【发酵工程】第四章 发酵工业无菌技术
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【发酵工程】余龙江版 第4篇_发酵工业无菌技术1
连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌
谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
/jpkc
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG ：青霉素水解酶上升， PenG 迅速破坏， 发酵一无所获。 柠檬酸： pH2.0 ，不易染菌，主要防止前期染 菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素， 都应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
发酵工程第四章工业发酵灭菌与消毒
•
达到灭菌温度（120 ℃）时，开始计算维持时间 （保温时间）。生产上采用30min 采用快速冷却方式，减少营养成份的损失
•
（1）连续灭菌
培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌,冷却后送入已灭菌 的发酵罐内的工艺过程.
• 优点
• • • • • • 保留较多的营养质量 容易放大，较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高，蒸汽负荷均匀。
• 特点 ：省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程， 使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却 器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混 合，使混合后的空气温度为30～35℃，相对湿度为50～60%。
3、高效前置过滤除菌流程
• 在压缩机前设置一台高效过滤器，这样便可降低过滤器负荷（即多 次过滤），达到空气除菌的要求。
经济快速适 用范围广 安全高效 可用于热敏 物质
一、工业上培养基灭菌
1.培养基灭菌的目的： 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。
2.灭菌方法： 工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。 湿热灭菌简便、有效、经济。
• 3.培养基灭菌的要求 • （1）达到要求的无菌程度； • （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基 组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： • 培养基中不同营养成分间的相互作用； • 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
项目 方法
化学物质灭菌 辐射灭菌
本质
化学反应 紫外线与菌体核酸 的光化学反应；其 它射线使水分子产 生自由基 加速与温度有关的 胞内反应 蒸汽释出潜热使蛋 白变性 氧化作用 利用菌体物理性质
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
二 如：
发 酵 工
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌 的危害大；
业 污
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的
染 危害较大；
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
不同污染时期对发酵的影响
二
发 种子培养期 菌浓低，营养丰富；灭菌；
酵 工
发酵前期 杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的
业 繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；
通；
略
发酵工业无菌技术
2.无菌空气带菌及防止；
二 3.培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防
发 酵
止：原料 蒸汽压力 设备死角
工 业
4.设备渗漏引起的染菌及防止；
污 染
5.操作不规范引起的染菌
的
防
治
策
略
第 发酵染菌的拯救与处理
十 一
1.种子培养期染菌的处理：灭菌，倒种；
章 2.发酵前期染菌的处理：灭菌，接种；
养 基Байду номын сангаас
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致
发酵工业无菌技术
无菌室 室内布置应尽量简单，通常用30瓦
二 发
紫外线灭菌灯照射20~30分钟，配合使用化 学灭菌药剂；无菌室内无菌度的要求是：
酵 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放
工 业
置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的
污 染
菌落在3个以下为好。
的 防
灭菌锅 灭菌操作时需要注意排气管是否畅
治 策
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
发酵工业无菌技术
一 发酵工业的无菌处理
在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存
在和生长繁殖，不允许其他微生物共存，因
发酵工程发酵工业的无菌技术课件
4.2.1 杂菌污染的危害
*
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化； 5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。
*
染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
*
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。
*
密闭式发酵罐
*
*
*
2、机械搅拌发酵罐的结构
好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括： 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等
*
*
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
*
4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化； 5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。
*
染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
*
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。
*
密闭式发酵罐
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2、机械搅拌发酵罐的结构
好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括： 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等
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“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
4微生物工程第四章发酵工业的讲义无菌技术
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
（2）过滤空气带菌及其防治
正确选择采气口
高处采气、前置粗过滤器
设计合理的空气预处理流程
减少含油量和湿度
设计和安装合理的空气过滤 器
介质选择
（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
溶解氧水平异常变化 pH异常变化 尾气中CO2异常变化 其他异常现象（黏度、泡沫、颜色等）
1 2
2. 污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
污染原因分析方法：
从污染杂菌的种类分析； 从污染时间进行分析； 从染菌的程度进行分析。
除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中 的微生物及其孢子。
防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微 生物的生长和繁殖 。
消毒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ灭菌的区别
➢ 消毒：表面微生物，只能杀死营养细胞 ➢ 杀菌：所有生命体
消毒与灭菌在发酵工业中的应用
➢消毒：发酵车间环境、设备、器具的无菌处理 ➢灭菌：培养基等物料的无菌处理
染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵
一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗 无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部
相对热阻：指某一微生物在某一条件下的致死时 间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。
发酵工程4发酵工业无菌技术.pptx
➢灭菌（sterilization）是指用物理或化学 方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物 质的过程。 ➢灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌 体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后， 其细胞发生溶化、消失的现象 。
➢消毒（disinfection）是指用化学或物理 的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它一 般只能杀死营养细胞而不能杀灭细菌芽孢。
