酶的化学修饰专题(最有用)
酶分子的化学修饰方法具体实例
酶分子的化学修饰方法1.酶的表面修饰2.酶分子的内部修饰3.与辅因子相关的修饰4.金属酶的金属取代1.1酶的表面修饰1.1.1化学固定化例如:①固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载体)方向偏移。
这样，在生产工艺中需几个酶协同作用时，由于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。
②将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适pH由4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适PH(7.5)靠近，这样，可简化高果糖浆生产工艺。
如果载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km值增加；带相反电荷，Km值降低。
当酶与载体连接点达到一定数目时，可增加酶分子构象稳定性，防止其构象伸展而失活。
1.1.2 酶的小分子修饰作用例如:③将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的NH2COOH并达到一定程度时，酶的热稳定性在60℃时，提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。
这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活.1.1.3酶的大分子修饰例如:④聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。
嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。
1.1.4 分子间交联例如:⑤戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。
这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低，也使其反应器体积减少。
将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联而形成的杂化酶，可作为部分代谢途径的模型，则有可能在体内将它们输送到同一部位而提高药效。
1.2酶分子的内部修饰1.2.1非催化活性基团的修饰例如: ①将胰凝乳蛋白酶的Met192氧化成亚砜，则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的束缚口袋有关．也说明底物的非反应部分束缚在酶的催化作用中有重要作用。
1.2.2酶蛋白主链修饰例如: ②用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对 酶分子的化学修饰 酶进行改造，以达到改构和改性的目的。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容 性的物质，进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这种物质被称为修饰试剂 修饰试剂。 修饰试剂 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾 病治疗。医疗用酶要求酶的稳定性高、纯 度高、无免疫原性。
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
（2）酶蛋白主链的修饰
至今，酶蛋白主链修饰主要是靠 酶法。例如：用蛋白酶对ATP酶有 限水解，切除其十几个残基后，酶 活力提高了5.5倍。该活化酶仍为 四聚体，亚单位分子量变化不大。 这说明天然酶并非总是处于最佳的 催化构象状态。
（3）催化活性基团的修饰
通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的 取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的 氨基酸侧链的方法叫化学突变法 化学突变法。例如：Berder 化学突变法 等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转 化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没 有水解能力，但能水解硝基苯酯等高度活化的底 物。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业 水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通 过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充 蛋白质工程技术。
②大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素 等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层 覆盖层。这种可溶性酶有许多有用的性质：如用 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(S0D)，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药 效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋 白酶上所得产物溶于有机溶剂，仍能有效地起作 用。嗜热菌蛋白酶通常在水介质中催化肽链裂解， 但用聚乙二醇共价修饰后，可在有机溶剂中催化 肽键合成，已用于合成甜味剂。
酶分子的化学修饰
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
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（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
酶的化学修饰
第五章酶分子的化学修饰主要内容：●酶的活性中心●酶化学修饰的目的●酶化学修饰的原理●酶化学修饰的设计●酶化学修饰的应用第一节酶的活性中心（active site）一、活性中心的概念P12酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.酶的必需集团在一级结构上并不互相毗邻，往往分散在氨基酸系列中，甚至分布在不同肽链上。
当肽链盘曲、折叠形成空间结构时，互相隔离的必需基团彼此靠近，集中在酶分子表面而形成具有三维结构的特定区域。
该区域能与底物结合并发挥催化作用，故称酶的活性中心(active center)活性部位（active site）。
