LAMP技术及应用
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（5）随访患者 LAMP结果阳性，不能作为随访患者的疗效评价。
一点建议
•根据试剂盒不同、实验室严格分区 –溶液配制区、样品处理区、检测区
•基本操作 –混匀、吸取 –模板最后加入，按照先阴性、后阳性， 从低到高梯度，最后阳性对照
•环境污染 –UV照射 –DNAZAP等DNA降解试剂
2020年3月1日星期日
2020年3月1日星期日
LAMP技术简介
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外 等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约 65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的 热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连 续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相 比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
2020年3月1日星期日
LAMP法常规操作步骤
2020年3月1日星期日
LAMP法的检测方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
一、样品处理 3、沉淀用1mL生理盐水重悬洗涤
一、样品处理
4、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清 5、重复步骤3、4一次
一、样品处理
6、向含沉淀物的离心管分别加入100μL DNA提取液，混 匀后沸水浴10min
一、样品处理
7、冷却至室温后， 13000 r/min离心﹥5min，上清 即为核酸模板
LAMP技术及应用
湖北省疾控中心结防所 周丽平
2020年3月1日星期日
LAMP技术
环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸 的指数级扩增的技术
已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫) LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
二、核酸扩增
1、向反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳 性对照各2.5μL，注意加样时枪头要穿透稳定液层加至反
应管大腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区
二、核酸扩增 2、置65℃恒温反应60min
三、结果判断
1、反应结束，将反应管倒置甩动2次，再正置甩动2次， 使工作液与显色液充分混合
实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分 枝杆菌诊断鉴别中
世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份 最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用 该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案
“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术
县区级
检测结核分枝杆菌
环介导等温扩增 多色巢氏荧光PCR法
2020年3月1日星期日
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
➢ gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
➢ 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
2020年3月1日星期日
WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。
LAMP检测结果的临床应用
（1）LAMP结果为阳性，涂片结果也为阳性。可做出患者疑似患有结核 病的诊断，并开始抗结核治疗，同时等待培养结果。
（2）LAMP结果阳性，而涂片结果为阴性。根据临床症状判断是否开始 抗结核治疗，同时等待培养结果。这时可考虑增加一个或一个以上的 标本进行LAMP检测以确认。如果增加的标本检测结果也为阳性，则患 者可被初步诊断为患有结核病，并等待培养的结果。
2020年3月1日星期日
LAMP技术特点
灵敏度高 特异性强 速度快
设备简单
LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩 增模板可低至每测试10拷贝或更少。
通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。
恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省 却温度循环，在30min～60min内即可完成反应 过程。
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
➢ 扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 ➢ LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
2020年3月1日星期日
LAMP法的引物设计
2020年3月1日星期日
LAMP法的原理
2020年3月1日星期日
LAMP法的原理
三、结果判断
2、在阴性对照反应管液体颜色为无色（或橙色），阳性对照反应管 液体颜色呈绿色的条件下：
• 若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果 为结核分枝杆菌阳性；
• 若待检样本反应管中液体颜色为无色（或橙色），则可报告该样 本检测结果为结核分枝杆菌阴性；
• 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效， 应重新检测。
➢ 肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
➢ 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所
以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色，来检测扩增是否发生。（图C）
谢谢!
