第三章细胞破碎
生物工业下游技术选择题复习要点
第二章发酵液预处理一、选择题1、在发酵液中常加入B，以除去发酵液中的钙离子。
A. 硫酸B. 草酸C. 盐酸D. 硝酸2、在发酵液中加入草酸，其作用是ABCD。
A. 去除钙离子B. 去除部分镁离子C. 改善发酵液的过滤性能D. 有助于目标产物转入液相。
3、在发酵液中加入三聚磷酸钠，它和B形成可溶性络合物，可消除对离子交换的影响。
A. Ca2+B. Mg2+C.Zn2+D. Fe3+4、环丝氨酸的发酵液中，加入磷酸盐的主要目的是去除AD。
A. Ca2+B. Fe3+C. Zn2+D. Mg2+5、在发酵液中加入黄血盐，可去除C，使其形成普鲁士蓝沉淀。
A. Ca2+B. Zn2+C. Fe3+D. Mg2+6、关于阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力，以下说法正确的是ABCD。
A. Al3+＞Fe3+B. H+＞Ca2+＞Mg2+C. K+＞Na+＞Li+D. Fe3+＞H+＞K+7、酵母絮凝的FLO1型只被以下A抑制。
A. 甘露糖B. 葡萄糖C. 麦芽糖D. 蔗糖E. 半乳糖8、酵母絮凝的NEW FLO型只被以下E抑制。
A. 甘露糖B. 葡萄糖C. 麦芽糖D. 蔗糖E. 半乳糖9、发酵液中，细胞絮凝机理有A。
A. 胶体理论B. 高聚物架桥理论C. 双电层理论D. 盐析理论10、在生物产品分离中，C技术可代替或改善离心和过滤方法，富集或除去发酵液中的细胞或细胞碎片。
A. 凝聚B. 双水相萃取C. 絮凝D. 色谱11、下列物质属于絮凝剂的有AC 。
A、明矾B、石灰C、聚丙烯酸类D、硫酸亚铁第三章细胞破碎技术一、选择题1、高压匀浆法提高细胞破碎率的方法有ABC 。
A. 适当地增加压力B. 增加通过匀浆器的次数C. 适当地增加温度D. 提高搅拌器的转速2、下列AB 可采用高压匀浆法进行细胞破碎。
A. 大多数细菌B. 酵母C. 放线菌和霉菌D. 含有亚细胞器（如包涵体）的微生物细胞3、珠磨法提高细胞破碎率的方法有BCD 。
生化分离工程_苏海佳_第三章细胞破碎
5. 胞内产物的选择性释放
细胞完全破碎的缺点：所有胞内的蛋白质全部 释放出来，粘度增加，杂质增加，给后面分离 纯化带来困难。
1、目标：细胞不完全破碎，选择性释放，其他物 质尽量少释放，粗分。
生化集成：利用两种以上的不同阶段的分离过 程同时进行。
2、原因：例如利用珠磨法破碎酵母细胞时，各种 酶的释放速度不同，靠近细胞膜和细胞壁的酶先 释放，细胞内部或细胞器内后释放。
本章要点
珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法 和超声波法破碎细胞的基本原理和 应用条件？ 胞内产物的选择性释放的原理？
生活中的辛苦阻挠不了我对生活的热 爱。21.1.1921.1.19Tuesday, January 19, 2021 人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。04:49:2704:49:2704:491/19/2021 4:49:27 AM 做一枚螺丝钉，那里需要那里上。21.1.1904:49:2704:49Jan-2119-J an-21 日复一日的努力只为成就美好的明天 。04:49:2704:49:2704:49Tues day, January 19, 2021 安全放在第一位，防微杜渐。21.1.1921.1.1904:49:2704:49:27Januar y 19, 2021 加强自身建设，增强个人的休养。2021年1月 19日上 午4时49分21.1.1921.1.19 精益求精，追求卓越，因为相信而伟 大。2021年1月 19日星 期二上 午4时49分27秒04:49:2721.1.19 让自己更加强大，更加专业，这才能 让自己 更好。2021年1月上午 4时49分21.1.1904:49Januar y 19, 2021 这些年的努力就为了得到相应的回报 。2021年1月19日星期 二4时49分27秒04:49:2719 January 2021 科学，你是国力的灵魂；同时又是社 会发展 的标志 。上午4时49分 27秒上 午4时49分04:49:2721.1.19 每天都是美好的一天，新的一天开启 。21.1.1921.1.1904:4904:49:2704:49:27Jan- 21 相信命运，让自己成长，慢慢的长大 。2021年1月19日星期 二4时49分27秒Tues day, January 19, 2021 爱情，亲情，友情，让人无法割舍。21.1.192021年1月19日 星期二 4时49分27秒21.1.19
工艺学3-细胞破碎
第三章
第一节 第二节 第三节
（二）高速珠磨机 （High speed bead mill）
第三章
第一节 第二节 第三节
高速珠磨机工作原理
磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园 盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离 小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层 之间的碰撞和磨料的滚动而引起。
（二）、目的物的稳定性 （三）、破碎效果和产物释放率
第三章
第一节 第Байду номын сангаас节 第三节
方法 匀浆法
机 械 珠磨法 法
超声波
表 3-1 常用的细胞破碎方法
原理
特点
基于液相的剪切力
适用面广，处理量大，速度快，在工业生产上广 泛应用，但不适用于某些高度分支的微生物，另 外产热大，可能造成生物活性物质失活
利用研磨作用破碎
胞 内 冰 晶 引 起 细 胞 膨 较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，仅
胀破裂
适于在实验室中使用
渗透压冲击法 渗透压突然变化，使细 较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用 胞快速膨胀破裂
化学试剂处理 应 用 化 学 试 剂 溶 解 细 需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏，
