细菌半数致死量测定张玉晴

表1 HX4菌对斑马鱼的毒力（LD50）
组 别 剂量 CFU/mL 只数 死亡 数 存活 数 累计结果(result) 生 死 死亡 比例 死亡率
1
2 3 4 5
1.2×1010
4.0×109 1.3×109 4.4×108 1.5×108
5
5 5 5 5
5
4 3 2 0
0
1 2 3 5
0 1 3
限）/2
LD50 95%可信限=lg -1（X50 1.96SX50） LD50平均可信限=L：相邻两组剂量对数值之差 P：各组动物死亡率，用小数表示 ∑P：各组动物死亡率之总和 n：每组动物数
预试验找出引起0%死 亡率和100％死亡率剂 量的所在范围
细菌LD50测定方法
报告人：张玉晴 指导老师：李槿年教授
大纲
1
LD50基本概念
2
LD50计算方法
LD50具体操作步骤 注意事项
3
4
1
LD50基本概念
半数致死量：LD50（Lethal dose）表示在规定
时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年 龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数或毒 素量。
2
LD50计算方法
1、寇氏法/改良寇氏法
2、累计法（Reed-Muench法） 3、霍恩氏法（Horn氏法）
4、加权法
5、序贯法
6、固定剂量法
7、logistic模型法
1、寇氏法/改良寇氏法 公式：LD50= lg -1[Xm –i (∑P – 0.5)] X50=lgLD50
不考虑操作误差, 计算结果不够精确, 粗略判断
LD50。
3
拟态弧菌对草鱼LD50的测定
一、实验准备：
3~5%来苏尔浸泡24h 自来水冲洗
3
1 4
2
5
二、细菌总数测定
8000r/min 离心8min 30℃ 150r/min 振荡培养24h 测量菌 落大小 100mLBHI 液体培养基 离心收 集菌体 洗涤菌 体3次
反应量大致呈正态分布 剂量必须按等比级数分 布
各组动物数相等
2、累计法（Reed-Muench法）
它是先将实验死亡动物数和存活动物数进 行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。 在死亡率中有2个数据A和B,且A刚好大于 50%,B刚好小于50%
计算方便, 更多地运用在微生物学中, 尤其在稀 释分析中
10mL生理 盐水重悬
平板菌落计 4℃保存用 数法计数 于攻毒
挑取HX4 单个菌落
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
记录平板上菌落数 量，肉眼观察+放 大镜检查
30℃倒置 培养24h
数据处理
选取同一稀释度平均菌落数在30～300个之间的平板 1、一个稀释度，平均菌落数在30～300个之间时，乘以稀释倍 数报告。 2、如有两个稀释度平均菌落数均在30～300个之间，则应求出 两者总菌数之比，比值小于或等于2应报告平均数，大于2则 报告其中较小的数字。 3、如所有稀释度的平均菌落数均多于300个，应按稀释度最高 的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。 4、如所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则按稀释倍数最 低的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。 5、如所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一个 稀释度大于300，而相邻的另一稀释度小于30，则以接近30 或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
三、攻毒
分别腹腔 注射5组鱼
1.2×10 2.4×10 4.8×10 9.6×10 1.9×10 10 9 8
7 7
0.01g/L MS-222 麻醉 0.3mL
三、攻毒
观察7天内草鱼的发病和死亡情况，记录结果，按 Reed-Muench氏法计算LD50 病死鱼无菌解剖，观察内脏病变情况，并用接种环 蘸取内脏接种于BHI固体培养基上，30°培养2d， 对分离到的细菌进行革兰氏染色镜检。
14 9 5 2 0
14/14 100.0%
9/10 5/8 2/8 0/11 90.0% 62.5% 22.2% 0.0%
6
11
LD50=4.2×107CFU/mL
数据汇总： 组别 稀释比例 1 原液 2 1:3 3 1:9 4 1:27 5 1:81
死亡率 100% 90.0% 62.5% 22.2% 0.0%
综上所述：拟态弧菌HX4对斑马鱼 半数致死量=1/14.3515×1.2×1010×0.05 =4.2×107
7、LD50计算
距离比例r=（高于50%死亡率－50）÷（高于50%死 亡率－低于50%死亡率） =（62.5－50）÷（62.5－22.2） =0.310 lgLD50=高于50%死亡率稀释度倒数的对数+距离比例 ×稀释倍数的对数 =lg9+0.310×lg3=1.1021 LD50=14.3515 即当细菌原液稀释成1:14.3515时，腹腔注射斑马鱼， 能使50%斑马鱼发生死亡。