荧光光谱分析讲义

荧光光谱分析

一、实验目的

1、了解荧光光谱的基本原理；

2、熟悉荧光光谱仪的基本原理和操作规程；

3、了解荧光光谱的基本分析方法。

二、荧光光谱原理

分子吸收辐射后,使其价电子处于不稳定的激发态，随后以光的形式辐射出能量、这称为“光致发光”。在二次发光的发射过程中，最常见的两种光致发光是分子荧光(fluorescence)和分子磷光(phosphorescence)。由测量分子荧光和磷光强度而建立起来的定量分析法称为分子荧光分析法和分子磷光分析法。在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能产生激发态物质，这种激发态物质发出的光辐射称为化学发光(chemiluminescence)。根据化学发光强度或发光总量来确定物质组分含量的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析、分子荧光分析和磷光分析统称为分子发光分析法。

2.1、荧光及磷光的产生原理

含有孤对电子n和π轨道的分子，吸收光能后产生π→π*和n→π*电子跃迁。在通常情况下，基态分子的电子自旋是配对的，净自旋S＝0，光谱项的多重性2S+1＝l，这种状态称为单重态。电子激发态的多重性也是2S+1。若有一个电子激发至高能轨道时，当S=0, 此时分子所处的状态就称为激发单重态；若—个电子激发至高能轨道，但S＝1时，即2S+l ＝3，这种状态的分子就处于激发三重态。假若分子中含有奇数电子，则S＝1/2时，分子处于二重态。

在图11-1电子激发能级图中，处于激发态的分子可以有多种辐射形式去激发而回到基态。首先由于与同类分子或其它分子碰撞，损失一部分能量，产生无辐射跃迁。然后，若能态的多重性不变(激发单重态向基态单重态跃迁)所产生的辐射称为荧光。而能态的多重性改变(激发三重态向基态单重态跃迁)时产生的辐射称为磷光。由图11-1可知，吸收光谱的能级高于荧光光谱能级，荧光光谱能级又高于磷光光谱能级。所以，荧光波长较磷光短；荧光的寿命约为10-9～10-6s, 而磷光的寿命约为10-3～10s; 一般荧光在常温下即可以发射，但磷光必须在极低的温度下（液氮，-196o C）才可以发射。

2.2 荧光强度与浓度的关系

由荧光发生机理可知，荧光强度I f由下式表示；

I f=φf ·I a

式中：Ia为被荧光物质吸收了的光强；φf为荧光量子效率，φf＝发射荧光的分子数／激发的分子总数，亦称荧光量子产率。根据光的吸收定律，被吸收光的强度I a为

I a=I o-I t=I o(1-I t/I o)

I f=φf ·I o(1-eεbc) （11-2）

式中：I o---激发光的光强

I t―透过光强度

ε－摩尔吸收系数

b－样品槽长度

c－样品浓度。

若I o固定，则I f取决于式子（11-2）中的指数衰减项。将其指数项用级数展开得：

由于荧光分析中检测物质浓度c很稀，方程(11-3)可写成：

I f＝φf ·I oεbc (11-4)

当工作条件一定时，式(11—4)中I oε b 都为常数，则

I f =kφf c

对于某种被分析物质及溶剂，φf 也是常数，则

I f =K c

此式为荧光定量分析的依据。

2.3 荧光、磷光与分子结构的关系

一、影响荧光、磷光强度的因素

分子发光过程可由图11-5所示，可由分子激发态的各

种辐射过程的速率常数来讨论影响发光的因素。图中S ，S*

和T 分别表示基态、最低受激单重态和三重态。kc 和kc'

分别是受激单重态和三重态无辐射去激发过程的速率常

数；kf 和kp 分别表示荧光和磷光发射过程的速率常数。kx

为最低s*-T 态无辐射过程速率常数。这样，荧光量子效率

为：

φf =x c f f

k k k k ++ (11-9)