胞 或 抽 提 某 些 细 胞 组 可应用于大规模生产
第三章
第一节 第二节 第三节
三、化学法（Chemical treatment）
（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 2、用脂溶性有机溶剂 3、表面活性剂
（二）酶解法（Enzymatic lysis） （三）制成丙酮粉
第三章
第一节 第二节 第三节
四、选择破碎方法的依据
（一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨
细胞破碎PPT课件
高压匀浆器
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:
压力 (工业生产中常用55～70MPa的压力) 循环操作次数(多次循环的操作方法)
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
细胞破碎的方法（按细胞所受作用）
分类
作用机理
适应性
高压匀浆法 液体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌
珠磨法
固体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活，浆液分离困难
物 超声破碎法 理 破 渗透压法 碎
革兰氏阴 性细菌的 外膜
壁膜间隙
革兰氏阴性细菌的细胞壁
O-特异多糖 (O-polysaccharide)
核心多糖(corepolysaccharide)
蛋白质
孔蛋白 类脂A (Lipid A)
(脂多糖)
脂蛋白
磷脂分子
细胞壁的结构和特点
微生物 壁厚/nm
革兰氏阳 革兰氏阴 性细菌 性细菌
20-80
反复冻融法
液体剪切作用
渗透压剧烈改变 反复冻结-融化
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
破碎率较低，常与其他方法结合使用
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
干燥法
改变细胞膜的渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
X-press法 固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合
第三章生物材料预处理
第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离第一节预处理及固液分离一、预处理的依据1、生物活性物资存在方式与特点胞内胞外成分复杂含量不一2、后续操作要求如果后续操作有离子交换法，对无机离子等要求高。
3、目的物的稳定性有效成分的生理活性不断变化较稳定物可以用剧烈的变形处理除杂二、动物材料的预处理绞肉机冻融高压匀浆器三、发酵液(培养液)的预处理预处理的目的? 改变发酵液(培养液)的物理性质，以利于固液分离。
主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。
? 去除发酵液(培养液)中部分杂质以利于后续各步操作。
预处理的方法（一）、加热加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液(培养液)加热到所需温度并保温适当时间。
加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液(培养液)的粘度，使固液分离变得容易。
但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。
预处理的方法（二）、凝聚和絮凝凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞(分泌胞外产物)、细胞的(分泌胞内产物)碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。
其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液(或培养液)，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。
但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。
1.凝聚凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。
凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷(如细胞或菌体一般带负电荷)，因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。
常用的无机盐类凝聚剂有：Al2(SO4)3?18H2O(明矾)、AlCl3?6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等;常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。
2.絮凝絮凝是指使用絮凝剂(通常是天然或合成的大分子量聚电解质)，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
细胞破碎课件PPT
酶解法是一种利用酶来分解细胞壁的方法，通常使用溶菌酶、蜗牛酶等酶类物质。
酶解法的优点在于对细胞壁的破坏作用较小，能够保持细胞内物质的完整性，适用 于提取细胞内活性物质。
酶解法的缺点在于酶的种类和浓度对破碎效果影响较大，且酶解过程较慢，需要较 长时间才能达到理想的破碎效果。
溶菌酶破碎
溶菌酶是一种专门作用于细菌 细胞壁的酶，能够破坏细菌细 胞壁，使细胞壁水解而破碎。
高压破碎
原理
常用设备
利用高压作用使细胞膜破裂，释放细胞内 的物质。
高压均质机、高压破碎机等。
应用范围
注意事项
适用于各种类型的细胞，尤其是对细胞壁 有破坏作用的高压破碎。
