酶联免疫吸附试验结果
影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法
影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法摘要】酶联免疫吸附试验是免疫酶技术中固相酶免疫测定的一种技术。
ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但是操作中的各个环节对试验的检测结果影响较大，如不注意排除干扰因素，有可能导致显色不全、花板等现象。
现将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
【关键词】酶联吸附试验影响因素【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）09-0369-021 试剂的因素1.1 试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。
虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。
更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。
使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。
因此。
选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
1.2 试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
因此，在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。
2 样本的因素2.1 标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。
2.2 标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使实验出现非特异性显色。
因此，ELISA检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，5 d之内应4℃保存，1周后检测应低温冻存；同时，收集标本采用无菌试管，可防止标本的污染。
酶联免疫吸附试验(ELISA)测定错误结果的原因分析
ELISA测定错误结果的原因分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。
ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。
血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种：1．内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。
常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
（1）类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。
但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。
因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。
1实验室操作人员的基本素质因素实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。
因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。
如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。
其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。
还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。
有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。
所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。
2标本处理因素实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。
提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。
从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。
3操作过程的影响因素3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。
3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。
加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。
3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。
不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。
3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。
酶联免疫吸附试验
这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化 合物中测定某一特定物质，而不需要先分离待测物。
2，敏感性
在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法 的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感 度约为5~10 μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和 浊度法的敏感度与酶反应相仿。 而酶标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍， 达ng/ml水平。
聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作 工艺的差别，各种产品的质量差异很大， 因此，每一批号的ELISA板在使用前须事 先检查其性能。
常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为 10ng/ml） 包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人 IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测 每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8 左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均 数之差，应小于10%。
这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量， 而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然 后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
生物素-亲和素酶联吸附试验（BA-ELISA）： 待检抗原与固相抗体反应后，再加入生物素化 第二抗体，形成抗原-抗体-生物素化第二抗体复 合物，然后与酶标亲和素作用，并通过底物而 显色。
解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲 和层析法来提纯抗体或抗原（亲和层析纯抗体）。