若kc 和k x 远大于k f , 则φf 将趋于0；显然，凡是能使

k f 值升高得因素均可增强荧光。

磷光量子效率取决于k x 、k p 、k c ’, 可由下式表示：

一般来讲，k f 和k p 主要取决于分子结构，而受工作环境影响极小；而k c 和k c '则受发光环境的强烈影响；k x 既受分子结构的影响，也在一定程度上受环境的影响。分子中S*－T 态间的能量差ΔE 影响着k x , ΔE 越小，则k x 越大，有利于激发态之间的转化，φP 大，有利于磷光发射。

在实际工作中，荧光分子或磷光分子与溶剂分子及其它溶质分子相互作用，引起荧光强度或磷光强度降低的现象称为荧光熄灭或磷光熄灭现象。引起这种现象的一些物质叫熄灭剂。这种熄灭效应是由发光分子受环境作用而产生的。其原因很多，机理也很复杂。但主要是S*，T 态发光分子与熄灭剂发生碰撞，由于碰撞作用使无辐射去激发速率kc 和kc'变大，因而产生熄灭现象. 显然，碰撞熄灭观象与温度、溶剂的粘度有关系。不难理解，升高温度，降低粘度，都将使发光熄灭作用增大。因此，低温磷光就是基于这一原理建立起来的。

二、分子发光与结构的关系

如果要使分子能够产生荧光或磷光，首先要求分子能够吸收紫外或可见光辐射能。根据吸收定律，εmax大的物质，吸光度A也大，A又影响k f和k p,因此，εmax可以作为荧光、磷光发射的定性量度。通常分子吸收辐射能力越强，产生的荧光或磷光也越强。能够强烈发光的分子几乎都是通过π π*跃迁去激发产生的辐射。一船来讲，具有共轭双键、刚性较强的平面结构和多环结构分子易产生荧光；含杂环的芳香烃产生的磷光比荧光强。

取代基对分子发光有明显的影响，一般有以下一些规律：

(1)给电子的基团常使荧光增强，因为这类基团使最低激发

单重态和基态间的跃迁几率增大。例如，－NH2，-OH，-OR等。

(2)吸电子的基团会使荧光减弱，因为此类基团使最低激发

单重态和基态间的跃迁几率减小，即使kf减小。例如，COOH，-NO2，-N=N-，-SH及卤素等。

(3)引入原子序数较大的原子到π电子体系中，可使磷光增强，而荧光减弱，这种现象称为重原子效应。如卤素取代基随原子序数增加，使荧光减弱，磷光增强。这是由于在重原子中能级之间的交叉现象更严重，使单重态S*到三重态T的无辐射速率常数kx增大。类似同样的原因，发光分子在含有重原子的溶剂如碘乙烷、溴乙烷中或在含有重原子的Ag+盐、Pb2+盐、Tl+盐中，荧光减弱，磷光会增强。

另外，环的封闭作用，有机螯合剂与金属离子形成配位键以及有机试剂与金属离子生成内络盐等，都可使发光分子结构的刚性增强，使kc减小，kf增大，故有利于荧光的产生。

三、荧光和磷光分析法的应用

在荧光和磷光分析法中，由于测定的是I f和I p故可通过增强Io来提高灵敏度。一般来讲，它们的灵敏度比分子吸收光谱法高10-103倍。磷光分析法因不存在散射光干扰问题，可使用较宽的狭缝以增大Io，所以灵敏度比荧光法还要高。

由于分子荧光分析法的选择性和灵敏度好，常应用于医药、食品、生物化学和天然产物的分析。在有机物分析方面应用轻多。荧光分析法在以上领域中具有特殊的作用。

一般说来，无机离子不发射荧光，但许多金属离子可与有机试剂形成荧光配合物，从而可以利用荧光分析法进行定量分析。目前已有60余种元素可用荧光分析法测定。某些阴离子如F-，CN-等，可利用对其荧光物质的熄灭效应，来测定它们的浓度，这类方法称间接荧光分析法。

分子磷光分析法主要用于生物体液中痕量药物的分析。例如，血中色氨酸、含硫药物、阿司匹灵、咖啡因，血清中的普鲁卡因、柯卡因、苯巴比妥和阿托平等分析。

出于磷光物质比荧光物质更少，并且磷光分析法必须在低温度下进行，应用上受到一定限制；但对于那些在室温下不发生荧光或只发生微弱荧光，而在低温下可产生磷光的物质，