高压破碎需要严格控制压力和作用时间， 以避免对细胞内物质造成过度破坏。同时 ，需要确保设备的安全性和稳定性。
04
生物法破碎细胞
酶解法
溶菌酶破碎适用于革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌的破碎，尤 其对革兰氏阳性菌的破碎效果 较好。
溶菌酶破碎的优点在于破碎效 率较高，且对细胞内物质的破 坏作用较小。
蜗牛酶破碎
蜗牛酶是一种天然的酶，能够分解细 胞壁和细胞膜，使细胞内的物质释放 出来。
蜗牛酶破碎的优点在于能够有效地释 放细胞内的物质，且对细胞内物质的 破坏作用较小。
免疫学研究
细胞破碎后提取的细胞成分可以用于免疫学研究，如抗原-抗体反应、 细胞因子检测等，有助于深入了解免疫系统的功能和调控机制。
在药物制备中的应用
1 2
天然药物提取
许多天然药物来源于动植物细胞，通过破碎细胞 可以提取有效成分，如中药材的有效成分。
合成药物的合成与改造
在药物合成中，细胞破碎可用于释放细胞内的酶 或其他生物催化剂，以促进药物的合成或改造。
第三章 细胞破碎解读
有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
变性剂
盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲素（Urea） 是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而 使疏水性化合物溶于水溶液。
化学渗透法优点：
（5）化学渗透法 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地 渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结 构与组成。
表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双 分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。
原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞 环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力作用下破碎。
压力：50~70MPa 速度：450m/s
高压匀浆器针型阀结构简图
高压匀浆器各种阀型设计
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难 破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环 的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程， 被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方 程可表示为：
EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结
构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维
持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将 脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂 来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
第三章 细胞破碎
3.5.2 与上游相结合
（3）克隆噬菌体溶解基因 ：在细胞内引进噬菌体基 因，培养结束后，控制一定条件（如温度等）， 激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出 内含物。 （4）耐高温产品的基因表达 ：如果产品能表达成 耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在 较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷 却费用，又简化了分离步骤。
酶溶法的特点（外加酶）：
（1）酶溶法需要特定的反应条件。 （2）酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和 化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应 的次序。 （3）酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件 温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。 （4）酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法 通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存 在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有 抑制作用。
3.3.1 珠磨法
细胞破碎率可用一级反应动力学表示 ： 间歇操作： ln[1/(1-R)]=Kt 连续操作： ln[1/(1-R)]=Kτ 其中 τ =V/F
式中： R—破碎率（g/g） K—反应速率常数(1/s) t—破碎时间(s) τ —平均停留时间(s) V—破碎室悬浮液体积（L） F—进料速率(L/s)
《生物分离工程》 Bioseparation Engineering 第三章 细胞破碎
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 ) 路线一 路线二 清液－胞外产物
游技术第三章细胞破碎
不宜采用高压匀浆法。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。
易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。
