westernblot结果条带分析
Western blot结果异常原因分析及对策(个人总结)
结果异常
原因
对策
1.假阴性，不出现 ⑴一抗、二抗等不匹配
⑴重新订购试剂，认真选取一抗与组织
蛋白条带或者蛋
种属，并设置内参。
白条带很弱
⑵一抗或/和二抗浓度低
⑵增加抗体浓度，延长孵育时间
⑶封闭剂或无关蛋白与一抗或二抗有交叉反应 ⑶封闭用温和去污剂，如TWEEN 20，
⑷SDS-PAGE 电泳上样 前， 煮沸 10
min，以增强蛋白质解聚变性
⑸蛋白样本降解
⑸新鲜制备标本，使用蛋白酶抑制剂
3. 背 景 非 特 异 染 ⑴封闭不充分
⑴延长封闭时间，更换合适的封闭剂
色过强
（脱脂奶粉，BSA，血清等）
⑵一抗浓度过高
⑵增加一抗稀释倍数
⑶抗体孵育温度过高
⑶4℃孵育
⑷二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应
（无关蛋白中含有与待测抗原结构类似多肽（共 或更换封闭剂（脱脂奶、BSA或明胶）
同抗原表位），与特异抗体发生交叉反应）
⑷一抗不识别目的物种的靶蛋白
⑷检查说明书，或做 ClustalW 比对，
设阳性对照
⑸样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低
⑸模索条件，设置阳性对照，增加标本
（抗原无效）
上样量，样本制备时使用蛋白酶抑制剂,
4. 背景出现不均 匀污点、斑点
5. 转膜不充分
⑴转膜时有气泡或抗体分布不均 ⑵抗体与封闭剂结合 ⑶镊子或玻璃平皿污染 ⑷膜湿润不够 ⑸标记膜采用不规范笔 ⑴膜没有完全均匀湿透 ⑵靶蛋白分子量小于 10,000 ⑶靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲 液 pH 值 ⑷甲醇浓度过高 ⑸转移时间不够Thick gel
⑷设置二抗对照(不加一抗),降低二抗
(优质医学)western-blot-蛋白质的电泳分析
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
双缩脲法
灵敏度低
紫外吸收法 较为灵敏
Folin－酚试
剂法
灵敏度高
（Lowry法）
考马斯亮蓝 法 (Bradford 法)
灵敏度更高
中速， 20~30分钟
多肽键＋碱性Cu2＋ 生成紫色络合物
硫酸铵、Tris缓 冲液、某些氨基 酸
用于快速测定，但不太 灵敏；不同蛋白质显色 相似
曝光时间过短延长曝光时间底物延长底物孵育时间76原因解决办法底物太灵敏选择合适的底物交叉反应选择单克隆抗体抗原浓度太高降低抗原浓度抗体浓度太高降低抗体浓度曝光时间太长减少曝光时间77现象原因解决办法荧光萃灭快二抗浓度太高膜干燥降低二抗浓度保证膜的湿润度条带内出现不显影圆点转膜过程中有气泡条带不完整底物孵育不均匀用保鲜膜均与孵育底物反影白色条带黑色背景hrp浓度过高降低二抗浓度散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀78条带出现微笑的上扬形状表示胶没有混匀或者电泳时散热不均匀电压过高缓冲液浓度过高
快速，5～ 10分钟
慢速，40～ 60分钟
蛋白质中的酪氨酸 和色氨酸残基在 280nm处的光吸收
双缩脲反应；磷钼 酸－磷钨酸试剂被 Tyr和Phe还原
用于层析柱流出液的检
各种嘌吟和嘧啶； 测；核酸的吸收可以校
各种核苷酸
正；不消耗样品，测定
后样品仍能回收利用
硫酸铵；Tris缓 冲液；甘氨酸； 各种硫醇
BCA法
灵敏度非常高
较快速40分 钟内
在碱性环境下蛋白 质与Cu2+络合并将 Cu2+还原成Cu1+
螯合剂；略高浓 度的还原剂
抗干扰能力强，蛋白不 可逆的变性
western-blot实验时，胶片上条带很弱是什么原因？
western-blot实验时，胶片上条带很弱是什么原因？
条带弱的原因可能有以下几个方面：
①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。
可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，如Enlight-plus。
②. 蛋白没有充分转移到膜上。
转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。
③. 抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活。
可考虑更换效价更高的抗体，或提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交实验确定抗体活性。
④. 曝光时间太短。
可适当延长曝光时间。
western blot操作技巧及常见问题分析
Western Blot 操作技巧及常见问题分析汉恒生物提供病毒包装服务你的Western Blot结果是否出现过非特异性条带？条带变窄变宽了？条带哭了条带笑了？信号太弱了？等情况，所以现在需要提升一下你的Western Blot结果的颜值了！如何使电泳条带漂亮些？电泳注意事项●为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳●如用预染Marker，当要分辨的蛋白到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，结束电泳●电泳用恒压模式能保持蛋白质恒定的电泳迁移率，而电压先低后高可使样品更好的进入凝胶。
实际电压可根据时间安排调节，电压高时电泳发热大，电压低于50V时小蛋白容易弥散，凝胶分辨率会下降。
影响跑胶的质量，有以下因素：●胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水或饱和正丁醇隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。
●聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
●电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。
电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。