对于结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。
活性中心的重要化学基团——7种氨基酸出现的频率最高：Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr和Ser（兰天果拌猪肉丝）。
某些功能基团（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。
图释左图：丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基右图：天冬氨酸和谷氨酸的羧基、赖氨酸的氨基、酪氨酸和丝氨酸的羟基。
二、活性中心的共性P12(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
(2)活性部位是一个三维实体(entity)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。
(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。
1．The active site takes up a relatively small part of the total volume of an enzyme.左图：肌球蛋白模型。
只显示出α-碳原子，红的为血红素，绿的是两种关键的组氨酸残基。
右图：来自胞质热激蛋白的ATP酶片段的结构图。
ADP（红的）位于两个结构域（黄和蓝的）之间的裂缝中。
05-酶的化学修饰
（二）酶蛋白主链的修饰 ——主要是靠酶法进行修饰，用 蛋白酶对主联进行部分水解，可 以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰 ——通过选择性修饰催化活性氨 基酸的侧链来实现氨基酸残基的 取代，使一种氨基酸侧链转化为 另一种氨基酸侧链，这种方法又 称为化学突变法。
（四）肽链伸展后的修饰 ——酶蛋白经过脲、盐酸胍处理， 使肽链充分伸展，对酶分子内部 的疏水基团进行修饰，然后在适 当条件下，重新进行折叠。
（三）酶的大分子修饰作用 ——非共价修饰 ——共价修饰
1、大分子非共价修饰
——利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互 作用，对酶进行有效的保护 ——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定 于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连， 从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚 氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护 酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用， 排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶 的稳定性增加。
在基础酶学研究上
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定
酶蛋白的结构变化与运动
酶蛋白部分区域的构象状态 酶的作用机理与催化反应历程 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 酶的固定化技术 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上
—克服酶在体内的不稳定性
—消除或降低酶的抗原性 —有助于酶分子到达并集中于病灶细胞 在工业上的应用
第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰
——在分子水平上对酶进行改造，以达 到改变结构和改性的目的。在体外将酶 分子通过人工的方法与一些化学物质， 特别是一些有生物相容性的物质进行共 价连接，从而改变酶的结构和性质。这 些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰 主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。
第三章第三节酶的化学修饰ppt课件
9）、二硫键的修饰
2、酶分子表面的化学修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精 细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。
水溶性大分子： ＰＥＧ及其衍生物：是线性分子，具有良好的生物相容性和水
溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗 原性。 右旋糖酐及其衍生物：右旋糖苷是由α—葡萄糖通过α—1， 6—糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和 水溶性。 糖肽：糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或Y一球蛋白所得到的产 物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分子上氨基反应，从 而可修饰酶。 其他天然大分子（肝素、血清白蛋白） 其它合成大分子多聚物：聚N—乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇 （PVA）聚丙烯酸(PAA)饰的定义
通过化学方法对酶分子施行的各种改造和 修饰，以改变酶理化性质及生物活性的方法。
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
范围。（70年代末之后） 1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2）保护酶活性部位与抗抑制剂 3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
如：PEG-腺苷脱氨酶、PEG-超氧化物歧化、 PEG-溶血类蛋白、PEG-天门冬酰氨酶、
缺点： 扩散速度受限； 生物活性降低； 选择性不高，稳定性不够理想。
极性氨基酸
1）无电荷的极性氨基酸（共7种）：
丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T),
酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),
天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),
酶化学修饰的主要类型
酶化学修饰的主要类型
1. 磷酸化：将一个或多个磷酸基团添加到蛋白质中的特定氨基酸残基上。
这个修饰可以调节蛋白质的活性、稳定性、转运和相互作用。
