a-淀粉酶发酵的生产工艺
实验6：a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
糖化淀粉酶
葡萄糖
Hale Waihona Puke 遇碘显蓝色 枯草杆菌淀粉 5ml注射器
a-淀粉酶的固定化 可溶性淀粉溶液 KI-I2溶液
反应柱 固定化酶
筛板 气门心 夹子
收集流出液， 收集流出液，鉴定
1.如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶?
◦ 可在试管中加入1ml可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出 液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中 没有淀粉酶了。
直接使 用酶
酶既能与反应物接 触，又能与产物分 固定化 离，同时，固定在 酶 载体上的酶还可以 被反复利用
将酶固定化的方法
包埋法
将酶包埋在细微网格里
交联法 将酶相互连接起来 吸附法 将酶吸附在载体表面上
实验原理：用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上， 一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉 水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红 色表明水解产物糊精生成
淀粉
α-淀粉酶
糊精
遇碘显红色
β淀粉酶
麦芽糖
四月卷----(二) 二 四月卷
直接使用酶和固定化酶的优缺点
类型 优点 催化效率高 低耗能 低污染 不足 对环境条件非常敏感，容易 失活；溶液中的酶很难回收， 不能被再次利用，提高了生 产成本；反应后酶会混在产 物中，难分离 在生产实践中，很多产物 的形成都通过一系列的酶 促反应才能得到的 难以一次性固定化多种酶
2.耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途?
◦ 可以在高温下使淀粉快速水解，而且酶不会因高温上而失 活，所以可在一些需要高温加热同时又要水解淀粉的反应 中使用。
a—淀粉酶 淀粉酶 (1)在a----淀粉酶的固定化过程中 首先要在烧杯中将 淀粉酶的固定化过程中,首先要在烧杯中将 在 淀粉酶的固定化过程中 于 4ml蒸馏水中 再将 石英沙 加入上述烧杯中 不时搅拌 蒸馏水中,再将 加入上述烧杯中,不时搅拌 不时搅拌30min , 蒸馏水中 再将5g 随后将烧杯中的物质装入1只下端接有气门芯并 随后将烧杯中的物质装入 只下端接有气门芯并 中, 最后用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器 倍体积的蒸馏水洗涤此注射器,除去那 最后用 倍体积的蒸馏水洗涤此注射器 除去那 用夹子封住的注射器 .. 些 未吸附的游离的淀粉酶 （2）请你设计一个实验证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液 ） 中已经没有淀粉酶了,写出实验设计思路 写出实验设计思路. 中已经没有淀粉酶了 写出实验设计思路
微生物工程、发酵工程复习题
第一篇微生物工业菌种与培养基一、选择题2．实验室常用的培养细菌的培养基是（）A 牛肉膏蛋白胨培养基B 马铃薯培养基C 高氏一号培养基D 麦芽汁培养基3．在实验中我们所用到的淀粉水解培养基是一种（）培养基A 基础培养基B 加富培养基C 选择培养基D 鉴别培养基7．实验室常用的培养放线菌的培养基是（）A 牛肉膏蛋白胨培养基B 马铃薯培养基C 高氏一号培养基D 麦芽汁培养基8．酵母菌适宜的生长pH值为（）A 5.0-6.0B 3.0-4.0C 8.0-9.0D 7.0-7.59．细菌适宜的生长pH值为（）A 5.0-6.0B 3.0-4.0C 8.0-9.0D 7.0-7.510.培养下列哪种微生物可以得到淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、多肽类抗生素、氨基酸、维生素及丁二醇等产品。
A 枯草芽孢杆菌B 醋酸杆菌C 链霉素D 假丝酵母二、是非题1.根据透明圈的大小可以初步判断菌株利用底物的能力( )2.凡是影响微生物生长速率的营养成分均称为生长限制性基质。
（）3.在最适生长温度下，微生物生长繁殖速度最快，因此生产单细胞蛋白的发酵温度应选择最适生长温度。
（）4.液体石蜡覆盖保藏菌种中的液体石蜡的作用是提供碳源( ).5.种子的扩大培养时种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌体的生长速度、产物品种、生产规模等（）6.碳源对配制任何微生物的培养基都是必不可少的．（）7.亚硝基胍能使细胞发生一次或多次突变,尤其适合于诱发营养缺陷型突变株,有”超诱变剂”之称.9.参与淀粉酶法水解的酶包括淀粉酶、麦芽糖酶和纤维素酶等。