●样品，在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素，可以克服由于样品溶解不佳引起的纹理和拖尾现象。
●减少上样量可以避免由于加样量太多引起蛋白带过宽或与邻近泳道的蛋白带相连。
WB常见问题分析高背景原因解决办法蛋白浓度过高降低抗体浓度膜的污染使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操作，勿毁损膜漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积封闭液不适合比较尝试不同封闭液封闭不完全延长封闭时间（可4℃过夜）抗体浓度过高优化降低一抗、二抗浓度曝光时间过长缩短曝光时间缓冲液污染使用新配制缓冲液信号弱或无信号原因解决办法抗原量不足增加上样量，使用阳性对照；减少漂洗，可将TBST改为TBS蛋白质在储存过程中降解重新制备样品转膜不完全转膜后确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、保证电极正确装配、控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。
Western blot 条带判定和图片处理标准流程
Western条带判定的标准流程
1、确认目的蛋白的理论分子量
2、通过Uniprot，确认蛋白是否有信号肽，酶切位点，异构体，糖基化修饰位点（一个糖
基化修饰能增加5KDa左右），磷酸化几乎不影响分子量大小。
3、进行肽链氨基酸的分子量判定：
计算出未修饰的全长肽链的分子量（uniport中的有），即理论分子量
计算分子中修饰基团的分子量。
目的蛋白实际分子量=异构体理论分子量-信号肽+糖基化位点数*5KDa，得到一个最大的分子量。
6、最后一步，将实验误差10%考虑进去，即得到一个蛋白的分子量对应的位置范围。
例如实际分子量为50kda，这目的蛋白实际分子量在45-55kda之间，均可接受。
7、最终每个指标的目的蛋白大小参考abcam、cst、novus、abcam4个公司做的实际分子量大小，如无较大出入则可，和别家公司有较大出入，则需进一步验证自己做出来的条带是否正确，通过阴性，阳性对照，KO实验，证明自己做的条带是真实的，即可上传官网。
1.在image lab中将原始图片调对比度，和亮度后，使图片背景干净，条带清晰，有微弱泳道痕迹即可，导出图片
2放入ppt中，剪切成大小合适，字体均用Arial 11号，黑色，短线均用0.6cm，黑色图片边框0.75磅，黑色，图片高度，宽度以目的条带为核心，上下无杂带尽量保留全maker。
3.图片另存为jep格式，A2016对应的货号为K0002354P,图片命名为K002354P-EIF5A-1/1000.。
western-blot条带分析及解决方法
持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。
Western Blot(WB)分析法
Western Blot（WB）分析法实验目的检测目的蛋白的表达情况。
实验原理Western Blot（WB）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，例如硝酸纤维素薄膜（NC膜），固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤（一）蛋白胶的配制根据相关蛋白胶配制的说明书及目的蛋白的大小配制相适应浓度的分离胶和浓缩胶。
（二）跑胶浓缩胶的电压为80 V，分离胶的电压为120 V。
跑完胶后可根据原核或真核表达来选择是否进行染色，原核表达量高，可通过考马斯亮蓝染色观察表达情况，真核不易看出。
（三）转膜1. 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，本实验室采用电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
前者操作容易，转移效率高，但转移时间长；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
2. 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western Blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western Blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC 膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
Western Blot 结果条带全面分析
Western Blot 结果条带全面分析Q1. 啥也没有[原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
[解决办法]：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
Q2. 高背景[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够[解决办法]：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
Q3. 非特异性条带[原因]：一抗非特异性与蛋白结合[解决办法]：更换一抗[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
Q4. 条带中出现边缘规则的白圈[原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。
[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡[经验]：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项 -回复
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项-回复西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项引言：蛋白质是细胞功能的重要组成部分，对于研究蛋白质的表达和功能非常关键。