2. 甲基化：给予特定的氨基酸残基一个甲基基团。
这个修饰可以调节蛋白质的亲水性、稳定性和相互作用。
3. 乙酰化：添加一个乙酰基到一个特定的赖氨酸残基上。
这个修饰可以调节蛋白质的活性、稳定性和相互作用。
4. 泛素化：在特定的氨基酸残基上添加一个泛素标记，标记蛋白质降解。
5. 糖基化：将一个糖分子添加到特定的氨基酸残基上。
这个修饰可以调节蛋白质的亲水性、保护性和相互作用。
6. 硫化：形成一个二硫键，可以使蛋白质稳定性更高。
酶的化学修饰法
酶的化学修饰方法通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目的。
这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。
PEG化修饰聚乙二醇或甲基聚乙二醇有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000 ~ 10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。
1977 年 Abuchowski等[1]率先用 PEG修饰牛血蛋白BSA, 发现 PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期大大延长, 且无免疫原性。
其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰。
PEG必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。
活化的方法如图1所示.图1聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性, 无毒, 水溶性较高的亲水聚合物,其重复单元为氧乙烯基, 端基为两个羟基, 呈线性或支化链状结构[2]. PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物[3]。
姚文兵等[4] 用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了修饰研究, 反应方程式如Eq. 1所示.Goodson等[5]通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如Eq. 2所示.[1]Abuchowski A, Van Es T, Palczuk C N, e t al . Ef f e ct of covalent at tach mentof polyethylene glycol on immun ogenicity and circulating life of bovine liver catalase [ J ] . J . Biol .Chem. , 1977 , 252: 3578- 3581.[2]Bailon, P.; Berthold, W.Pharm. Sci.Technol. Today 1998, 1, 352.[3]Hooftman, G.; Herman, S.; Schacht, E. J. Bioact. Compat. Polym. 1996, 11, 135.[4]Yao, W. B.; Lin, B. R.; Shen, Z. L.; Wu, W. T. Chin. J. Biochem. Pharm. 2001, 22, 289 (in Chinese).(姚文兵, 林碧蓉, 沈子龙, 吴梧桐, 中国生化药物杂志, 2001, 22, 289.)[5]Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/technology 1990, 8, 343.。
酶的化学修饰
酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
酶的化学修饰
的保持时间。
＋ HCl
• 焦碳酸二乙酯（DPC)和碘代乙酸， DPC对 抗凝血、抗血栓、降血脂活性，修饰溶栓酶类增加疗效。
+ HI
+
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB)和4－硝基
组氨酸残基有较好的专一性，240nm。 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其它分子之间发生交联反应。
修饰试剂应具备以下特征:
①选择性地与一个氨基酸残基反应; ②酶蛋白不变性; ③标记的残基在肽中稳定 ④反应的程度能用简单的技术测定。
2、反应条件的选择
①不造成蛋白质的不可逆变性。 ②有利于专一性修饰蛋白质。
3. 反应的专一性
①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性。 例：二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白
E－SH + R－S－S－R
E－S－S－R
+ R－SH
E－SH + E－S－S－R
E－S－S－E
+ R－SH
与—SH进行二硫键交换后，—SH被修饰，试剂 的另一半以单体放出。
常用的二硫键交换试剂： DTNB， 5, 5’-dithio-bis-(2-Nitrobenzoate)
二硫二吡啶，4, 4’-dithiodipyridine （或2, 2’-dithiodipyridine）
酶的化学修饰
概念
酶的化学修饰（Chemical modification） 化学手段将某些原子或化学基团结合到酶 分子上，或将酶分子中某基团改变，改变 酶的催化性质及一些生理生化性质。
易实现，作用快，成本
例如：
1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基， 对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。
酶工程5化学修饰
二、修饰反应的条件 ——修饰反应应尽量在酶稳定 条件下进行，并尽量不破坏酶 活性必需基团，修饰率高，活 力回收要高
（一）pH与离子强度：
——pH决定了酶分子中反应基团的解 离状态，酶的解离状态不同，其反应 性能也不同；另一方面，有些修饰试 剂在不同pH下，与同一种基团反应可 以形成不同的产物。离子强度对修饰 反应也有重要影响。
—反应条件的改善和酶寿命的延长导致生
产工艺的技术革新和改进。
——大多数的化学修饰的目的在 于人为地改变天然酶的某些性质， 创造天然酶所不具备的某些优良 特性甚创造出新的活性，扩大酶 的应用范围。
——酶经过修饰后，会产生各种各样 的变化，概括起来有：
—１提高生物活性（包括某些在修 饰后对效应物的反应性能改变） —２增强在不良环境中的稳定性； —３针对特异性反应降低生物识别能 力，解除免疫原性； —４产生新的催化能力。
①热稳定性
——一般来说，经过化学修饰的酶，热稳 定性有较大的提高。
——主要是由于修饰试剂的多个功能基团 与酶分子的多个功能基团相互交联增加 了酶分子构象的稳定性。
天然酶和修饰酶的热稳定性比较
酶
