石蜡制片方法

(2) 由 FAA 固定的草本茎，每级停留 2 小时， 木本茎停 4 小时，较大的木材每级应延长为 8— 12小时。 (3) 脱水至纯酒精时，需更换二次，每次 30 分钟到1小时；材料大者，可多换一次。由95％ 换100％酒精时，瓶子上的塞子也应更换干燥的， 以免有水分渗入。 (4) 已制成的切片，在染色缸中脱水时，每 级停留时间约为3—10分钟。 (5) 脱水时应按顺序进行，级度不宜相差太 大，一般应按第1项所配各级浓度进行。
常用固定液的配方
（ 1 ） 福 尔 马 林 [Formalin ， 37—40 ％ 的 甲 醛 (HCHO)] 适 合 固 定 的 浓 度 ： 10 ％ 福 尔 马 林 (3.7—4％甲醛) （2）卡诺氏液(Carnoy's Fluid) 适用范围：适用于胚胎学、细胞学研究。 配方： (1) 纯酒精 3份 冰醋酸 1份 (2) 纯酒精 6份 冰醋酸 1份 氯 仿 3份
冲洗 目的 材料自固定液中取出后，须立即冲洗，使其 中含有的固定液全部除去，—直到洗净为止，否 则防碍染色和保存。 冲洗液的选择 冲洗液应依固定液的性质而定，一般水溶性 的固定剂用水来冲洗，酒精溶性的固定剂用相 同浓度的酒精冲洗。 冲洗的方法 1、水冲洗法 2、酒精洗涤法
脱水 脱水的目的 目的：除去组织中的水分，使组织变硬。 原因：水和石蜡是不溶的，经过脱水剂将 水分脱净，透明剂透明后，才能进入包埋阶段。 脱水不干净，影响制片效果，甚至完全失败。 脱水剂及其脱水方法 脱水剂 最常用的脱水剂为酒精。此外还有丙酮、 正丁醇和叔丁醇等。
透明 透明的目的 主要目的： 1 、替代组织中的酒精或丙酮， 使石蜡能很顺利的进入组织中。 2 、增强组织 的折光系数。3、能和封藏剂混合进行封藏。 透明剂的特性 必须具有既能与脱水剂相溶又能与包埋剂相 溶的特性。 透明剂的种类 常用的明透剂有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、 香柏油和苯胺油等，二甲苯为最常用的透明剂。
固定液的种类和常用固定液的配方 固定液的种类 分为两大类：简单固定液和混合固定液。 1.简单固定液又称单纯固定液 就是用一种化 学试剂作为固定液。种类有：乙醇、福尔马林、 醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、升汞和锇酸等 八种。 2.混合固定液 就是用几种化学药品，按一定 的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点 互相弥补，因此可产生较好的效果。
透明的方法 为了避免组织收缩，在纯酒精或丙酮脱水以 后，必须经过几个级度，逐渐置换，最后移入 二甲苯中。酒精与二甲苯混合的比例列表如下：
级别
ⅠHale Waihona Puke Baidu
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
纯酒精
二甲苯
2/3
1/3
1/2
1/2
1/3
2/3
0
1
在透明时应注意的问题
1.如材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去， 因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现 空洞。 2.切片内留有微量水分，在封藏以后，就会发 生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见 许多密集水珠把组织掩盖，影响观察。 3.二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染 色缸中取出封藏，手续要敏捷，不宜久置，否 则待二甲苯挥发干净后，组织就变硬发白。