3.反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
4.干燥法
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合
非 机 械 法
酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差
化学渗透法
改变细胞膜的渗透性
具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差
渗透压法
渗透压剧烈改变
破碎率较低，常与其他方法结合使用
冻结融化法
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。
化学渗透法（Chemical permeation）
该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
生化分离工程知识点总结归纳
生化分离工程知识点归纳第一章绪论1、生物物质分离工程：在工业规模上，通过适当的分离纯化技术与装备并消耗一定的能量和分离介质来实现生物物质（产品）制备的过程，是生物产业的一个重要组成部分。
2、生物工程下游加工过程的特点：（1）成分复杂：固体成分、液体成分（2）悬液中的目标产物浓度低（3）稳定性差：化学（温度和pH值）或微生物引起的降解（4）生物产品质量要求高：纯度、卫生、生物活性3、下游加工过程的一般流程（4个阶段）：发酵液的预处理与固液分离、初步纯化（提取）、高度纯化（精制）、成品加工。
4、某一具体产品的分离提取工艺设计中应考虑的问题：①产物本身的性质；②是胞内产物还是胞外产物；③原料中产物和主要杂质浓度；④产物和主要杂质的理化特性及差异；⑤产品用途和质量标准；⑥产品的市场价格；⑦不同分离方法的技术经济比较及废液的处理方法等。
第二章发酵液的预处理与过滤1、发酵液的预处理发酵液的预处理的方法：（1）加热：最简单、最经济的预处理方法是加热，降低料液黏度，也可以对其进行灭菌。
但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。
（2）调节料液的pH值：促进全细胞聚集。
（3）凝聚和絮凝：凝聚是指通过加入简单电解质降低了胶体粒子间的排斥电位，从而使得范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。
常用凝聚剂多为阳离子型如明矾、三氯化铁。
絮凝是指预处理时加入絮凝剂（通常指天然或合成的生物大分子聚电解质）既能降低排斥电位，又吸附了周围的微粒，形成桥架作用，促使胶粒形成粗大，密度低的絮凝团。
这些絮凝团很容易被过滤得到。
主要絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、多聚胺衍生物。
（4）使用惰性助滤剂：硅藻土、珍珠岩。
2、真空过滤器的优点：连续自动操作,节省人力，生产能力大。
真空过滤器的缺点：附属设备多，投资费用高，推动力小适用于量大易过滤的料液。
3、压滤器的优点：过滤推动力大，过滤面积大。
压滤器的：缺点：板框压滤机劳动强度大，投资、维护费用高。
经典：第三章-微生物细胞破碎
7
一、细菌细胞壁 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成份，
它是一个大分子复合体，由多糖链借短肽 交链而成。
细菌破碎的主要阻力来自肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取 决于多糖链上存在的肽键数量和其交链程 度，交链程度越大，网状结构越致密，破 碎难度越大。
8
革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图
9
46
微生物细胞的自溶法常采用加热法或 干燥法。
工业生产的典型例子是酵母自溶物制 备。
自溶法的缺点：对不稳定的微生物， 易引起目的蛋白质的变性，此外，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。
47
五、化学渗透法(Chemical permeation)： 利用一些化学试剂，如有机溶剂、变性
剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等， 以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从 而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理 方式称为化学渗透法。
中试规模：胶质磨 工业规模：高速珠磨机
22
破碎作用符合一级动力学； 破碎程度用细胞破碎率（%）或单位细 胞释放的内含物（mg/g）表示。
23
细胞破碎动力学方程：
24
25
延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌 转速和操作温度等都可有效地提高细胞破 碎率。
高破碎率将大大增加能耗；温度升高； 大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不 易分离。
图革 兰 氏 阳 性 菌 细 胞 壁 结 构 模 式
10
二、酵母菌细胞壁： 酵母菌细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主
要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、 蛋白质（6-8%）和脂类。
酵母细胞壁结构可分成三层：最里层葡聚糖层， 构成细胞壁的刚性结构，使细胞具有一定的形状； 最外层是甘露聚糖层；葡聚糖层和甘露聚糖层依 靠处于中间层的蛋白质交链在一起，形成网状结 构。
细胞破碎
细胞破碎技术生基硕51 邓亮05123010生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离，通常使用过滤和离心等方法。
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。