2）发酵染菌对提取的影响
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面， 或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交 换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与 产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
➢消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死 物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌， 而对被消毒的物体基本无害的措施。
➢除菌（degerming）是用过滤方法除去空气 或液体中的微生物及其孢子 。
➢防腐（antisepsis）就是利用某种理化因 素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达 到防止食品等发生霉腐的措施。如低温、缺 氧、干燥、高渗、添加防腐剂等。
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响 ➢染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
➢消毒（disinfection）是指用化学或物理 的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它一 般只能杀死营养细胞而不能杀灭细菌芽孢。
2）发酵染菌对提取的影响
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面， 或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交 换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与 产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
➢消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死 物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌， 而对被消毒的物体基本无害的措施。
➢除菌（degerming）是用过滤方法除去空气 或液体中的微生物及其孢子 。
➢防腐（antisepsis）就是利用某种理化因 素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达 到防止食品等发生霉腐的措施。如低温、缺 氧、干燥、高渗、添加防腐剂等。
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响 ➢染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
【发酵工程】余龙江版 第4章_发酵工业无菌技术(1)
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
连续灭菌时间的估算
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自
溶，发酵液粘度增加，过滤困难
处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采
用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 DO 水平异常变化 2 pH异常变化 尾气CO 异常变化 2
罐压接近空气压力
夹套或蛇管中通冷水
培养基降温到所需温度
2. 灭菌时间的估算
发酵工业的无菌技术
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损 加热、冷却装置。 失大，灭菌后培养基 歇 质量下降 灭 2.操作要求低，适合小批 量生产规模 2.发酵罐的利用率较低 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
生物化学 第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
dN dt
kN
t 2 . 303 /( k lg
N0 Nt
)
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
t 2 . 303 ( k lg
N0 Nt
第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
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第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
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N0 Nt
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生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
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第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
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N0 Nt
第四章 发酵工业的无菌技术
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第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
第四章 发酵工业的无菌技术 2
第四章发酵工业的无菌技术内容提要•常用技术概念•发酵工业污染的防治策略•发酵工业的无菌技术•发酵培养基及设备管道的灭菌•空气除菌目前，绝大多数的工业发酵都采用纯种培养，即发酵全过程只有生产菌，不允许有“杂菌”污染。
为了保障纯种发酵的顺利进行，在进行生产菌接种之前，必须对整个发酵系统进行灭菌，对发酵环境进行消毒，防治杂菌和噬菌体的感染。
在实际生产中，为了防止杂菌污染，而采用的消毒和灭菌技术，统称为发酵工业的无菌技术。
一般采用“污染概率”作为评价标准。
发酵工业中允许的染菌概率为10-3，即灭菌1000批次的发酵中只允许有1次染菌。
一、常用技术概念几个容易混淆的概念说明：1、灭菌：指用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。
2、消毒：指用物理或化学的方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
3、除菌：指用过滤的方法去除空气或液体中的微生物及其孢子。
4、防腐：指指用物理或化学的方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。
灭菌和消毒的区别和主要用途。
二、发酵工业污染的防治策略（一）、污染的危害1、污染杂菌，造成培养基的异常消耗，生产菌的生产能力下降；2、杂菌合成的代谢产物改变发酵环境，造成产物收率降低或质量下降；3、杂菌代谢产物使发酵系统的PH变化，造成生产菌自溶；4、杂菌分解产物，使发酵失败；5、噬菌体污染，造成生产菌细胞破裂，发酵失败。
目前，国内抗生素发酵，如青霉素发酵染菌率为2%；链霉素、红霉素和四环霉素发酵染菌率为5%；谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%-2%。
（二）、发酵生产的产品不同，染菌的种类和性质不同、染菌发生的时间、染菌的途径和程度各不同。
1、不同种类的杂菌对发酵的影响（1）、细菌发酵：发酵周期短。
主要防止噬菌体感染。
例如：谷氨酸发酵菌种：棒状杆菌营养缺陷型细菌发酵（2）、霉菌发酵：发酵周期较细菌发酵长，产物类型各不相同。
主要防止细菌感染。
例如：青霉素发酵——水解产物。
（3）、酵母菌发酵：发酵周期最长。
4.发酵工业无菌技术
这样对于不同 N0 的培养基，其灭菌时间不 同，即 t = t (N0) 。
发酵工业无菌技术
根据
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
1 N t ln K N0
在给定的温度条件下，t 与 ln N0/N 呈直线 关系，其斜率为 -1/K ；当 N0 给定后，t 决 定于 K ；K 除了决定于菌体的种类及存在 形式外，还是温度的函数。
发酵工业无菌技术
四 发酵培养基及设备管道灭菌
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
发酵生产中主要采用湿热灭菌的方法
生产中需要解决的问题：
杀灭培养基中的杂菌 避免培养基中营养成分的破坏
发酵工业无菌技术
湿热灭菌原理
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
微生物的热阻 表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。 指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热 方式)下的致死时间。 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围， 如一些嗜冷菌的最适温度为5～l 0℃；大多数 微生物的最适温度为25～37℃；另有一些嗜 热菌的最适温度为50～60℃。
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
发酵工业无菌技术
3.不同染菌的时间分析
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
种子阶段
发酵初期
发酵后期
发酵工业无菌技术
杂菌污染途径及预防
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
1.种子带菌及防止： 带菌的原因 无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌 不彻底；操作不当。 种子带菌的防止 种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在 每次接种后应留取少量的种子悬浮液迚行平 板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂 菌。严格技术觃范种子培养的设备和装置