最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体 复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最 合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗 体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。
特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇 与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构 和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有 高度的特异性。
酶联免疫吸附试验两次血液检测结果符合性比较分析
的不 符 合 性 。现 将 ２ １ 本 站 无 偿 献 血 者 血 液 检 测 两 次 检 验 ０ ０年 结果进行统计分析 ， 道如下 。 报
振 荡 器 、 ｉｏｐ 育 箱 、 ＡＭＥ ６ ２ 全 自动 后 处 理 系统 。 Ｈｅ ｌｈ孵 ｄ Ｆ １／０ １３ 方 法 采 用 上 述 两 种 不 同 产 家 的 试 剂 对 ＨＢ Ａ 、 一 ． ｓｇ抗
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发 生了变化 ， 由此 引发 疾 病 谱 的 变 化 ， 性 非 传 染 性 疾 病 成 为 慢 危 害人 们 健 康 的 主 要 疾 病 ， 中 高 血 糖 、 血 脂 呈 持 续 上 升 趋 其 高 势 。本 组 资 料显 示 血 脂 、 糖 各 项 指 标 异 常 比率 男 性 均 高 于 女 血 性 ， 原 因可 能 是 男 性 具 有 不 良生 活 行 为 因 素 远 过 于 女 性 ， 其 包
酶联免疫吸附剂测定ELISA实验报告及实验讨论
ELISA实验报告一、实验名称酶联免疫吸附测定二、实验原理在抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物中加入相应酶的底物，反应生成有色产物，然后借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。
待测抗体的定量与有色产生成正比。
三、实验材料与试剂1.抗原Human IgG (0.025mg/ul),一抗Rabbit-α-human IgG,二抗辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
2.包被液，PBS溶液，封闭液，Tween-20 0.5mL蒸馏水稀释至100mL，邻苯二胺溶液，中止液。
3.聚苯乙烯微量细胞培养板，酶联免疫检测仪，取液器，烧杯，稀释用带凹槽的平板。
四、实验步骤1.将用包被液稀释好的Human IgG加入到培养板以B2至D10为对角线的矩形区域中，200ul/well，B11 C11 D11处不加抗原作为对照，然后在37℃下温育30分钟。
2.取出平板，倒尽液体，然后向B2至D11的矩形区域每个孔中加入200ul的PBS 洗涤液，然后倒掉，如此洗涤3次。
再将平板倒置在吸水纸上，使孔中液体流尽。
3.在B2到D10的矩形区域每个孔中加入0.5﹪的BSA溶液200ul，然后在37℃条件下温育30分钟。
4.Washing with PBS 200ul/well for three times。
具体步骤同步骤2。
5.将first antibody Rabbit-α-human IgG稀释成不同的浓度梯度，200ul/well 按下表加入到平板中。
其中B10 C10 D10不加一抗作为对照，然后incubate at7.在B2到D11的矩形区域中加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200ul，在37℃下温育30分钟。
8. Washing with PBS 200ul/well for three times。
具体步骤同步骤2。
9.向平板B2到D11的矩形区域中加入底物邻苯二胺溶液200ul/well。
10. 向平板B2到D11的矩形区域中加入终止液，每孔50ul。
ELISA酶联免疫吸附试验报告
大学实验报告酶联免疫吸附试验学院：专业：姓名：学号：一．实验原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。
基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。
当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。
颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。
因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。
本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
图1 ELISA实验原理示意图二．实验材料BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H2SO4。
三．实验方法1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。
第二天取出，用PBS洗涤3-4次。
2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。
3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。
4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H2SO4终止反应。
5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。
酶联免疫吸附实验
酶联免疫吸附实验一、实验目的1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。
2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。
3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛的杂交瘤细胞株。
4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。
二、实验原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。
这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。
在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。
三、实验试剂与器材1、实验试剂在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M BOTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司；碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司；羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司；实验用水为重蒸去离子水2、实验器材U-3000紫外扫描仪日本岛津公司；550 型酶标仪美国Bio-Rad 公司；HI9321酸度计美国Hanna 公司；AE260 电子天平德国Mettler公司；DK-8D电热恒温水槽上海一恒科技有限公司；2-93自动双重纯水蒸馏器、93-3定时恒温双向磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂；1201 超净工作台美国Forma Scientific公司；DMI3000B倒置生物显微镜德国Leica 公司；GS-15R多功能冷冻离心机美国Beckmen公司；3701型CO2培养箱美国Precision 公司；96孔、24 孔细胞培养板美国Costar 公司；96孔酶标板浙江玉环芦蒲塑化器械厂。