西方博LOT（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于分析特定蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的大小和相对丰度以及判断蛋白质的分子量。
本文将介绍西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项。
一、实验结论：1. 确定目标蛋白质的存在与否：在Western blot实验中，通过探针的特异性结合，可以确定目标蛋白质在待检样品中的存在与否。
如果探针与待检样品中的蛋白质结合，会出现特异的蛋白质带，从而可以确定目标蛋白质的存在。
2. 确定目标蛋白质的大小和相对丰度：通过Western blot实验的结果，可以确定目标蛋白质的大小和相对丰度。
在蛋白质电泳分离后，较大的蛋白质会相对较靠近电极负极，较小的蛋白质会相对较靠近电极正极。
通过与已知分子量蛋白质标准曲线的对比，可以确定待检样品中目标蛋白质的分子量。
3. 分析蛋白质的表达水平：通过Western blot实验的结果，可以分析目标蛋白质在不同样品中的表达水平。
通过比较待检样品中蛋白质带的强度，可以初步判断蛋白质的相对表达量。
进一步，可以使用图像分析软件对蛋白质带的强度进行定量分析，获得更精确的表达量数据。
二、实验注意事项：1. 样品处理：西方博LOT实验的样品处理是关键的一步。
样品的存储和处理方式可能会对实验结果产生影响。
为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样品应尽快冷冻保存，并在实验前严格遵循相关处理方法。
2. 磷酸盐缓冲液的配制和pH调整：磷酸盐缓冲液是Western blot实验中的关键试剂，用于制备电泳缓冲液、转膜缓冲液和洗涤缓冲液。
正确配制磷酸盐缓冲液的浓度和pH值是确保实验的准确性和稳定性的重要因素。
3. 蛋白质的电泳分离和转膜：蛋白质的电泳分离要求严格的电泳条件。
western-blot条带分析及解决方法模板
*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
干货▎ImageJ分析WesternBlot蛋白条带灰度值
干货▎ImageJ分析WesternBlot蛋白条带灰度值聊点学术，一键关注“你已经是个成熟的条带了，要学会自己分析！”“连Western blot都没学好，又让我学Image J，我......”This is the dividing line.Image J分析蛋白条带灰度值首先解释一下，为什么要分析灰度值？灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。
采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。
然而胶片扫描后为蓝色背景、黑色条带，这并不是单纯的黑灰白颜色。
因此，我们首先得在Photoshop 中将整张图片去色，使彩色图片变成黑白图片，形成近灰色背景、黑色条带的图片类型。
此时，条带的深浅和面积综合代表着蛋白的量。
灰度值分析自然就成为我们的首选。
延伸说一下，免疫组织化学染色(IHC)结果本身为近白色背景、棕黄色阳性表达，这时我们就不能直接用灰度反映阳性表达强弱了，而是积分吸光度，也就是咱们常说的平均光密度(IOD)。
如果你真的想用灰度计算IHC结果，显然你需要将图片转为灰度图再计算。
此处不表。
分析图文步骤如下：Image J软件界面↓1. 图片转换为黑白图：首先使用Photoshop打开胶片扫描图片，点击“图像>调整>去色”，将彩色图片转化为黑白图片，并使用裁剪工具将目标条带裁剪至合适大小后另存图片。
2.打开Image J软件：2.1.打开图片文件：File>Open；将图片转化为8bit类型：Image>Type>8-bit。
(此步骤的目的是为了将图片的每个像素用8bit表示，这样的话，整个图片的灰度将分为256个级别，即黑、灰、白的像素模式；若保留原始的16bit格式或RGB格式，图片灰度级别会呈指数增长，并有其它颜色混入，造成计算误差。
)2.2.将整张图片背景灰度均一化，消除图片背景影响：Process>Subtract Background，默认数值为50即可。
Western Blot常见问题及解决方法
Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。
然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。
•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。
•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。
2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。
•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。
3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。
•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。
•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。
4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。
•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。
5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。
•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。