在上述过程中，需被分离的发酵液可被看作一种副产物来处理，以此分离和纯化产物。
有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。
脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。
还有一些目标产物就是细胞本身，如面包酵母。
还有，产物如类固醇不必通过细胞破碎提取。
大多数情况下，产物还是包裹在生物体内，属胞内产物。
使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁，细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因工程中应用极少。
破碎技术的分类细胞破碎方法是十分有用的。
我们很容易将这些方法划分为两大类，化学法和机械法，下表中已经列出详细方法分类：化学方法主要的几种化学方法，有渗透冲击法，表面活性剂增溶法、脂溶法。
1． 酶消化法和碱处理法酶消化法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。
细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。
酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。
碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。
该操作是细胞增溶的很好的例子，因为它使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋白质变性。
该法不仅破坏了细胞壁也破坏了产物，因此即便很便宜，碱处理也是一种很不常用的方法。
2． 渗透冲击法三种主要细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。
此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。
细胞破裂后释放到周围环境中的胞内物可用后续方法分离。
细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被用4.3节所介绍的方法机械切碎或匀浆后才易溶破。
第三章 细胞的破碎与分离
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强 度。
第三章 细胞的破碎与分离
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
概述
• 不同类型的细胞分泌目标产物的类型：
• 动物细胞多分泌到细胞外培养液 • 植物细胞多为胞内产物 • 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外， 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破 碎。
概述 • 大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些 多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵 液中。 • 有些目标产物存在于生物体中。
在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲 液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞 悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
超声波破碎的适用范围
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物 的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对 酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实 验室小规模细胞破碎中常用。
化学破碎
酶促破碎
一 机械法
机械破碎法又可分为： 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding）
第三章细胞分离与破碎蛋白质复性
第二节 细胞分离
2.2 离心分离设备： ①实验室用离心机：离心管式转子离心机
特点：间歇式操作
各种形式的离心机转子
第二节 细胞分离
②工业用离心机：管式离心机， 碟片式离心机 特点：可连续操作
管式离心机
管式离心机能澄清及分离流体物质，被应用于化学、生物化学、 制药、血浆等研究领域。设备简单，分离效率高；但生产能力 较小。
第二节 细胞分离
3 过滤（Filtration）
①定义——利用多孔性介 质截留悬浮液中的固体粒 子，进行固液分离的方法。
第二节 细胞分离
②过滤前处理 通常发酵液的黏度大，其中的微生物体
积小，造成过滤的困难 在过滤前，一般需对料液进行絮凝或凝
聚等预处理，此外可添加助滤剂提高过 滤速度。
第二节 细胞分离
蛋白质
孔蛋白 类脂A (Lipid A)
(脂多糖)
脂蛋白
磷脂分子
第三节 细胞质尽量少地 释放出来，并尽量降低细胞的破碎程度，有利 于下游分离纯化。
第三节 细胞破碎
4 细胞破碎技术 4.1 机械破碎：
原理：细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而 破碎。 细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破碎。 优点：处理量大、效率高、速度快，是工业规 模的主要手段
碟式离心机
碟式离心机是沉降式离心机中的一种，用于分离难分离的 物料（例如粘性液体与细小固体颗粒组成的悬浮液或密度 相近的液体组成的乳浊液等）。碟式分离机是应用最广的 沉降离心机。 碟式离心机可以完成两种操作：(1)液-固分离，称澄清操 作；(2)液-液（或液-液-固）分离（即乳浊液的分离），称 分离操作。
革兰氏阳性细菌的细胞壁结构