elisa酶联免疫吸附实验报告
elisa酶联免疫吸附实验报告一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
(仅供参考)ELISA(酶联免疫吸附测定)实验报告
ELISALin Chengyu Bio 04 2010030007Experiment Date: 2012-03-12 Submitting Date: 2012-03-211Introduction1.1Background informationELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is a solid-phase assay for antibodiesemploying ligands labeled with enzymes which is widely used for immunological assays.This technique can be applied to detect antigens or antibodies for qualitative orquantitative purpose. Since enzyme reactions are very well known amplificationprocesses, the signal is generated by enzymes which are linked to the detection reagentsin fixed proportions to allow accurate quantification.11.2Major principlesFigure 1 Schematic diagram of ELISA2Figure 2 Procedure of indirect ELISA3As shown in Figure 1 & 2, the general procedure of indirect ELSIA is to: incubate theplate well with antigen, wash off unbounded antigen, incubate with 1st antibody, washoff unbounded 1st antibody, incubate with labeled 2nd antibody, wash off unbounded 2ndantibody, incubate with enzyme substrate solution, and detect optical density or otherindex showing enzyme activity.2Experiment Operation2.1Antigen coating(1)Prepare an antigen solution in coating buffer (human IgG at 0.025mg/ml);(2)Pipette 200 μl antigen solution to each well (Row: B~G; Column: 2~10; Column 11is negative control without antigen) of the microtiter plate;(3)Incubate the plate at 37 ℃for 30 min;(4)Remove the antigen solution;(5)Wash each well with 200 μl with PBS-T for 3 times;(6)Block each well (Row: B~G; Column: 2~11) with 200 μl 0.5% BSA-PBS, andincubate the plate at 37 ℃for 30 min;(7)Remove the blocking solution;(8)Wash each well with 200 μl with PBS-T for 3 times.2.2Primary antibody reaction(1)Dilute the primary antibody (rabbit-anti-human IgG antiserum) in PBS-T fordifferent dilution (from 1:400 to 1:51,200 in 2-folds dilution);(2)Add 200 μl diluted antibody solution to each well following Table 1;Table 1 Scheme to add primary antibody(3)Incubate the plate at 37 ℃for 1 hour;(4)Remove the primary antibody solution;(5)Wash each well with 200 μl PBS-T for 3 times.2.3Application of secondary antibody(1)Dilute the peroxidase conjugated secondary antibody (Goat-anti-rabbit IgG-HRP) inPBS-T at the dilution of 1:20,000 and 1:40,000;(2)Add 200 μl secondary antibody solution to each well following Table 2;(3)Incubate the plate at 37 ℃for 1 hour;(4)Remove the secondary antibody solution;(5)Wash each well with 200 μl PBS-T for 3 times.2.4Substrate development(1)Add 200 μl substrate solution to each well (Row: B~G ,Column: 2~11);(2)Incubate for approximately 3 min;(3)Add 50 μl 2 M H2SO4 to each well to terminate the reaction;(4)Measure optical density at 490 nm.3Raw data and its processing3.1Raw data3.2Data processingSet Row B, C, and D as Group I, and Row E, F, and G as Group II. The processed datais shown in Table 4Table 4 Processed data: optical density of each groupSet different dilutions of primary antibody as x axis, optical density as y axis, drawFigure 3 to illustrate their relation.Figure 3 Relationship between optical density and dilutions of primary antibodyFor the reason that the curve cannot illustrate the relationship enough, change the x axis to nature logarithm of different dilutions of primary antibody. See Figure 4:Figure 4 