6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。
•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。
•检查显影液是否过期或存在质量问题。
7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。
•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。
•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。
8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。
WesternBlot结果条带分析
Western Blot结果条带全面分析1.空白原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
2.高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
3.非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗4.条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡5.出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭结束之后要洗。
6.条带拖尾原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。
7.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。
8.某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。
9. 条带呈哑铃状原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用10.最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。
（2）蛋白质降解。
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。
原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
（4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。
如何用Imagelab分析WesternBlot条带
如何用Imagelab分析WesternBlot条带豆子老师完全放开了，今天写的帖子是手把手系列的，她十分适合做教导主任。
技能需要一个个掌握，等到大部分技能都写完，我们会尝试如何把生信和实验结合起来，从无到有，提出科研假说，设计课题，完成课题，发表文章，申请基金，拿到基金探索新的课题，形成科研的闭环。
这周我们来探讨一下Image lab，Image lab也很好用，但是操作比image J操作复杂一些，更致命的一点就是Image lab只能识别自己曝光的图，也就是scn格式的图，tif格式并不能识别，而我们Western的曝光仪器并不是，所以我用的相对比较少，只是以前觉得所有的软件都是有用的，看见别人用，都觉得好就都下载了下来。
所以这次的图也是别人赞助的，感谢YY的友情赞助。
方法一：1.首先打开你要分析的数据，一般是scn这个格式才能打开，也就是说用这个软件曝光的才能用这个软件来统计。
这个是从别人那里拷来的图，非常感谢支持YY的支持。
2.选择左侧的体积工具，选择矩形3.用鼠标圈中你分析的条带U14.然后复制这个矩形，粘贴八个，我这里就粘贴5个了，只是举个例子，操作都是一样的5.分别圈住所有的条带6.然后点一下分析表，就出现了下面的表格。
7.然后选择表格上面最右侧的按钮，导成Excel文件8.一般背景深的话，选调整体积徒手圈也可以，但是手太抖，我每次都画不好。
这样可以知道大概的趋势。
也可以选择哪一个泳道的条带为1，双击该矩形，会出现“体积类型”、“数量”、“参考体积”等选项，打勾“参考体积”，确定。
9.然后点击“分析表”，各种定量结果会显示出来。
同样选择从左数第四个按钮“将分析表导出至文件”，选择相对定量。
方法二：1.首先打开Image lab，打开一张Image lab电泳图片。
点击泳道和条带，找到泳道下手动功能，输入泳道号，我们一共有8个条带，输入82.在“所有泳道”功能下面可以选择调整泳道框的大小。
Image J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析
Image J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析WB是研究蛋白表达的一个经典方法。
对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。
一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。
除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。
而且Image J是开源性质的免费软件，可以在其官网直接下载使用。
对Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析和光密度分析。
灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。
灰度值越小物体颜色越深。
光密度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度IO与该光线通过溶液或物质后的透射光强度Ib比值的对数OD=log（IO/Ib）；图像分析中，入射光和透射光强度分别被切片上最亮区域的平均灰度值和待测目标平均灰度值取代，则图像分析系统的光密度值=log（切片标本最亮区域的平均灰度值（g0）/待测目标的平均灰度值（g））。
光密度值越大，物体颜色越深，阳性物质相对含量越大。
