蛋白质化学一级结构测定
蛋白质一级结构测定
氨基酸与肽的定量组成测定
定量组成测定，第一步是将蛋白质水解 为基组成氨基酸。 蛋白质的水解方法有： 1、酸水解法：用6MHCl于100~120℃下在真 空的安瓿瓶内进行，水解10~24小时
特点： （1）所得的氨基酸不消旋；但色氨酸全部被破坏。 （2）天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来而转 变为相应的氨基酸，酰胺基的总量由产生的氨算出。
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蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中 氨基酸的组成、排列顺序连接方式和 二硫键的位置。 在生物化学与分子生物学中不少问题 都面临着需要知道蛋白质一级结构的 情况。如研究蛋白质的结构与功能的 关系、酶的结构与功能的关系、一级 结构与高级结构的关系等。因此，只 有把一级结构研究清楚之后，我们才 能研究生命过程中的许多复杂问题。
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（2）三价铁显色法： 含有色氨酸的样品，与铁离子的醋 酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈 玫瑰红色，在545nm比色测定。 此法测定简便、快速，线性关系较 好。但反应混合物中的含水量对显色有 一定影响。因此，不如对-二甲基氨基 苯甲醛法使用广泛。
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氨 基 端 的 分 析
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley 等1956年报告了丹磺酰氯与氨基酸、肽 或蛋白质的氨基反应产生黄色的荧光， 由此产生了测定N末端的新方法，称 DNS法。 本法测定N末端的原理与DNP法有 相似之处。但比DNP法的灵敏度提高了 100倍，使用更为广泛。
对氯汞苯甲酸与巯基反应， 形成巯基的对氯汞苯甲酸 衍生物（PCMB）。PCMB 最大吸收在233nm摩尔消光 值为1.96×104。与巯基形 成硫醇盐以后，增加到2.2 ×104从图中可以看出在 250nm处差值最大，这个差 值与参与反应的试剂量有 直接关系。测定时，用含 巯基化合物支滴定固定量 的汞试剂，直至吸收差值 不再增加为止，根据汞试 剂的量可以计算出巯基数 量。由于测定是在蛋白质 的吸收范围内进行，因此 必须作蛋白质含量对吸收 36 影响的校正。
第三章蛋白质一级结构的测定
不带电荷极性R基团氨基酸
O N HH2＋ 3N CH C CH2 CH2 C NH2 O OH O－
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
O H2N H3N＋ CH C CH2 C OH O
O－ OH
-氨基丁二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-氨基--羟基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine
不带电荷极性R基团氨基酸
O ‖ HH2＋ O－ 3N N－CH－C－OH │ CH2 │ SH
-氨基--巯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
包括以下几方面内容： ①多肽链的数目； ②每条多肽链中氨基 酸的种类、残基数目和 排列次序； ③链内或链间二硫键 的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证
测定的基本战略和步骤
特殊氨基酸的测定
蛋白质中氨基酸组成的表示方法
蛋白质营养价值的评价
1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构
组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为氨基酸，除甘氨酸外都是L-型。
不变部分
可变部分
2. 蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
非极性R基团氨基酸
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
蛋白质一级结构测序解析
蛋白质顺 序测定基 本方法路 线
纯蛋白质
二硫键拆开
末端氨基酸测定 专一性裂解
将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
测定一级结构的基本方法
基本步骤： (1) 测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条 肽链构成的； (2) 拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键 并分离出每条肽链。 (3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成 (4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基 (5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段； (6)分离并测定各肽段的氨基酸序列； (7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
胰岛素
-巯基乙醇
碘乙酸
尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式： a.与肽链竞争氢键 b.增加非极性侧链在 水中的溶解度
（NH）
脲或胍 脲或胍
（四）氨基酸组成的分析
氨基酸分析仪进行测 定，测定每条多肽链 的AA组成，并计算出 AA成分的分子比。
（五）裂解多肽链成较小的片段
酶解法：如胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶 化学法：如溴化氰法 羟胺法
二硫键位置的确定
+
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ第 二 向
a b
-
pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段
+
第一向
-
Brown和Hartlay对角线电泳图解
（九）蛋白质测序举例
• 胰岛素测序自学
胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。
含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。 A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之 间形成一个链内二硫键。
蛋白质一级结构测定的新进展
级 结 构并 作 出肽 谱 的 重 要 性 在 于 ： 可 用 于 分 ］①
子 克 隆 中寡 核 苷 酸 探 针 的 制 备 ； 为ｃ ＮＡ推 导 的 ② Ｄ 氨 基 酸 序 列 提供 证 据 ； 为 重 组 Ｄ ③ ＮＡ 产 生 的蛋 白 质作 指纹 分 析 ； 蛋 白质的 完整 结构 鉴 定 ； 确 定 翻 ④ ⑤ 译 后 修 饰 的位 点 ； 决 定 簇 的 定 位 ； 二 硫 键 的 确 ⑥ ⑦
现 该 法 已成 功 应 用 于 微量 序 列 分 析 ， 论 是 用 液 相 无 还 是 固相 ， 工或 自动 方 法测 序 ， 得 到 良好 效 果 。 手 都 在 自动测 序仪 方 面 ， 除前 述 液相 序列 仪 外 ，９ ０ １７
蛋 白质结 构 的研 究 可 追 溯 到 一个 世 纪 以前 ， 但 直 到 １５ ９ ３年 ， 由英 国科 学 家 Ｓ ｎ ｅ 第 一 个 发 表 才 ａｇ ｒ 了胰 岛素 的 全部 氨 基 酸 序 列 ， ａ ｇ ｒ 因此 获 得 了 Ｓｎｅ 也 １５ ９ ８年诺 贝尔 化学 奖 。 白质测 序 的基 本思 路 是先 蛋 将 蛋 白质 用化 学 法 或 酶 法 水 解 成 肽段 ， 对 肽 段 进 再 行 氨 基 酸 序 列测 定 ， 中化 学 法 裂 解 的 肽段 一 般 较 其 大 ， 于 自动 序 列 分 析 仪 测 定 ， 学 法 常 用 的 试 剂 适 化 有： 溴化 氢 、 亚碘 酰基 苯 甲酸 、 胺等 。 法 中常 用酶 羟 酶
１ ｐ ｌ 样 品 进 行 常 规 分 析 。 ０ ｍｏ 的
序 列两 方面 。蛋 白质 的 的氨基 酸 序列 测定 对 了解 其结 构 与功 能 以及生 物进 化 、 遗传 变 异 的关 系极 有 意义 ，
测定蛋白质一级结构的方法
测定蛋白质一级结构的方法哇塞，蛋白质的一级结构可是非常重要的呀！那要怎么去测定它呢？
测定蛋白质一级结构的方法主要有以下这些哦。
首先是通过氨基酸组成分析，要把蛋白质水解成氨基酸，然后进行定量和定性分析，这就像拼图前要先知道有哪些拼图块一样。
这里面要注意水解的条件要控制好呀，不然会影响结果的准确性呢。
还有呀，不同的分析方法也要选对，不然也会出问题哟！
在这个过程中，安全性那可是相当重要的呀！得小心使用那些化学试剂，别一不小心伤到自己啦。
稳定性也得保证呀，每一步操作都要稳稳当当的，可不能马虎。
那它都有哪些应用场景和优势呢？这可多啦！比如在生物制药领域，了解蛋白质的一级结构可以帮助开发更有效的药物呢，就像有了精确的地图才能找到宝藏一样。
而且这种方法准确性高呀，能够给我们提供非常可靠的信息呢。
我给你说个实际案例吧。
比如说研究某种疾病相关的蛋白质，通过测定它的一级结构，科学家们就能更好地理解这个蛋白质的功能和作用机制，说不定就能找到治疗这种疾病的新方法呢！你说厉害不厉害？
总之呀，测定蛋白质一级结构的方法真的是超级重要的呀，它就像一把钥匙，能打开蛋白质奥秘的大门，让我们更好地了解生命的奥秘呢！。
蛋白质一级结构的测定方法
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3）氨基酸组成分析 酸水解
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸（磺酸）在 105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来 用4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应 用。
测定蛋白质的分子量
鉴定方法：
估算氨基酸残基数，确定肽
⑴ 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 链数
(PAGE)要求一条带，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶
⑵ DNS—Cl（二甲氨基萘磺 过滤法，沉降系数法
酰氯）法测N端氨基酸。
(3) 亲和层析
(4) western 印迹法等
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及测定的一般步骤
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（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法
羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根 据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。 应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学 实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放 出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
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羧肽酶法
第二节 蛋白质一级结构 的测定
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一、蛋白质一级结构定义(primary structure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行 排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称 为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。 核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包 括二硫键的位置。 意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋
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（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法
测定蛋白质一级结构的方法进展
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的序列，其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义，对生命科学的发展更是起到了推进作用，而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于：①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备；②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据；③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段， 再对肽段进行氨基酸 序列测定，其中化学法裂解的肽段一般较大，适于自动序列分析仪测定；酶法的优点是专一 性强，降解后肽段易纯化，产率较高，副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序，测 定方法主要是化学法，酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典，它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率，使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱（LC）HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体，粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的，现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好，且用样量少，并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质分子基础5-蛋白质一级结构测定
C末端分析
a)肼解法 b)还原法：硼氢化锂还原剂 c)羧肽酶法
还原法
肽链C末端AA ↓硼氢化锂 α－氨基醇 ↓水解 C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓ 色谱法鉴定
羧肽酶法
羧肽酶法：
最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降 解，释放出游离AA。
巯基含量测定
DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)
Protein-Ｓ- +R-S-S-R(DTNB) Protein-S-S-R+RSProtein-SH Protein-S-S-Protein+RS-(CNT) R
-
-COOH -NO2
反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收， 根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含 量。
优点:Trp在水解中不受破坏。
蛋白质的水解
磺酸水解
4mol/L 甲基氨酸 ( 含 0.2%β- 吲哚乙胺 ) 色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
蛋白质化学
蛋白质一级结构的测定
序列测定的基本方法学
将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的 肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。 再将不同方法得到的序列进行比对，就可以 得到肽链的一级结构。
序列测定一般步骤