4.二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿 度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周 缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在 封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水 气侵入，出现白色云雾状。 5.二甲苯必须保持无水、无酸。若用一、 二滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即 表示其中已含有水分，不能再用。
浸蜡 将石蜡浸入整个组织的过程称为 浸蜡。 包埋剂 包埋所用的各种石蜡，其熔点约在 50— 60℃之间。 石蜡的选择方法 1. 依所包埋的材料不同而异，软的材料 用软石蜡，硬的材料用硬石蜡。一般动物 材料最常用的石蜡熔点为 52—56℃，植物 材料用的石蜡熔点为54—58℃。
（3）福尔马林——醋酸——酒精混合液(FAA) 适用范围：适用于植物各器官解剖结构的观察， 但不适于染色体观察研究。 配方： 50％或70％酒精 90毫升 冰醋酸 5毫升 福尔马林 5毫升 处理：1、一般柔软材料，可用50％酒精。 2、固定时间最短需18小时，也可无限期延长。 3、冲洗时材料可直接换入 50％或70％酒精中洗一、 二次，木质材料在流水中冲洗 48 小时，并在酒精 (50％)和甘油溶液(1：1)中浸2、3天，使它软化。
切片
蜡块的分割、整修与固着 1.选取所要切片的材料，用单面刀片从包埋的 石蜡块上切割下来，注意不可损伤所包埋的组 织。 2.确定切面的方位，用刀片将石蜡的四面作初 步的整修。 3.取一块台木，用镊子夹取少量的碎蜡放于台 木上，后点燃酒精灯，烧热镊子将台木上的石 蜡熔化，迅速将蜡块粘在台木上。 4.再用镊子夹取少许碎蜡放在蜡块四周，后在 酒精灯上将镊子烧热，迅速将蜡块四周的碎蜡 熔化烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。
石蜡的清净方法 1. 将石蜡放入锅中加热到开始冒白烟后
为止，使其中的水分及挥发性杂质逐渐被
蒸发掉。 2. 热过的石蜡放在温暖处慢慢冷却，这 样就可使其中的灰尘等杂质颗粒沉下去。 3. 待石蜡的表面已凝为固体时，即可慢
慢地将上面的石蜡倒在纸匣或其它容器中，
把下面沉淀的杂质留下来。
浸蜡方法 (1)将组织留在透明剂中，在透明剂上轻轻倒上 一层已熔化的石蜡，其分量比例约为3：2。 (2) 倒入的石蜡即凝成固体，然后将材料放在 35—37℃之间的熔蜡炉内，经一、二天到石蜡不 再继续熔化时为止。 (3) 将材料移入 56—60 ℃的恒温箱中停留 2—5 小时，待石蜡融化后换纯蜡。 (4)换二、三次新鲜纯石蜡，使留在组织内的透 明剂全部排除后即可包埋。
脱水方法 1.配制下列各级浓度的酒精： 15 ％， 35 ％， 50 ％， 70 ％， 85 ％， 95 ％， 100 ％。 2. 一般经水洗的材料，脱水可自 35 ％开始， 柔弱的材料自 15 ％开始，若用酒精洗涤，则可直 接移入50％或70％酒精中继续脱水。 3. 在每级中停留的时间，依材料的大小、性 质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解 性而定。一股的标准是： (1) 如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大 小的材料，每级停留约30分钟到1小时。
蜡块切修
将蜡块粘在台木上
整修蜡块时，应注意的问题 1. 应将蜡块的前后、左右四个面，两两 修成平行的面，这样切成的蜡带就成直线， 如果两面不平行，切成的蜡带将弯曲。 2. 将蜡块四周多余的蜡修掉，但注意不 要太靠近组织，特别是不要将组织露在外 面。