腺苷脱氢酶
修饰剂
右旋糖苷
残留酶活(%) 处理条件 (℃/时间) 天然酶 修饰酶 37/100min 70 100
（三）酶的大分子修饰作用 ——非共价修饰 ——共价修饰
大分子非共价修饰
——利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互 作用，对酶进行有效的保护 ——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定 于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连， 从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚 氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护 酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用， 排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶 的稳定性增加。
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• 大分子结合修饰：
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结 构发生某些精细改变，从而改变酶的特性和功能 的方法。目前使用最广的酶分子修饰方法。 常用的水溶性大分子修饰剂： 右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物 （Ficoll）、聚氨基酸等 使用前，一般需经活化，然后在一定条件下 与酶分子以共价键结合。
1．巯基的化学修饰
• 巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰剂与酶蛋 白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶 的空间构象、特性和功能。 • 常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺
2． 氨基 的化 学修 饰
3． 羧基 的化 学修 饰
4． 咪唑 基的 化学 修饰
5． 胍基 的化 学修 饰
三、研究热点-核酸类酶的修饰
酶修饰的方向
基本原理
第二节 酶化学修饰的方法及修饰剂
• 一、修饰剂的要求 • 二、 酶性质的了解 • 三、 反应条件的选择 • 四、 酶修饰方法
一、修饰剂的要求
• 根据修饰目的及其专一性 • 1． 修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋 白质的吸附性 • 2． 修饰剂上反应基团的数目及位置 • 3． 修饰剂上反应基团的活化方法与条件
• 酶蛋白侧链基团修饰:
组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团：氨基、 羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、胍基、 甲硫基等 可以使用各种小分子物质，也可使用大分子 物质。 水溶性大分子 水不溶性大分子属于酶的固定化
• 常见的小分子侧链基团修饰剂： • 氨基修饰剂：二硝基氟笨、醋酸酐、琥珀酸酐、
二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲酯、甲基异脲、顺 丁烯二酸酐； • 羧基修饰剂：酯化：乙醇-盐酸试剂、 酰基化： 碳化二亚胺、异恶唑盐、 • 胍基修饰剂：二羰基化合物：环己二酮、乙二 醛、苯乙二醛
修饰方法 (1)加入一定量的乙二胺四乙酸（EDTA）等金属螯合物到酶 液中，使酶分子中的金属离子与EDTA 形成螯合物，此时 酶成为无活性状态。 (2)通过透析或超滤、分子筛层析等方法，可将EDTA-金属螯 合物从酶液中分离除去。 (3)用不同的金属离子加入到酶液中，酶蛋白与金属离子结合。 (4)测活，选择适宜的金属离子作为修饰剂，去置换原来的金 属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。 例如：将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型 蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成 结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3 倍。
• 蛋白质工程
通过改造与蛋白质相对应的基因的碱基排列顺序，或 设计合成新的基因，将他克隆到寄主细胞中，通过基因表 达而获得具有新的特性的蛋白质的技术过程。 主要步骤如下： 新蛋白质结构的设计 突变基因的核苷酸序列的确定 突变基因的获得 新蛋白质的产生
• 物理修饰：
通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发 生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 特点：不改变酶的组分和基团，酶分子中的 共价键不发生改变，某些副键发生改变和重排。 高压处理 在变性剂处理后，不同温度处理恢复
酶的化学修饰
• • • • 第一节 第二节 第三节 第四节 概念 酶化学修饰的方法及修饰剂 酶分子侧链基团的化学修饰 酶化学修饰的应用
第一节 概念
• 概念：
通过各种方法使酶分子结构发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的过程。 凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质 共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。
• RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基 上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧 啶碱基上的氨基和羟基。
第三节总结
• 重要的修饰反应
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应 巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫基的化学修饰
• 肽链有限水解修饰：
利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生 某些精细改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 酶蛋白的肽链被水解后有3种情况： 引起酶活性中心的破坏，失去催化功能； 仍维持活性中心构象的完整，活力保持或损 失不多； 有利于活性中心与底物的结合，并形成准确 的催化部位，酶活力显著提高。 常用的水解修饰剂：专一性较强的蛋白酶或 肽酶。