纯度要求:纯度在97%以上。
双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。
蛋白质一年级结构的测定方法
蛋白质一年级结构的测定方法集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段，对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。
它是确定蛋白质的结构的基本步骤，也是蛋白质结构分析的重要环节。
蛋白质一级结构测定的步骤包括：
第一步：样品准备。
首先要准备一定量的蛋白样品，蛋白样品的质量越好，结果越准确。
常用的样品准备方法有：水解、沉淀、纯化和提取。
第二步：结构图谱分析。
在样品准备好之后，就可以进行结构图谱分析，以检测蛋白质的一级结构。
主要的结构图谱分析方法有：X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。
第三步：原子模型构建。
在结构图谱分析完成之后，就可以根据图谱分析的结果，构建蛋白质的原子模型，即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。
第四步：模型精度评估。
当构建完原子模型之后，就可以对模型进行精度评估，也就是把原子模型与实际情况进行比较，看模型是否能够准确反映实际情况。
第五步：结构可视化。
在模型精度评估完成之后，就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化，使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。
第六步：结构分析和总结。
在蛋白质的原子模型可视化完成之后，就可以对蛋白质的原子结构进行分析，比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析，并对这一分析结果进行总结归纳，从而揭示蛋白质的一级结构。
以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤，在蛋白质结构分析中，蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步，只有把这一步做对了，才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。
蛋白质的一级结构(共价结构)
1.蛋白质的一级结构（共价结构）蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
1.蛋白质结构层次一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构↓超二级结构↓构象（高级结构）结构域↓三级结构(球状结构)↓四级结构(多亚基聚集体)1.一级结构的要点．1.蛋白质测序的一般步骤祥见 P116（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3）测定多肽链的氨基酸组成。
（4）断裂链内二硫键。
（5）分析多肽链的N末端和C末端。
（6）多肽链部分裂解成肽段。
（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。
（9）确定多肽链中二硫键的位置。
1.蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
1. 直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法 N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4B 法裂解 B1 B2 B3 B4用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
1. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，一次可测600-800bp1. 测序前的准备工作1. 蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。
（两种以上才可靠）⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNS —cl （二甲氨基萘磺酰氯）法测N 端氨基酸1. 测定分子量用于估算氨基酸残基n=方法：凝胶过滤法、沉降系数法1. 确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：⑴非共价键结合8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量⑵二硫键结合过甲酸氧化：—S —S —+HCOOOH → SO 3Hβ巯基乙醇还原：举例:： 血红蛋白 (α2β2)（注意，人的血红蛋白α和β的N 端相同。
）分子量： M拆亚基： M 1 、M 2 两条带拆二硫键： M 1 、M 2 两条带分子量关系： M = 2M 1 + 2M 21. 测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。
蛋白质一级结构的测定
其他裂解肽的方法：
A：部分酶分解法：0.1N HCl在110度或6N HCl 在37度水解，但特异性不强，因此对大片段和 肽均不适用； B：羟胺法：反应机理是通过羟胺作用，先形成 一个琥珀酰亚胺环状物然后导致肽键的裂解。 羟胺专一性的裂解Asn-Gly的肽链，产率可达 70%以上。但酸性条件下切割Asn-Pro； C： 稀酸切割Asp-Pro肽键：蛋白质中Asp-Pro键 对酸不稳定； D：Cleavage at Trp resides by oiodosobenzoine acid (亚碘酰基苯甲酸）产率： 70%-100%