第四章 发酵工业的无菌技术
3 杂菌污染的途径及其预防
种子带菌及其防治 培养基及器具彻底灭 菌，避免菌种在移接过程中受污染，避 免菌种在培养过程中或保藏过程中受杂 菌污染 过滤空气带菌及其防治 正确选择采气口， 提高采气口的位置或安装前置粗过滤器， 提高空压机进口空气的洁净度。
根据发酵工厂所在地区的气候条件，设 计合理的空气预处理流程，尽可能减少 过滤空气的含油量和湿度，适当提高进 入过滤器的空气湿度，降低空气的相对 湿度，保持过滤介质的干燥状态。设计 和安装合理的空气过滤器，防止过滤器 失效，选用除菌效率高的过滤介质。
杀死微生物的极限温度称为致死温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需要 的时间称为致死时间。 在致死温度以上，温度越高，致死时间 越短。
微生物对热的抵抗力称为热阻，即指微 生物在某一条件下（主要是温度）的致 死时间。 相对热阻是指某一微生物在某一条件下 的致死时间与另一微生物在相同条件下 的致死时间之比。
平板划线培养检查法 先将待检样品在无 菌平板上划线，根据可能的污染类别分 别置于37、27℃下培养划线平板，以适 应嗜中温和低温菌的生长，一般在8h后 即可观察到是否有杂菌污染。
对于噬菌体检查，可采用双层平板培养 法，上层和下层同为肉汤琼脂培养基， 上层减少琼脂糖用量，先将灭菌的下层 培养基融化后倒入平板，凝固后再将上 层培养基溶解并保持40℃，加上生产菌 作为指示菌核待检测样品混合后迅速倒 在下层平板上。置培养箱保温培养经1220h培养，观察有无噬菌斑。
第四章 发酵工业的无菌技术
发酵工业的无菌处理 发酵工业污染的防治策略 发酵工业的无菌技术 发酵培养基及设备管道灭菌 空气除菌
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠 过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
/jpkc
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
dC k ' C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；
k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
E ' ) RT E k A exp( ) RT k ' A' exp(
都与相应的活化能及T有关
/jpkc
3. 灭菌温度和时间的选择
（2）染菌种类对发酵的影响
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌
谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
/jpkc
2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少 染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌， 营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
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（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自
溶，发酵液粘度增加，过滤困难
处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采
用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
/jpkc
大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同 温度下的死亡曲线
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2. 微生物热死定律： (1) 对数残留定律
在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论， 微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N 成正比，即
/jpkc
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
2. 灭菌时间的估算
例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实 罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢， 已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1 ，求灭菌失败机 率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)] =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。/jpkc
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培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌 时间t不同。
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3. 灭菌温度和时间的选择
培养物质受热破坏也可看作一级反应：
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1
2
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2. 污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
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2. 污染原因分析
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
/jpkc
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；
好气发酵通入的空气要除菌；
种子无污染；接种无菌操作过关；
为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
/jpkc
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏， 发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染 菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素， 都应全部废弃。
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4. 影响培养基灭菌的其它因素
pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促 使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈 短。 培养基的物理状态 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为 不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量
当T1 →T2
㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’)
∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于 培养基成分分解速率增加倍数，故一般 选择高温快速灭菌 。
/jpkc
4. 影响培养基灭菌的其它因素
培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机 物等增加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用， 随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%10%以上，则减弱微生物的耐热性。
罐压接近空气压力
夹套或蛇管中通冷水
培养基降温到所需温度
/jpkc
2. 灭菌时间的估算
升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑 到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以 简单地利用式
㏑(N/N0) =-kt
来粗略估算灭菌所需时间。
/jpkc
ห้องสมุดไป่ตู้
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
dN kN dt
Nt ln kt N0
N0 t 2.303/ k log Nt 当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
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(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些 微生物芽孢。
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（一）湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
/jpkc
1. 热阻
定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k来表示 。
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
/jpkc
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
/jpkc
1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
/jpkc
污水
脓疱
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