Relationship between optical density and natural logarithm of dilutions of primary antibodyUsing linear fit for each group, we can figure out that two lines are approximately parallel.In the black curve in Figure 3, there is an oblivious point of inflection which corresponds with the dilution of 1:800. The curve after this point becomes flat, which indicates that the binding between antigens and primary antibodies is saturated in the dilution of 1:800 and higher. This data can suggest that in other immunoenzymatic experiment, the proper dilution of primary antibody will be around, and no higher than 1:800.What’s more, from the red line in Figure 4 we can figure out that the optical density hasa linear relation with natural logarithm of dilutions of the primary antibody.As for comparison between Group I and Group II, from Figure 3 we can figure out thatthe point of infection of blue curve, which corresponds with the dilution of 1:40,000, ison the left, about 1:1600.In Figure 4, the green line (1:40,000) is positioned lower than the red line (1:20,000),which is easy to understand. Lower concentration of secondary antibody means lessbinding with primary antibody during application of secondary antibody.4Results and discussion4.1Results(1)The optical density has an approximately linear relation with the natural logarithmof the dilutions of the primary antibody;(2)For secondary antibody in the dilution of 1:20,000, the proper dilution of primaryantibody is 1:800; for secondary antibody in the dilution of 1:40,000, primaryantibody is recommended to be 1:1600;(3)With the same dilution of antigen and primary antibody, higher concentration ofsecondary antibody will get a higher optical density;4.2Discussion(1)What is the significance of the negative control groups?I.The no primary antibody groups proved that there is no specific bindingbetween antigen and secondary antibody, and provided a background ofnon-specific binding between secondary antibody and antigen;II.The no antigen groups can provide a background of non-specific binding between primary antibody and BSA.(2)Why washing step is essential?Washing each well with PBS-T, which contains tween-20 as detergent, can wash offunbounded antigens and antibodies, including those non-specifically binding. Ifwashing step is omitted, the background index will be higher, and might causeinterference to the result.(3)Why blocking step is essential?After the antigen coating step, the surface of the well is not covered by antigenentirely, i.e. there is still some site leaving blank, which allows other proteins bindto them. Blocking step is to block those blank sites with non-specific bindingmaterial that will not cause interference to the experiment. Thus, the primaryantibody will only bind to the antigen coated in the first step, rather than coat on thesurface as well.(4)What’s the advantage of indirect ELISA comparing with direct ELISA?I.Indirect ELISA can amplify the optical density which we measure.Compared to direct ELISA, the number of secondary antibody binding tothe primary antibody is way larger than the number of primary antibodybinding to the antigen. Thus, optical density will be higher and easier tomeasure, which means a lower error;II.The secondary antibody contains HRP, which is essential for substrate development. Compared to direct ELISA, indirect ELISA need only onekind of antibody contains HRP to perform many kinds of experiment, ratherthan one antibody linked to enzyme for one experiment, which isinconvenient.5Reference【1】/wiki/ELISA【2】/post/9314400054【3】/indirect_elisa。