多肽的专一性降解（specific cleavage of
大于20的多肽一般需要预先进行降解，尽管目 前的测序可以一次测定60-70氨基酸残基，但 由于氨基酸组成、纯度、产率等因素的影响这 种几率比较少。多肽的降解不外于化学法和酶 法俩种。 1 化学法（大片段）
A:Cyanogen bromide (CNBr) 它选择性的切断Met残 基的羧基侧肽链，将Met转化为高丝氨酸（Homoser) 和高丝氨酸内酯(Homoserine lactone)。 在氨基酸组成分析时高丝氨酸和高丝氨酸内酯相距甚 远。高丝氨酸在丝氨酸之后，而高丝氨酸内酯在组氨 酸之后。计算时可将高丝氨酸和高丝氨酸内酯相加， 计算甲硫氨酸的量。 the protein）
• 蛋白质高级结构研究需要一级结构的知识; 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构 如:牛胰核糖核酸酶的复性实验 基因工程中包涵体的问题 • 蛋白质一级结构与分子进化的关系; 细胞色素C是广泛存在于需氧生物线粒体呼吸链中 的起传替作用的一种蛋白质通过它可以绘出生物进 化树,一般在进化树位置相距越远,则氨基酸的顺序 差别越大. • 一级结构与遗传病(分子病); 镰刀状细胞贫血症中的血红蛋白(HbS),他仅是β -链 上第六号的Glu变为Val ，从而导致生物功能上的巨 大差异
蛋白质一级结构测序-1
Edman
H
O
O
氨
N C S HN CHC NHCHC
基
R1
R2
酸 顺 序
H
N C S: O
O
HN CH C NH CH C
H
N C S NH2
NH C O CH
O CH C R2
分
R1
R2
R1
析
N CS
O
NH 3+
ICH2CNH2 -OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
保 护 作用：这些反应可用于巯基的保护。
SS
S
S
S
S
胰岛素
SH
HSHO-CH2-CH2-SH
SH
SH
SH
SH
ICH2COOH SCH2C00HSCH2C00H
SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H
蛋白质测定的详细步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
蛋 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋
白 质
白质分子量之间的关系，即可确定多肽
一 链的数目。
级
结
构
的
测
定
B.多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须 蛋 先进行拆分。
白 质 一 级 结 构 的 测 定
B.多肽链的拆分。
蛋 几条多肽链借助非共价键连接在一起，
•
换)。 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的
位 对角线电泳技术进行分离。
置 的 确
• 然后同其它方法分析的肽段进行比较， 确定二硫键的位置。
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤蛋白质可是个神奇的东西呀！就像我们生活中的一个小秘密，要想揭开它的神秘面纱，了解它的一级结构，那可得一步步来。
首先呢，得把蛋白质从它所在的环境中分离出来，这就好比从一堆杂物中找出我们想要的宝贝。
然后，对它进行纯化，把那些杂质都去掉，让它变得纯净纯净的，就像把宝石打磨得亮晶晶的。
接下来，就是关键的一步啦，测定它的分子量。
这就好像要知道一个人的体重一样，得有个准数呀！可以用一些专门的方法，比如凝胶过滤或者质谱法啥的。
然后呢，把蛋白质切成小小的片段。
这就像是把一个大蛋糕切成小块，这样我们才能更好地研究它呀。
这一步可以用一些酶或者化学试剂来帮忙。
再之后呀，对这些小片段进行分析。
哎呀，就像我们仔细观察每一块小蛋糕，看看它们都有啥特点。
可以用各种方法，比如氨基酸分析呀，或者测序啥的。
最后呢，把这些小片段的信息整合起来，就像拼图一样，把它们拼成一个完整的画面。
这样，我们不就知道蛋白质的一级结构啦！
你想想看呀，这就好比我们要了解一个人的故事，得从他的点点滴滴开始拼凑，最后才能知道他完整的经历。
测定蛋白质一级结构不也是这样嘛！这可是个精细的活儿呢，需要我们耐心又细心地去做。
要是不这么一步步来，那可就像没头苍蝇一样乱撞啦，怎么能揭开蛋白质的神秘面纱呢？所以呀，这每一步都很重要，都不能马虎呢！我们得认真对待，才能真正了解蛋白质的奥秘呀！你说是不是这个理儿呢？
总之呀，测定蛋白质一级结构虽然有点复杂，但只要我们按照这些基本步骤来，一步一个脚印，就一定能成功的啦！让我们一起加油，去探索蛋白质的神奇世界吧！。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
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人们一般认为： 1 个分子SDS 可通过其烷基与蛋白质分子中
2 个氨基酸残基相结合
蛋白质化学一级结构测定
（三）氨基酸组成成分分析
为什么要求做氨基酸组成成分分析？
如果知道了某蛋白质的分子量，再 知道了它的氨基酸组成成分及其含量， 就能够大致了解到蛋白质分子中各种氨 基酸残基的个数。
蛋白质化学一级结构测定
蛋白质化学一级结构测定
• 肽链末端分析
通过肽链末端（N-端，或C-端）的分析，就 能够知道蛋白质分子中肽链组成的大概情况。
如： 测定胰岛素单体，发现有2个N-末端（Gly， Phe）和 2个C-末端（Asn，Ala），那么，就可 以推测胰岛素单体可能是有二条肽链内部通过 二硫键相联而组成的。