/jpkc
罐底
法兰连接不当造成的“死角”
/jpkc
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
/jpkc
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
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1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 DO 水平异常变化 2 pH异常变化 尾气CO 异常变化 2
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（二）分批灭菌（实罐灭菌）
1.灭菌工艺过程
分空气过滤器灭菌 并用空气吹干 取样管 放料管
保温结束，依次关闭 各排汽、进汽阀门 夹套或蛇管排冷水，开启排 气管阀，空气管通蒸汽，也 可夹套内通蒸汽
3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠 过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
/jpkc
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
dC k ' C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；
k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
E ' ) RT E k A exp( ) RT k ' A' exp(
都与相应的活化能及T有关
/jpkc
3. 灭菌温度和时间的选择
（2）染菌种类对发酵的影响
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌
谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
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2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少 染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌， 营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
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（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自
溶，发酵液粘度增加，过滤困难
处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采
用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
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大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同 温度下的死亡曲线
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2. 微生物热死定律： (1) 对数残留定律
在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论， 微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N 成正比，即
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
2. 灭菌时间的估算
例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实 罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢， 已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1 ，求灭菌失败机 率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)] =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。/jpkc
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培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌 时间t不同。
/jpkc
3. 灭菌温度和时间的选择
培养物质受热破坏也可看作一级反应：
/jpkc
1
2
/jpkc
2. 污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
/jpkc
2. 污染原因分析
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
/jpkc
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；
好气发酵通入的空气要除菌；
种子无污染；接种无菌操作过关；
为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
/jpkc
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏， 发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染 菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素， 都应全部废弃。
/jpkc
/jpkc
4. 影响培养基灭菌的其它因素
pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促 使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈 短。 培养基的物理状态 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为 不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量
当T1 →T2
㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’)
∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于 培养基成分分解速率增加倍数，故一般 选择高温快速灭菌 。
/jpkc
4. 影响培养基灭菌的其它因素
培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机 物等增加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用， 随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%10%以上，则减弱微生物的耐热性。
罐压接近空气压力
夹套或蛇管中通冷水
培养基降温到所需温度
/jpkc
2. 灭菌时间的估算
升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑 到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以 简单地利用式
㏑(N/N0) =-kt
来粗略估算灭菌所需时间。
/jpkc
ห้องสมุดไป่ตู้
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
dN kN dt
Nt ln kt N0
N0 t 2.303/ k log Nt 当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
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(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些 微生物芽孢。
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（一）湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
/jpkc
1. 热阻
定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k来表示 。
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
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二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
/jpkc
1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
/jpkc
污水
脓疱
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
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罐底
法兰连接不当造成的“死角”
/jpkc
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
/jpkc
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
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1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 DO 水平异常变化 2 pH异常变化 尾气CO 异常变化 2
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（二）分批灭菌（实罐灭菌）
1.灭菌工艺过程
分空气过滤器灭菌 并用空气吹干 取样管 放料管
保温结束，依次关闭 各排汽、进汽阀门 夹套或蛇管排冷水，开启排 气管阀，空气管通蒸汽，也 可夹套内通蒸汽