备、更切合实际工作的方法，不需要在课堂上进行这些内容的训练。我们课程的宗旨是让学生理解膜片钳系统的工作原理，并指导其将具体实验与放大器原理结合起来进行科研工作，而非手把手地进行实验方法教学，何况这些教科书上的实验方法很容易被时间所淘汰。至于教材中关于如何连接数模转换线路、如何使用某一种采集软件的内容，也不必列为教学内容。因为这些都是在仪器说明书中所包含的内容，并且随着设备的更新换代会有所改变，学生可以通过阅读说明书来获得更准确的信息。
3 授课教师应该对膜片钳有深入的理解膜片钳技术从表面上看只是对膜片钳放大器相关系统的应用来采集微弱的生物电信号，但事实上，对不同的样本，不同类型信号的测量，有非常多的决定成败的细节。这就要求授课教师不能仅仅依赖教材和论文，而要亲身实地尽可能多地涉猎不同类型的实验，才不至于在授课中由于自己的“想当然”而误导学生。如膜片钳的主要测量模式为贴附式、全细胞模式、细胞膜内向外模式、细胞膜外向外模式。曾经很多老师会认为，其中的贴附式是获得数据最简单、技术含量最低的一种，比全细胞模式要容易很多，因为全细胞模式记录是在贴附式记录基础上，吸破细胞和电极接触部分的细胞膜形成的，换句话说进行全细胞模式记录之前先要形成贴附式封接。然而事实并非如此。在膜片钳实验中，一般要求玻璃电极和细胞之间实现高阻抗封接也就是通常说的 G 欧封接。对于全细胞模式的记录来讲，由于信号较大，全细胞电流一般在数百 pA 到数千 pA，因此达到大约 1G 欧姆左右的封接，信噪比就足以准确的测定实验信号。所以虽然全细胞模式比贴附式要多一次将封接点细胞膜吸破的工序，但一般而言 50%以上的细胞在吸破之后仍然可以保持 G 欧封接，可以获得有效的数据。而反观贴附式记录模式，一般要测定的是被封接区域上的单通道电流，多在 10pA 以下，这就需要封接电阻至少要达到 10G 以上才可以记录到单通道电流。而可以达到 10G 以上封接的细胞并不特别常见，并且并不是每一次都可以准确地将离子通道封在电极中。因此一般而言，可以说贴附式记录获得实验数据的难度要大于全细胞模式。再比如常见的动作电位的记录。膜片钳教科书上所给出的记录模式图均取自最初的双电极电压钳细胞内记录，即在一根电极处给出短促的方波电压刺激，在另一处电极处处于静息状态下记录细胞的动作电

膜片钳实验技术系列讲座　第十三部分　应用于离子通道研究中的脂质平面膜法(一)

膜片钳实验技术系列讲座第十三部分应用于离子通道研究
中的脂质平面膜法(一)
陈军
【期刊名称】《神经解剖学杂志》
【年(卷),期】1997(13)2
【总页数】13页(P190-202)
【关键词】膜片钳;实验技术;电生理;解剖学
【作者】陈军
【作者单位】第四军医大学基础部解剖学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R33－33;R322－33
【相关文献】
1.膜片钳实验技术系列讲座：第四部分全细胞记录法和穿孔膜片钳法 [J], 八尾宽
2.膜片钳实验技术系列讲座：第三部分组织切片膜片钳技术 [J], 高桥智幸
3.膜片钳实验技术系列讲座──第四部分全细胞记录法和穿孔膜片钳法（续） [J], 陈军
4.膜片钳实验技术系列讲座──第十二部分单一离子通道记录数据的分析法 [J], 陈军
5.膜片钳实验技术系列讲座：第二部分泵电流和运输电流的分析法 [J], 陈军
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