革兰氏阳性（G+） 细菌的细胞壁具有 较厚（30-40nm） 而致密的肽聚糖层， 多达20层
细胞破碎
细胞破碎-------综述摘要：细胞破碎，细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁细胞破碎方法有：高压匀浆破碎法振荡珠击破碎法高速搅拌珠研磨破碎法超声波破碎法渗透压冲击破碎法酶溶破碎法等等，这篇综述主要讲的是超声波破碎法。
关键词：细胞破碎超声波破碎法原理应用超声波细胞破碎仪又叫超声波细胞粉碎仪是一种利用强超声在液体中产生空化效应，对物质进行超声处理的多功能、多用途的仪器。
能用于多种动植物细胞、病毒细胞的破碎，同时超声波细胞破碎仪可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡、清洗及加速化学反应等。
仪器原理：超声波细胞破碎仪的原理并不是太神秘、太复杂。
简单说就是将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。
超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。
同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。
超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。
热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（42-43℃），因为正常组织的临界致死温度为45.7℃，而肿瘤组织比正常组织敏感性高，故在此温度下肿瘤细胞的代谢发生障碍，DNA、RNA、蛋白质合成受到影响，从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。
生物工业下游技术习题附答案
生物工业下游技术习题第一章绪论1、何为生化分离工程？其主要研究那些内容？下游加工过程（下游技术）：对由生物界自然产生的或由微生物发酵过程、动植物细胞组织培养或酶反应过程等各种生物工业生产过程获得的生物原料（发酵液、培养液、反应液），经提取分离、加工精制成有关生物化工产品的过程（技术）。
由不同生物化工单元操作组成。
研究内容：产品的分离纯化，从混合物（发酵液等）中用最低的投入，获得最高的产出（产物的高得率、高纯度）。
2、试述生物技术下游加工过程的特点及应遵循的原则。
特点：发酵液等为复杂多相系统，属非牛顿性液体，成分复杂多样，固液分离困难。
产物起始浓度低（发酵液起始浓度较低而杂质又较多），常需多步纯化操作；产物（生物物质）通常很不稳定：遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解；发酵或培养都是分批操作，生物变异性大，各批发酵液不尽相同，下游加工应有弹性；发酵液不宜久存，应尽快提取。
原则：时间短；温度低；pH适中（在生物物质的稳定范围内）；严格清洗消毒。
基因工程产品，生物安全问题3、生化分离工程有那些特点？其包括那几种主要分离方法？4、简述生化分离工程的发展趋势。
操作集成化(减少步骤，提高收率）；方法集成化；大分子与小分子分离方法的相互渗透；亲和技术的推广使用和配基的人工合成；优质层析介质的开发；基因工程对下游过程的影响；发酵与提取相耦合。
5、简述生物技术下游加工过程的一般流程。
按生产过程划分，下游技术大致分为4个阶段：a)预处理（发酵液或培养液的预处理和固液分离)；b)提取（初步分离纯化）；c)精制（高度纯化）；d)成品加工（最后纯化）；第二章预处理与固-液分离法1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？预处理：a)预处理目的：改变发酵液的性质，利于固液分离。
b)方法：采用酸化、加热、以降低发酵液的粘度；或加入絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大颗粒。
目的：分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，利于提取精制后续工序的顺利进行；菌种不同、发酵液特性不同，预处理方法选择也不同。
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①细胞壁的最里层是由葡聚糖的 细纤维组成，它构成了细胞壁的 刚性骨架，使细胞具有一定的形 状，
②覆盖在细纤维上面的是一层糖 70~300
蛋白，
nm
③最外层是甘露聚糖，由1,6一磷 酸二酯键共价连接，形成网状结 构。在该层的内部，
④有甘露聚糖-酶的复合物，它可 以共价连接到网状结构上，也可 以不连接。
3.1 细胞的结构
一、细菌细胞的结构
破碎细菌的主要阻力
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网 状结构，其网结构的致密程度和强度取决 于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联 的程度，如果交联程度大，则网结构就致 密。
因此，革兰氏阴性细菌比阳性细菌容易破碎。
3.1 细胞的结构
二、酵母细胞的结构
由酵母细胞壁的结构示意图可知， 共有4层：
3.1 细胞的结构
一、细菌细胞的结构
革兰氏阳性/阴性细菌细胞壁的结构和组成
微生物
革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌
细胞壁厚 （nm）
层次
主要 组成
15~50
10~12
单层
肽聚糖（40%~90%） 多糖
胞壁酸 蛋白质 脂多糖（1%~4%）
多层
肽聚糖（5%~10%） 脂蛋白
脂多糖（11%~12%） 磷脂
蛋白质
四、植物细胞的结构
“经纬”模型
目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提 出的“经纬”模型：
依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向 一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不 同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网络， 构成了细胞壁的“经”，