蛋白质化学一级结构测定
氨基酸组成分析的步骤
• 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括 3个步骤，即：
1
பைடு நூலகம்水解
在一定温度、酸 度等条件下，蛋 白质或多肽的肽 键断裂，水解成 游离氨基酸。
2
衍生
在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团
3
色谱
利用色谱对这些 氨基酸进行定性 和定量分析。
• 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或 摩尔比。
（一）游离N-末端测定 1 二硝基氟苯(DNFB)法
碱性条件下反应
水解 16-24 h DNP-氨基酸蛋白质化学一级乙结构醚测抽定 提后层析分析
碱性条件下反应
盐酸水解
DNS-氨基酸
可直接点样后通过聚酰胺 薄膜层析进行分析鉴定
蛋白质化学一级结构测定
注意：
DNS-Cl和DNS-氨基酸在酸性条件下水 解，会形成DNS-OH 和DNS-NH2，但在紫外 线照射下， DNS-氨基酸发出绿色荧光， 而DNS-OH发出蓝色荧光，DNS-NH2发出蓝绿 色荧光。
英国科学家 F. Sanger等人 用了10多年时间，于1954年首次完成了 牛胰岛素一级结构（51个氨基酸残基） 的测定工作。
蛋白质化学一级结构测定
美国科学家 S.Moore 和 W.H.Stein等人用了5 年时间，应用Edman反应和离子交换技术， 于1960年完成了牛胰核糖核酸酶一级结构（124 个氨基酸残基）的测定工作；
蛋白质化学一级结构测定
1965年，我国科学工作者成功合成了 牛胰岛素。
A、B链
蛋白质化学一级结构测定
胰岛素：
胰脏胰岛分 泌的激素
----由21个氨 基酸残基的A链 和30个氨基酸 残基的B链通过 3个二硫键连接 而组成的蛋白 质分子。
蛋白质化学一级结构测定
三聚体 六聚体
（2） 一级结构测定简况
--让蛋白质变性后再分离鉴定；
（2）以-S-S-连接的肽链 --加入β-巯基乙醇等还原剂后再分离鉴定
蛋白质化学一级结构测定
常 见 的 变 性 剂
蛋白质化学一级结构测定
十二烷基硫酸钠与十二烷基磺酸钠
两种物质都是阴离子表面活性剂，其中十二 烷基硫酸钠是常用的生化和免疫实验用试剂。
蛋白质化学一级结构测定
(3)与功能密切相关的氨基酸残基是不变的， 与生物进化相关的氨基酸残基是可变的。
蛋白质化学一级结构测定
一 概况
1、一级结构（初级结构） 主要指多肽链中氨基酸的排列顺序，但还包
括其连接方式以及二硫键位置。
2、一级结构的分析和测定
（1）确定多肽链中氨基酸的连接方式是肽键 结构的实验依据：
蛋白质化学一级结构测定
此外，DNS-Cl法中DNS-氨基酸比 DNFB法中DNP-氨基酸在酸性条件下水解的 稳定性要大得多 ！
蛋白质化学一级结构测定
3 异硫氰酸苯酯（PITC）法 （ Phenylisothiocyanate）
碱性条件下反应
25%三氟乙 酸水溶液
苯氨基硫甲酰多肽 （PTC-蛋白）
无水三氟乙 酸下裂解
（其他肽键 不断裂 ）
目前，有关测定方法更加 微量化、自动化、 快速化，在1个月内就能够完成100多个氨基酸 残基组成的蛋白质一级结构测定工作。
应用质谱分析技术来分析蛋白质序列可以做 到更微量化、快速化。
蛋白质化学一级结构测定
二 一级结构测定基本思路和程序
基本思路与程序： 分离纯化蛋白质， 特定位点降解多肽链， 分离小肽段 分析鉴定小肽段氨基酸序列， 排出所有小肽段氨基酸序列， 比较重叠（接头）肽氨基酸序列， 确定整个多肽链氨基酸序列。
级结构完全知道以后才能达到！
蛋白质化学一级结构测定
（二）蛋白质分子量和多肽链数目的确定
• 分子量的测定
分子量测定方法主要有： 凝胶过滤法 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （SDS-PAGE）等（测定的误差不超过10%） 离心沉降法
蛋白质化学一级结构测定
• 蛋白质分子中多肽链数目的确定
如何确定？ 有两种连接情况： （1）以非共价键联系的肽链
a 蛋白质水解产物是氨基酸
b 寡肽与蛋白质均呈现双缩脲反应
NH2 CO
碱性
NH CO
+ CuSO4
NH2
双缩脲
紫红色 络合物
蛋白质化学一级结构测定
c 人工合成寡肽和多肽的成功 1902年，合成二甘肽； 1908年，合成十八肽； 1953年，合成催产素：
Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly
乙酸乙酯抽提后层析法分析
苯基乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸） （ Phenylth蛋i白o质hy化d学a一n级t结o构in测a定mino acid ）
以上的方法都是化学法 能否用酶法测定 ？
第三章 蛋白质一级结构及其测定
蛋白质化学一级结构测定
2008年全国硕士生植物（动物）生理学 与生物化学入学考试题
生物化学部分
六 简答题
38 简述蛋白质的一级结构及其与生物进
化的关系
蛋白质化学一级结构测定
(1) 蛋白质一级结构是指蛋白质多肽链中氨 基酸残基的排列顺序及二硫键的位置。
(2) 不同物种同源蛋白质一级结构存在差 异，亲缘关系越远，其一级结构中氨基酸 序列的差异越大;亲缘关系越近，其一级结 构中氨基酸序列的差异越小。
蛋白质化学一级结构测定
三 测定前期准备工作 （一）分离、纯化蛋白质
提取以及纯化蛋白质的工作是一件费时、 费力、很不容易的工作。
通常情况下，要求杂蛋白含量不能超过3%。
蛋白质化学一级结构测定
（二）蛋白质分子量和多肽链数目的确定
为什么要测定一下蛋白质分子量 ？
蛋白质分子量如何进行测定？
• 分子量的测定 精确知道蛋白质的分子量，只有在其一