2020年3月1日星期日
➢ 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用 技术特点：
➢ 适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象，可避免假阳性过高。
➢ 反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶 污染；用户操作简便、减少操作误差。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较
2020年3月1日星期日
痰标本目测法检测流程
100分钟
一、样品处理
1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液 2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中
一、样品处理 2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清
（3）LAMP结果为阴性，涂片结果为阳性。应考虑LAMP结果是否受痰标 本中的抑制物影响，并增加一个或一个以上的标本检测。若增加的标 本检测结果仍不变，且排除抑制物因素，则患者可初步考虑为非结核 分枝杆菌感染，进行进一步确诊实验。
（4）LAMP结果为阴性，涂片结果亦为阴性。根据临床症状判断是否开 始抗结核治疗，并等待培养结果。
只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。
产物检测便捷
在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与 镁
离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性 判断LAMP反应；可与荧光物质结合。
LAMP法和其他Fra Baidu bibliotekCR法的比较
2020年3月1日星期日
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年3月1日星期日
LAMP法所需的试剂
交叉引物发 RNA等温扩增法等
地市级
省、自治区
结核分枝杆菌及是否对 利福平和异烟肼耐药 基因芯片 溶解曲线 线性探针
检测结核分枝杆菌 检测是否对利福平和异
烟肼耐药
LAMP技术的原理
对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合
成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。
一点建议
•根据试剂盒不同、实验室严格分区 –溶液配制区、样品处理区、检测区
•基本操作 –混匀、吸取 –模板最后加入，按照先阴性、后阳性， 从低到高梯度，最后阳性对照
•环境污染 –UV照射 –DNAZAP等DNA降解试剂
2020年3月1日星期日
2020年3月1日星期日
LAMP技术简介
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外 等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约 65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的 热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连 续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相 比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
2020年3月1日星期日
LAMP法常规操作步骤
2020年3月1日星期日
LAMP法的检测方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
一、样品处理 3、沉淀用1mL生理盐水重悬洗涤
一、样品处理
4、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清 5、重复步骤3、4一次
一、样品处理
6、向含沉淀物的离心管分别加入100μL DNA提取液，混 匀后沸水浴10min
一、样品处理
7、冷却至室温后， 13000 r/min离心﹥5min，上清 即为核酸模板
LAMP技术及应用
湖北省疾控中心结防所 周丽平
2020年3月1日星期日
LAMP技术
环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸 的指数级扩增的技术
已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫) LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
二、核酸扩增
1、向反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳 性对照各2.5μL，注意加样时枪头要穿透稳定液层加至反
应管大腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区
二、核酸扩增 2、置65℃恒温反应60min
三、结果判断
1、反应结束，将反应管倒置甩动2次，再正置甩动2次， 使工作液与显色液充分混合
实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分 枝杆菌诊断鉴别中
世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份 最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用 该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案
“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术
县区级
检测结核分枝杆菌
环介导等温扩增 多色巢氏荧光PCR法
2020年3月1日星期日
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
➢ gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
➢ 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
2020年3月1日星期日
WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。
LAMP检测结果的临床应用
（1）LAMP结果为阳性，涂片结果也为阳性。可做出患者疑似患有结核 病的诊断，并开始抗结核治疗，同时等待培养结果。
（2）LAMP结果阳性，而涂片结果为阴性。根据临床症状判断是否开始 抗结核治疗，同时等待培养结果。这时可考虑增加一个或一个以上的 标本进行LAMP检测以确认。如果增加的标本检测结果也为阳性，则患 者可被初步诊断为患有结核病，并等待培养的结果。
2020年3月1日星期日
LAMP技术特点
灵敏度高 特异性强 速度快
设备简单
LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩 增模板可低至每测试10拷贝或更少。
通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。
恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省 却温度循环，在30min～60min内即可完成反应 过程。
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
➢ 扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 ➢ LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
2020年3月1日星期日
LAMP法的引物设计
2020年3月1日星期日
LAMP法的原理
2020年3月1日星期日
LAMP法的原理
三、结果判断
2、在阴性对照反应管液体颜色为无色（或橙色），阳性对照反应管 液体颜色呈绿色的条件下：
• 若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果 为结核分枝杆菌阳性；
• 若待检样本反应管中液体颜色为无色（或橙色），则可报告该样 本检测结果为结核分枝杆菌阴性；
• 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效， 应重新检测。
➢ 肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
➢ 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所
以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色，来检测扩增是否发生。（图C）
谢谢!
2020年3月1日星期日
➢ 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用 技术特点：
➢ 适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象，可避免假阳性过高。
➢ 反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶 污染；用户操作简便、减少操作误差。
2020年3月1日星期日
LAMP法在结核菌检测中的应用
现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较
2020年3月1日星期日
痰标本目测法检测流程
100分钟
一、样品处理
1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液 2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中
一、样品处理 2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清
（3）LAMP结果为阴性，涂片结果为阳性。应考虑LAMP结果是否受痰标 本中的抑制物影响，并增加一个或一个以上的标本检测。若增加的标 本检测结果仍不变，且排除抑制物因素，则患者可初步考虑为非结核 分枝杆菌感染，进行进一步确诊实验。
（4）LAMP结果为阴性，涂片结果亦为阴性。根据临床症状判断是否开 始抗结核治疗，并等待培养结果。
只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。
产物检测便捷
在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与 镁
离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性 判断LAMP反应；可与荧光物质结合。
LAMP法和其他Fra Baidu bibliotekCR法的比较
2020年3月1日星期日
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年3月1日星期日
LAMP法所需的试剂
交叉引物发 RNA等温扩增法等
地市级
省、自治区
结核分枝杆菌及是否对 利福平和异烟肼耐药 基因芯片 溶解曲线 线性探针
检测结核分枝杆菌 检测是否对利福平和异
烟肼耐药
LAMP技术的原理
对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合
成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。