切片 1. 将粘有蜡块的台木装在切片机的装物部位 上。 2.检查刀口是否锋利，是否有缺口。 3.调整刀片的角度，一般以5—8℃为宜。 4. 蜡块切取面和刀口必须平行，并使刀口恰 好邻近蜡面，切忌蜡块超过刀口。 5. 调节切片厚度，一般石蜡切片厚度为 8— 10微米。 6. 切片时用力要均匀，速度要适宜。到蜡带 长度达到 20—30cm 时，可用毛笔挑起放于白 纸上备用。
纸合的折叠方法
3.在脸盆内放入冷水备用。 4.点燃酒精灯，准备好1把镊子，1支拨针。 包埋的操作过程 1 、右手持镊子，左手从恒温箱中取出盛满熔 化石蜡的小瓶，并随手将恒温箱的门关闭，立即 将小瓶中的石蜡和材料一起倒入包埋用的纸盒中， 如果纸盒中蜡的量少，可再加入适量的蜡。 2 、材料倒入纸盒后，将镊子在酒精灯上烧热， 将材料分开，使材料之间保持一定的距离，并注 意材料的方向。
切片
切片过程中常见现象分析 1、蜡片卷曲，主要由于： a．切片刀不锋利 b．切片刀的角度不正确 c．切片太薄或太厚 d．石蜡太软或太硬(与温度有关) e．蜡块中的材料不在中央 2、材料与蜡片分离 石蜡温度与材料温度不一致。 3、蜡片上有条纹，是因为切片刀上有缺刻。 4、蜡带不成直线，是因为蜡块上下不平整。 5、蜡片破碎不成蜡带而吸附于切片刀上，由于材 料过脆与切口摩擦产生静电的原因。
2.如果需要切很薄的片子(4微米以下)， 可用熔点58—60℃的石蜡，较厚的则用
熔点52—54℃的。
3.根据当地当时的气候条件，夏天气
温高时，通常用56—58℃的蜡，冬天气
温低时用54—56℃的蜡。
石蜡
性质好的石蜡，必须具备的条件 (1)熔点已知。 (2)结构细致，光滑而均匀。 (3)无灰尘、水分及挥发性物质等。 鉴定石蜡品质优劣的方法 可先将石蜡熔化，倒入纸匣中凝成蜡块，如品 质优良，则具备下列特点： (1)无气泡，无不透明的点子和裂痕。 (2)蜡块断裂后，其断裂面不呈颗粒状。 (3)如果将它切成薄片，不会碎成细粒。
（4）纳瓦兴氏液(Navaschin’s Fluid) 适用范围：植物组织及细胞学的研究 配方： 甲液： 10％铬酸 15毫升 冰醋酸 10毫升 蒸馏水 75毫升 乙液： 福尔马林 40毫升 蒸馏水 60毫升 在使用之前，才将甲、乙两液等量混合。材料 经固定之后可在此液中长期保存。 处理：固定时间为24-48小时，固定后可直接在 蒸馏水中洗几次，再继续脱水。
包埋中出现的问题及其解决办法 问题 包埋后的石蜡块应为均匀的半透明状态， 但有时出现白色混浊的结晶部分，这样在切片时 就有妨碍。 原因 1. 脱水不干净。 2. 组织内部或石蜡中混 有透明剂。3.石蜡本身品质不良。4.纸盒中周围 的石蜡先成凝固状态，中部的石蜡凝固较晚。5. 石蜡冷凝得太慢。 解决办法 属于前三个原因者，应在包埋之前就须注意。 属于后二个原因者，应将包埋块再投入纯蜡中熔 化后重新包埋。
3 、将拨针烧热，沿着纸盒的边缘以及材料 的周围轻轻移动，目的是将蜡中的气泡赶走 和使蜡凝固时较均匀。 4 、将标签插入纸盒的边缘，并将有字的一 端露在外面。 5 、轻轻将纸盒平放在脸盆的水面上，待纸 盒内石蜡的表面已凝固，即可将纸盒沉入水 中，使包埋块迅速冷却。 6、纸盒在水中经 30分钟到1小时后即可取出， 将纸盒打开取出包埋的蜡块备用。
浸蜡过程应注意的问题 1. 尽量保持在较低温度中，以石蜡不 凝固为度。 2. 力求在最短时间内完成石蜡的浸透 过程。因为温度过高或时间过长都会引 起组织变硬、变脆、收缩等，影响制片 效果。
包埋
被石蜡浸透的组织连同熔化的石蜡，一起 倒入纸盒内，并投入冷水中，使它立刻凝固 成蜡块的过程。 包埋前的准备工作 1.摺包埋用的纸盒并写好标签。 2.检查恒温箱中所熔的新鲜石蜡是否够 用。
卡诺氏液的处理方法和特点 处理：固定时间为12—24小时，也可缩短。 根尖可固定 15 分钟。花药固定 1 小时，子房可 固定 12—24 小时。固定完毕可用 95 ％或纯酒精 洗涤，换二次，经二甲苯与纯酒精等量混合液 过渡，二甲苯透明两次，就可进入石蜡中浸蜡。 如果不立即制片时，可转入70%酒精中保存。 特点：固定液穿透力既强又快，纯酒精固 定细胞质，冰醋酸固定染色质，并能防止组织 由酒精引起的高度收缩与硬化。