对于灰度值来说，切片标本制作时染色时间长短，以及测量时显微镜照明光源电压的大小对其影响很大。
而光密度是一个比值。
是通过计算一张切片标本最亮区域的平均灰度值与该切片标本中待测目标的平均灰度值的比值，再根据数学公式计算而来的，所以受切片标本染色时间长短及照明光源电压关系很小。
然而有研究实践显示，灰度值与光密度值二者之间存在着线性关系，都可以用来进行WB定量分析。
同样，Image J软件进行WB条带定量分析时也存在两种方法，此处只列举一种方法，具体步骤如下。
1、下载安装，并打开Image J软件。
2、导入WB条带图片。
File→Open→弹出对话框→选择文件夹→找到WB条带。
3、把图片转化成灰度图片：Image→Type→8-bit。
这时WB图片将会随之改变。
ImageJ和Graphpad如何对WesternBlot条带灰度分析【干货】每日生物评论
ImageJ和Graphpad如何对WesternBlot条带灰度分析【干货】每日生物评论摘要手把手教你利用Image J和Graphpad软件对Western Blot条带进行灰度分析和柱状图构建，看艾美捷干货分享。
WB是研究蛋白表达的一个经典方法。
对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。
一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。
除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。
而且Image J是开源性质的免费软件，可以在其官网直接下载使用。
对Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析和光密度分析。
灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。
灰度值越小物体颜色越深。
光密度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度IO与该光线通过溶液或物质后的透射光强度Ib比值的对数OD=log（IO/Ib）；图像分析中，入射光和透射光强度分别被切片上最亮区域的平均灰度值和待测目标平均灰度值取代，则图像分析系统的光密度值=log（切片标本最亮区域的平均灰度值（g0）/待测目标的平均灰度值（g））。
光密度值越大，物体颜色越深，阳性物质相对含量越大。
对于灰度值来说，切片标本制作时染色时间长短，以及测量时显微镜照明光源电压的大小对其影响很大。
而光密度是一个比值。
是通过计算一张切片标本最亮区域的平均灰度值与该切片标本中待测目标的平均灰度值的比值，再根据数学公式计算而来的，所以受切片标本染色时间长短及照明光源电压关系很小。
然而有研究实践显示，灰度值与光密度值二者之间存在着线性关系，都可以用来进行WB定量分析。
同样，Image J软件进行WB条带定量分析时也存在两种方法，此处只列举一种方法，具体步骤如下。
1、下载安装，并打开Image J软件。
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Western Blot结果条带全面分析
1.空白
原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
2.高背景
原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
3.非特异性条带
原因：一抗非特异性与蛋白结合
解决办法：更换一抗
4.条带中出现边缘规则的白圈
原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡
5.出现黑点和黑斑
原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合
解决办法：封闭结束之后要洗。
6.条带拖尾
原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长
解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。
7. 出现非均一性背景
原因：膜可能曾经干过
解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。
8.某个条带变形
原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒
解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
另外配胶用的水，SDS，Tris 缓冲液要注意不要有杂质。
9. 条带呈哑铃状
原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一
解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用
10.最边缘条带弯曲
原因：电泳电流不均一
解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔
其他问题
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。
（2）蛋白质降解。
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。
原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
（4）整个条带呈“ ︶” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。
（5）整个条带呈“ ︵”：凝胶左右两头没有凝固好
（6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。
（7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒
（8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。
（9）在分离胶中跑不动：Tris-HCl PH值不对，或者忘记加SDS。