武汉大学医学部膜片钳安装培训V剖析

膜片钳技术发展简介
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进， 引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使 该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月 《Single-Channel Recording》一 书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获 1991年诺贝尔奖。
电压钳是保持细胞膜电位不变，同时记录离子跨膜电流的一种方法。跨 膜电流是由Na+, K+, Ca2+, Cl-离子通过细胞膜上的离子通道所产生的。
双电极电压钳原理图
Vc
e VVmm＝＝VVcc
Na＋
Vm
＋
＋
－＋
－ Na＋ －
Im
e
＋－
Cl－ － ＋ Ag/AgCl
＋－ －
＋
－＋ ＋
脑片膜片钳技术
微电极电极与膜
膜片钳技术发展简介
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电 位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流， 从而产生了膜片钳（patch clamp）技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接 （Giga-seal），大大降低了记录时的噪声，实现 了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的 突破。
to be measured.
Patch of cell membrane with ion channel
刺激器 示波器
屏蔽网
监视器
显微镜
微操
放大器 A/D转换器
headstage
防震台
刺激电极 headstage 微操作器
微机
pClamp10软件
MultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-）
（德国细胞生理学家）
一个典型的实验过程
四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)
贴附式
全细胞记录模式பைடு நூலகம்
细胞
负压吸
拉并暴露于空气中
细胞 拉
细胞 内面向外式
细胞 外面向外式
Outside-out configuration
细胞膜外侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录（single-channel recording) 可方便地通过改变外液来了解药物对离子通道的影 响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离子 通道的影响
电压钳(Voltage Clamp)
当细胞膜上的离子通道开放，产生跨膜电流；但是跨膜电流会引起膜电 位的改变。膜电位的改变一方面会影响离子通道的开放数量；同时也会影响 离子流过通道的驱动力。这两个因素反过来又对跨膜电流产生影响。此时记 录到的电流受多方面因素的影响，很难进行分析。
（引自：The Axon Guide》，1993。 有改动）
海马脑片CA1区锥体神经元的IR-DIC影象
海马脑片CA1区中间神经元的IR-DIC影象
神经元
微电极
举例一
离子通道研究
channel current (pA)
---------Voltage-depended
Ca2+ ion channel
-10
-20
-30
-40
-50
-60
I/V curve
-70
-80
-60 -40 -20
0
20
40
60
depolarization potenial (mV)
三、常见离子通道电流的记录：
1. Na+通道电流：全细胞记录
离子通道动力学性质的研究
（以海马脑片全细胞记录模式为例）
1．脑片撕裂法（Slice rending method）
2．表面清洁法
3. 红外微分干涉相差显
（Surface cleaning 法） 微镜法（IR-DIC法 ）
a
4.盲法 （Blind 法）
10μM
b
（引自：Ascher P, 1989）
10μM
（引自： Stuart et al., 1993）
计算机控制的微电极放大器 双电极探头
MultiClamp Commander
液接电位调零 电极电容补偿 细胞膜电容 膜电阻补偿
电极电阻补偿
Sutter公司
MP-225
电动式微操
$6,500
美国TMC公司
什么是膜片钳（Patchclamp）？
膜片钳技术是一种通过微电极与细胞 膜之间形成紧密接触的方法，采用电 压钳或电流钳技术对生物膜上离子通 道的电活动进行记录的微电极技术。
膜片钳电生理技术与设备
神经元
微电极
FBR
_
+ Amplifier
Technical The high gain operational amplifier is connected in the circuit so that the current flowing through the ion channel is measured as a voltage drop across the feedback resistor (FBR). The FBR has a resistance of 50 G allowing very small currents (10-12 A)
内面向外式
Inside-out configuration
细胞膜内侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录（single-channel recording) 可方便地通过改变浴槽灌流液（此时相当于细胞 内液）来了解药物对离子通道的影响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离 子通道的影响
外面向外式
细胞贴附式
Cell-attached configuration
电极仅与细胞膜很小部分形成Giga-seal,不损害细 胞膜的完整性; 用于单通道记录（single-channel recording) 某一特定的离子通道 细胞不同部位的电流
全细胞式记录
Whole-cell recording
将电极尖端的膜片打穿，电极内液与细胞内液 交换。 在电压钳制模式下，记录整个细胞的电流和不 同的离子通道电流 在电流钳制模式下，记录膜电位和动作电位 是最常用的记录方式 可以进行细胞外给药或将药物加到电极液中， 进行细胞内给药。