模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由 细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联 成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又 相互交联，构成更复杂的网络系统。
持。 5. 加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）——除去植物组织中的酚类
8~10 nm
1.5~2nm
(a) 革兰氏阳性菌细胞壁结构模式图
有时蛋白会被分泌到此处 (b) 革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图
细菌细胞壁化学组成
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成：
糖： 短肽：
N-乙酰葡萄糖胺
（NAG）
N-乙酰胞壁酸 （NAM）
D-丙氨酸 L-丙氨酸 D-谷氨酸
L-二氨基酸
• 它是难溶性的聚糖链 （glycan chain），借助短 肽交联而成的网状结构，包 围在细胞周围，使细胞具有 一定的形状和强度。
酚类化合物会与蛋白结合形成沉淀，因此，在破碎缓冲液中需加 入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）将其除去。
因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很 高的机械强度。
由此可见，植物细胞壁更为复杂和坚硬，且与植物细胞的生长 状态有关。
3.2 破碎缓冲液组成
在细胞破碎过程中，为了保护蛋白活性，对破碎缓冲 液有以下要求：
1. 缓冲液一般为磷酸缓冲液或Tris缓冲液，离子强度： 0.1~0.2mol/L，pH=7.0~8.0。——与细胞内部环境相似。
2. 需加入抗氧化剂（如二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、半胱氨酸 和还原型谷胱甘肽等）。——防止二硫键形成及蛋白氧化。
3. 酶抑制剂——防止胞内蛋白酶对目的蛋白的降解。 4. 酶的底物和辅因子——纯化酶蛋白时，有助于酶活性的保
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此 细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型细胞其细胞壁的结构和组成不 完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。因此，需要根据不同的细胞类型选择适当的破碎方法。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防 止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的 优化（包括破碎缓冲液组成）是十分必要的。
半纤维素和果胶等胶体则填充在网络之中，从而使整个细胞 壁既具有刚性又具有弹性。
3.1 细胞的结构
四、植物细胞的结构
初生细胞的经纬模型
3.1 细胞的结构
四、植物细胞的结构
次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形 成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上) 。
在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维 素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素等酚类化 合物。
本章内容
3.1 细胞的结构 3.2 破碎缓冲液组成 3.3 细胞破碎方法 3.4 影响破碎率的因素和检测破碎
率的方法
3.1 细胞的结构
一、细菌细胞的结构 二、酵母细胞的结构 三、动物细胞的结构 四、植物细胞的结构
3.1 细胞的结构
一、细菌细胞的结构
膜磷壁酯
壁磷壁酯
15~50 nm
第三章 细胞破碎
细胞破碎
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)ห้องสมุดไป่ตู้
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
细胞破碎
次生壁是细 胞停止生长 后，在初生 壁内部形成 的结构。
3.1 细胞的结构
四、植物细胞的结构
植物细胞初生壁的化学组成
组 结构和分类 分
纤 β－1，4－D－葡 维 聚糖 素
半 木葡聚糖 甘露聚糖
纤 木聚糖(包括阿拉伯
维 素
木聚糖和4-0-甲基-葡 萄糖醛酸木聚糖）
果 半乳糖醛酸聚糖 、
3.1 细胞的结构
与细菌细胞壁一样，破碎酵母细 胞壁的阻力主要决定于壁结构交 联的紧密程度和它的厚度。
糖蛋白
3.1 细胞的结构
三、动物细胞的结构
• 动物细胞的破碎较为容易，不需要强烈的破碎条件。
3.1 细胞的结构
四、植物细胞的结构
对于已生长结 束的植物细胞 壁可分为初生 壁和次生壁两 部分。
初生壁是细 胞生长期形 成的。
引言
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用 外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容 物（包括目的产物）释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的 非分泌型生化物质（产品）的基础。
细胞破碎
引言
生物产品的来源主要来自于微生物、动物和植物。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细 胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。