酶联免疫吸附实验报告
酶联免疫吸附试验【小组成员】潘晓娟（21000101）陈怡静（21000100）李永乐（21000588）袁理（21000221） 【实验原理】酶联免疫吸附试验为酶免疫技术的一种，是在固相载体上进行的免疫酶技术。
其理论依据为：抗原或抗体可吸附固相载体（聚苯乙烯微量细胞培养板）表面而不改变其特性；抗原或抗体与酶交联后，仍保持其结合活性，同时酶的催化活性不改变；特异性抗原抗体结合后，标记的酶可高效催化底物水解、氧化或还原，产生有色物质，其颜色深浅与相应的抗体或抗原量相关。
【实验设计】酶联免疫吸附试验有多种设计方案，本组采取抑制ELISA 设计：正常兔血清→兔抗鼠IgG*+HPR-羊抗兔Ig →显色按照实验原理，若未加入未知抗原时，正常兔血清与酶标抗体结合后吸附在固相载体表面，能使后来加入的底物发生氧化还原反应而显色。
若先将未知抗原与酶标羊抗兔IgG 反应，如未知抗原中含有能与酶标羊抗兔IgG 反应的抗原，则正常兔血清能与酶标羊抗兔IgG 结合量减少，底物显色变浅，甚至不变色。
鉴于此次为首次进行酶联免疫吸附试验，包被物正常兔血清与未知抗原兔抗鼠IgG 二者的最佳反应稀释度均未知，故实验采取4个不同稀释度的正常兔血清与4个不同稀释度的兔抗鼠IgG 进行交叉，并设置了只含稀释液和酶标羊抗兔IgG 的空白对照组。
【实验材料】1:200正常兔血清、1:200兔抗鼠IgG 、1:200HPR-羊抗兔Ig 、包被液、封闭液、洗涤液、底物缓冲液（TMB ）、终止液 、聚苯乙烯微量细胞培养板、微量加液器、10μL 加样器头、100μL 加样器头、洗瓶、吸水纸、水浴箱。
【实验方法】1、稀释：按照加孔数计算稀释时所需正常兔血清与稀释液的量，倍比稀释1:200正常兔血清至1:1000、1:2000、1:4000、1:8000四个稀释度；2、包被：按下图所示，用100μL 加样器头往聚苯乙烯微量细胞培养板中加入不同稀释度血清100μL/孔，置于4°C 冰箱保存过夜；正常兔血清稀释度3、干燥：取出已包被过夜的培养板，倒掉多余的包被液，甩干后用吸水纸吸掉多余水分；4、封闭：加入150μL/孔的封闭液，放入37°C 恒温箱30min ；5、稀释：按照加孔数计算稀释时所需1:200兔抗鼠IgG 与稀释液的量，倍比稀释1:200兔抗鼠IgG 至1:1000、1:2000、1:4000、1:8000四个稀释度；6、干燥：取出培养板，以洗涤剂冲洗3次，每次3min ，用吸水纸吸掉多余水分；7、加液：按下图所示，加入已倍比稀释的兔抗鼠IgG 50μL/孔和1:200HPR-羊抗兔Ig 50μL/孔（无需稀释后加入），对照组只加入1:200HPR-羊抗兔Ig 50μL/孔，放入37°C 恒温箱30min ；1:1000 1:20001:10001:20001:10001:20001:10001:2000稀释液稀释液1:40001:8000 1:4000 1:8000 1:4000 1:8000 1:4000 1:8000 稀释液 稀释液1:1000/HPR-羊抗兔 1:1000/HPR-羊抗兔 1:2000/HPR-羊抗兔 1:2000/HPR-羊抗兔 1:4000/HPR-羊抗兔 1:4000/HPR-羊抗兔 1:8000/HPR-羊抗兔 1:8000/HPR-羊抗兔 HPR-羊抗兔 ***HPR-羊抗兔 HPR-羊抗兔 ***1:1000/HPR-羊抗兔1:1000/HPR-羊抗兔1:2000/HPR-羊抗兔1:2000/HPR-羊抗兔1:4000/HPR-羊抗兔1:4000/HPR-羊抗兔1:8000/HPR-羊抗兔1:8000/HPR-羊抗兔HPR-羊抗兔 ***HPR-羊抗兔HPR-羊抗兔 ***8、干燥：取出培养板，以洗涤剂冲洗3次，每次3min，用吸水纸吸掉多余水分；9、显色：加入底物缓冲液（TMB）100μL/孔，避光显色5min；10、终止：滴入H2SO4终止反应，利用酶标读数仪测量OD值。
酶联免疫吸附试验测定操作的体会
酶联免疫吸附试验测定操作的体会
酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的实验技术。
我个人觉得通过进行酶联免疫吸附试验，可以有效地检测分析样本中特定抗原或抗体的存在与浓度水平。
在进行酶联免疫吸附试验时，首先需要准备酶标板并选择特异性的抗原或抗体。
然后，将待测样本或标准品加入酶标板中，并进行反应。
在反应过程中，目标抗原或抗体与酶标记的抗体或抗原结合，形成免疫复合物。
随后，通过加入底物和酶反应催化反应，可以观察到酶标记物的发色反应，并根据产生的颜色强度来判断样本中特定抗原或抗体的存在与浓度水平。
在实际操作过程中，我发现一些注意事项。
首先，要保证操作的严密性和无菌性，尽量减少污染的可能性。
其次，每个步骤的时间和温度控制非常重要，以确保反应的充分性和准确性。
此外，正确选择和调整底物和酶反应物的浓度，也对实验结果有很大影响。
最后，要进行反应停止步骤，在正确的时间内停止反应，以避免颜色强度过高或过低的情况。
总体而言，酶联免疫吸附试验是一种可靠、灵敏且广泛应用的实验技术。
通过合理的操作和参数调整，可以得出准确的结果，帮助我们进行各种生物医学研究和临床诊断。
然而，对于初学者来说，需要认真学习和掌握实验的理论知识，并进行反复的实操练习，才能更好地理解和掌握酶联免疫吸附试验的操作技巧和要点。
酶联免疫吸附试验检测结果的影响因素和应对措施
３小
结
护理安 全是患者 的基 本需要 ，是 医院生存 的根本 ，是护理管理 的 重要 内容 ；护 理人员是护理活动 的执行者 ，也 是护理安全不可 或缺的
一
每一位 护士作相应 的指导 ，做 到 “ 一对一 ”指导 ，能够更好更快地提
高护 士 的护理 文 书的 书写水 平 。医 院还可 组织 了 “ 护理 文 书修改 活 动” ，每 个科室选 出两位护理 人员针对护理 文书 中存在 的 问题进 行抢
录 时添加 了过 多 的主观 判断 ，从 而破 坏 了护理 记录 的原 始性 、客观 性及真 实性 ］ 。护 理部 应定期组 织护士学 习并掌握 护理文 书的规范 写 法 ，提 高护理文书 的书写水平 ，保 证记录 的真实完整 。还可成立护理
文书写作 小组 ，帮 助年轻护士 纠正护理 文书书写 中出现的 问题 ，针对
理 人员树立 良 好 的人生观 、价值观 。
［ ４ ］ 余 云 红． 低 年资护 士在 临 床护理 工作 中潜 在的不安 全 因素与管理
各 种主客 观因素 的影响下 ，可 影响检测结果 的准确性 。为此 ，笔者 总 结 分析Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试验操 作各个环 节 中容易 出现的 问题 和注意事 项 ，以不
１试 剂 的准 备
目前 各种 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ试验 均有 商 品化 的专 用试剂 盒 。应选 择质 量优 良、有批准文号 的检测试剂 ，试 剂必须在有效期 内使 用 ，实际操作 时 严格 执行试剂 说明书。试剂从冰箱取 出后 ，应放 在室 温或３ ７℃条件 下 ３ ０ ｍｉ ｎ 再进 行检测 。保存 试剂盒 的冰箱 应经常检查储存 温度并做好记 录 ，冰箱应避 免频繁开关 。试剂使用前应摇匀 。 ２标 本 的采 集和 保存 血站Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试验所 用标本均 为血清 ，临床 上使用 的标 本还包括 经
酶联免疫吸附试验
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
加入底 物溶液A、
B
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD）
测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终止 液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
