【发酵工程】第四章 发酵工业无菌技术

3. 预防


培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
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培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌 时间t不同。
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3. 灭菌温度和时间的选择

培养物质受热破坏也可看作一级反应：
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本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
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一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐

灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器 具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
当T1 →T2
㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’)
∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于 培养基成分分解速率增加倍数，故一般 选择高温快速灭菌 。
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4. 影响培养基灭菌的其它因素

培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机 物等增加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用， 随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%10%以上，则减弱微生物的耐热性。

消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
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二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
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1.染菌的不良后果



消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
采取哪些措施能够保持无菌发酵？

物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；

好气发酵通入的空气要除菌；
种子无污染；接种无菌操作过关；
为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响

柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。

发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
罐压接近空气压力
夹套或蛇管中通冷水
培养基降温到所需温度
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2. 灭菌时间的估算

升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑 到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以 简单地利用式
㏑(N/N0) =-kt
来粗略估算灭菌所需时间。
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dC k ' C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；
k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
E ' ) RT E k A exp( ) RT k ' A' exp(
都与相应的活化能及T有关
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3. 灭菌温度和时间的选择
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2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少 染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌， 营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
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大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同 温度下的死亡曲线
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2. 微生物热死定律： (1) 对数残留定律

在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论， 微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N 成正比，即
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1
2
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2. 污染原因分析

主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
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2. 污染原因分析
dN kN dt
k↓，热阻↑, t↑
Nt ln kt N0
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1.百度文库热阻

当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体 计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。
当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累 尼乌斯定律 k=Aexp(- △E/RT) ∴ k与微生物活化能及T有关
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1. 染菌的检查与判断



显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 DO 水平异常变化 2 pH异常变化 尾气CO 异常变化 2


从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。

种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种

发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
kR ks
NR Ns dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
ND
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢数。
2. 灭菌时间的估算

例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实 罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢， 已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1 ，求灭菌失败机 率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)] =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。http://jpkc.hust.edu.cn/jpkc
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（一）湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
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1. 热阻

定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k来表示 。
（2）染菌种类对发酵的影响

青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌

谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
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4. 影响培养基灭菌的其它因素



pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促 使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈 短。 培养基的物理状态 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为 不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量
dN kN dt
Nt ln kt N0
N0 t 2.303/ k log Nt 当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
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(2) 非对数残留定律

某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些 微生物芽孢。
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（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响

丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自
溶，发酵液粘度增加，过滤困难
处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀

杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采
用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
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3. 预防


种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠 过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
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“死角”


发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
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（二）分批灭菌（实罐灭菌）
1.灭菌工艺过程
分空气过滤器灭菌 并用空气吹干 取样管 放料管
保温结束，依次关闭 各排汽、进汽阀门 夹套或蛇管排冷水，开启排 气管阀，空气管通蒸汽，也 可夹套内通蒸汽
达70℃左右
通蒸汽
120℃，1×105pa
保温
保温阶段，凡液面以下各管 道都应通蒸汽，液面上其余 各管道则应排蒸汽，不留死 角，维持压力、温度恒定 向罐内通无菌空气
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污水
脓疱
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
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罐底
法兰连接不当造成的“死角”
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灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
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（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏， 发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染 菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素， 都应全部废弃。
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三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法


干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
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四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较