一、 酶的化学修饰原因
1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要 2． 作用的最适条件不符 3． 酶的主要动力学性质的不适应 4． 临床应用的特殊要求
二、 酶修饰的方向
• 1． 核酸水平利用基因操作技术对DNA 或
mRNA 进行改造或修饰，以期获得化学结构（一 级结构和空间结构）更为合理的酶。 • 2． 蛋白质水平人们用化学法或酶法对酶的一 级结构进行改造，包括酶的一级结构中氨基酸的 置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的 空间构象变得更为稳定。另一方面是对酶分子中 氨基酸残基的修饰，即酶的化学修饰。
• 二、酶化学修饰的应用
1.生物技术领域
改变酶最适pH 改变酶底物专一性 有机溶剂可溶解酶 提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂的能力
• 2.理论研究 酶的大小形态和构象、空间结构研究 氨基酸数量的测定 确定酶的活性部位 氨基酸测序 氨基酸残基存在状态及功能测定 酶中特定基团间距离测定
• 3.医药领域 解除医用酶免疫源性和抗原性 延长医用酶体内半衰期 提高医用酶稳定性
用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试 剂应具有的特征：
选择性的与一个氨基酸残基反应； 反应在酶蛋白不变性的条件下进行； 标记的残基在肽中稳定，容易分离并鉴定； 反应的程度能用简单的技术测定。
二、 酶性质的了解
• 1． 酶活性部位情况 • 2． 酶的稳定条件、酶反应最适条件 • 3． 酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼 性等。
四、酶修饰方法
• 金属离子置换修饰 • 大分子结合修饰 • 肽链有限水解修饰 • 酶蛋白侧链基团修饰（选择性化学修饰） • 氨基酸置换修饰 • 物理修饰
• 金属离子置换修饰：
通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特 性和功能发生改变。 针对含有金属离子的酶，加进不同的离子，酶 呈现不同的活性。 常用的离子：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、 Co2+、Cu2+、Fe2+ 选择适宜的离子作为修饰剂，置换原来的离子。
• 巯基修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、
• 酚基修饰剂：四硝基甲烷 • 分子内交联剂：双功能化合物:二氨基丁烷、戊
二醛、己二胺等
硼氢化钠等酰化剂、烷化剂
• 氨基酸置换修饰：
将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸， 则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变 酶的某些特性和功能。 通过氨基酸置换修饰，可以提高酶活力或增 强酶的稳定性，更有利于酶的应用。
• 三、蛋白质化学修饰的局限性 1. 某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰 专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧 链绝对专一的修饰剂。
2.修饰酶的构象或多或少都有一些改变，这 种构象的变化妨碍对修饰结果的解释。
• 3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残 基上进行，其它氨基酸侧链在维持酶的空 间构象方面也有重要作用，目前还不能用 化学修饰得的方法研究这些氨基酸残基在 酶结构与功能关系中的作用。 • 4.酶的化学修饰法研究酶结构与功能的关系 尚缺乏准确性和系统性。
第二节总结
修饰剂的要求 酶性质的了解 反应条件的选择
酶修饰方法
第三节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应 二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 三、 研究新热点
一、几种重要的修饰反应
1．酰化及其相关反应
2．烷基化反应
3．氧化和还原反应
4．芳香环取代反应
二、 特定 氨基 酸残 基侧 链基 团的 化学 修饰
• 特定氨基酸残基 侧链基团的化学 修饰
第四节 酶化学修饰的应用
• 一、修饰酶的性质及特点 酶修饰的目的 提高生物活性 增强在不良环境中的稳定性 针对特异性反应降低生物识别能力，解 除免疫原性 产生新的催化能力
• 修饰酶的性质及特点 • 一、热稳定性：增加 • 1．修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的 热稳定性。 • 2．增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。 • 二、抗原性：部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原 性上效果明显。 • 三、体内半衰期：延长 • 四、最适pH：有些酶经过化学修饰后，最适pH 发生变化 • 五、酶学性质的改变：绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度 没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。 • 六、对组织的分布能力变化：对组织的分布能力有所改变，能 在血液中被靶器官选择性地吸收。举例：辣根过氧化物酶。
三、 反应条件的选择
• 条件要求：修饰反应能顺利进行；不造成蛋 白质不可逆变性；有利于专一性修饰蛋白质 • 1． 反应体系中酶与修饰剂的分子比例 • 2． 反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件 • 3． 反应温度及时间
实现修饰专一性的几条途径： 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 选择不同的反应pH 利用某些产物的不稳定性 亲和标记 差别标记 利用蛋白质增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水 解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
第一节总结
化学修饰原因
稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 作用的最适条件不符。 酶的主要动力学性质的不适应。 临床应用的特殊要求。 核酸水平 蛋白质水平 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境