▲ （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃，使用前先 预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应 详细阅读说明书。
▲ （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入 比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。
实验六 酶联免疫吸附测定法
实验六酶联免疫吸附测定法摘要：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，具有操作简便、灵敏性高等优点，是生物化学等领域检验的常规测定方法。
本实验采用ELISA间接竞争法对牛奶中鼠抗氯霉素（CAP）进行了检测和分析。
关键词：酶联免疫吸附测定鼠抗氯霉素检测60 年代初期，Averameas 及Ram 等在不破坏酶的催化活性及免疫球蛋白的免疫活性或蛋白质结构的前提下，利用特殊的交联剂将辣根过氧化物酶（HRP）与人血清白蛋白（HSA）连接在一起，后来又用酸性磷酸酯酶（AP）与抗体（Ab）结合，这些结合物统称为酶标记物或酶结合物，被用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定，从此建立了免疫酶技术。
1971 年瑞典的Engvall 和荷兰的Van Weeman 等人使抗体与溴化氰激活的纤维素结合或使抗体吸附于聚苯乙烯试管上制成固相免疫吸附剂（固相载体），再与免疫酶技术结合，建立了酶联免疫吸附测定法，用于检测抗体或抗原。
1974 年Voller 等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELIS A 操作更方便，易重复，灵敏度可高达ng （10-9g）至pg（10-12g），并且所需仪器设备简单，因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一，原则上ELISA 可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。
在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断鉴定等。
因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。
ELISA 过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
酶联免疫吸附实验ELISA
酶联免疫吸附实验ELISA
第3页
再加入酶标识抗原或抗体, 也经过反应而结合在固 相载体上。此时固相上酶量与标本中受检
物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后, 底物被 酶催化成为有色产物, 产物量与标本中受检物质量 直接相关, 故可依据呈色深浅进行定性或定量分析 。因为酶催化效率很高, 间接地放大了免疫反应结 果, 使测定方法到达很高敏感度。
酶联免疫吸附实验ELISA
第20页
2.1.2 包被方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
换言之, 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面 过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸 附结合, 靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载 体表面疏水基团间作用于。这种物理吸附是非特 异性, 受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。
第18页
惯用检验方法为: 以一定浓度人IgG（普通为 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每 孔内加入适当稀释度酶标抗人IgG抗体，保温后 洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分 别测每孔溶液吸光度。控制反应条件，使各孔读 数在吸光度0.8左右。计算全部读数 平均值。全部单个读数与全部读数均数之差，应 小于10%。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附实验ELISA
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1. ELISA原理 ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗
体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保
持其免疫学活性, 酶标识抗原或抗体既保留其免疫 学活性, 又保留酶活性。
酶联免疫吸附实验ELISA
第2页
在测定时, 受检标本（测定其中抗体或抗原）与固相 载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相 载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分 开。
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酶联免疫吸附试验结果
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA），是一种广泛应用于生命科学中的试验技术，主要用于检测生物体内特
定蛋白质和抗体的存在和数量。
本文将根据不同类别，介绍ELISA试
验结果的分析。
一、直接ELISA试验结果分析
直接ELISA试验是指将已知抗原沉淀于微孔板上，再加入待检测物，
之后加入特定抗体进行检测的试验方法。
当待检测物含有对应的抗原，则抗原和特定抗体结合，形成固定的复合物。
此时，待检测物在微孔
板中残留，被进一步检测。
如果待检测物中含有特定抗体，则会与预
先添加的抗原结合。
根据特定抗体标记的物质进行检测。
直接ELISA
试验结果为同轴柱，并且呈现梯度性图谱。
二、间接ELISA试验结果分析
间接ELISA试验是指使用抗原沉淀于微孔板上，加入待检测物，并再
次加入特定抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，患者血清或其他
样品中含有抗体，抗体与固定的抗原结合，形成复合物。
之后添加特
定抗体，间接ELISA试验的结果为同轴柱，并且呈现梯度性的图谱。
三、竞争ELISA试验结果分析
竞争ELISA试验是对样品中的特定物质进行检测的试验方法。
在试管中，抗体与已知抗原结合后，特定抗体标记的物质被加入竞争ELISA
反应体系中。
如果合适的特定抗体分子与抗原分子竞争结合，则可抑
制特定抗体分子与标记物结合，标记物的含量随之减少。
竞争ELISA
试验结果为逆向梯度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
四、间接竞争ELISA试验结果分析
间接竞争ELISA试验是对患者中特定物质的抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，已知抗原沉淀于微孔板上，加入患者样品，之后加入特
定抗体。
如果患者样品中含有特定抗体，将与特定抗体竞争结合，导
致标记物与它竞争结合量的减少。
间接竞争ELISA试验结果为逆向梯
度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
总之，酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于特异性分子识别原理的分析方法，具有操作简单、稳定可靠、敏感度高等特点。
在不同的应
用领域和检测对象中，根据不同的检测标准和方法，可以选择不同的ELISA试验操作和数据分析方法。