（）三、填空题1.菌种扩大培养的目的是。
2.进行紫外线诱变时,要求菌悬液浓度:细菌约为,放线菌为 ,霉菌为 .3.培养基应具备微生物生长所需要的六大营养要素是_ ___、__ __、__ __、___ ___、__ __和____ ___。
4.碳源物对微生物的功能是__ __和__ __，微生物可用的碳源物质主要有___ _、___ _、__ _、__ _、__ __等。
a-淀粉酶发酵的生产工艺
武汉轻工大学设计α-淀粉酶的发酵生产工艺系部食品科学与工程学院专业粮食工程班级粮工1002姓名郑开旭学号100107502指导教师易阳2013年6月9日设计α-淀粉酶发酵的生产工艺摘要:α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
本次设计的淀粉酶发酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的生产工艺。
关键词：α-淀粉酶；工艺设计；发酵正文:α-淀粉酶的生产工艺1 α-淀粉酶的生产方法1.1生产方法的选择枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。
我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。
该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。
∙固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。
麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。
∙深层发酵法生产α-淀粉酶斜面菌种制法同前。
将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。
α-淀粉酶的生产工艺流程
α-淀粉酶的生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!α-淀粉酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、制药、洗涤剂等行业。
a-淀粉酶的生产工艺
a-淀粉酶的生产工艺
淀粉酶是一类能够水解淀粉并将其转化为糖类的酶。
它广泛用于食品、饲料、纸浆、
发酵等行业中。
1. 酶菌的选育和培养
淀粉酶可由多种细菌、真菌和原生动物合成，其中最常用的是泌秀菌和枯草芽孢杆菌。
选用高产菌株和适合生产的菌株进行发酵，产生高效淀粉酶。
2. 发酵工艺
发酵工艺是淀粉酶生产的关键步骤。
其主要过程是菌种培养、接种、发酵、分离等。
泌秀菌的发酵条件为温度35℃-42℃，pH为6.0-7.0，培养液中含有可溶性淀粉、氮源、
矿物质以及适量的辅助物质，如表面活性剂等。
枯草芽孢杆菌的发酵条件为温度37℃-55℃，pH为6.5-7.5，培养液中含有可溶性淀粉、氮源和矿物质等。
3. 酶液的提取和纯化
对发酵液进行酶液的提取和纯化，可以采用离心、过滤、超滤、稳态层析等方法。
离
心可将大颗粒杂质和沉淀物去除。
过滤和超滤可去除小颗粒杂质和未溶解物质。
稳态层析
能够去除其他蛋白质等酶外蛋白。
为增强淀粉酶的稳定性，可以将其进行稳定化处理。
稳定化的方法包括添加保护剂、
离子交换、交联、酯化等。
保存时，应避免酶液暴露在空气中、光照下或高温中。
一般情
况下，淀粉酶的保存温度应低于0℃。
总之，淀粉酶的生产工艺涵盖了选育和培养酶菌、发酵、酶液的提取和纯化、稳定化
和保存等多个环节。
只有采取稳定的生产工艺和高效的酶菌，才能获得高质量的淀粉酶产品。
实验二α-淀粉酶的初步纯化
完整版pt
9
四、实验方法
发酵液的预处理
将发酵液收集起来，过滤滤去菌体，收集
滤液，测量其体积。取5 mL出来留作淀粉 酶的活力测定，剩余发酵液则进行初步纯化。
在剩余发酵液中加入CaCl2 和Na2HPO4 各 0.8%-1%进行絮凝作用，并加热到55~60 ℃ 处理30 min，以破坏蛋白酶，促使胶体凝聚 后再过滤，收集滤液，测量其体积，并测酶
完整版pt
8
三、仪器和试剂
仪器：
分光光度计、恒温水浴锅（控温精度±0. 1℃）、 干燥箱、离心机、移液管、试管、烧杯、容量瓶、 玻璃棒、三角瓶、秒表、标签、培养皿、量筒、 漏斗、中速滤纸。
试剂：
碘、碘化钾、 α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠 檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有 限公司）、氯化钙、磷酸氢二钠、硫酸铵、乙醇。
医药、分析、科研
浓缩
浓缩
（蒸发、超滤、沉淀）
分离纯化
浓缩液 配方
（离心、沉淀、膜分离、 层析、电泳、萃取、结晶）
配方、制剂
干燥 液体酶
干燥 液体酶
固体酶
固体酶
完整版pt
4
二、实验原理
α-淀粉酶是一种胞外酶，胞外酶的初步分 离纯化通常是将发酵液经过预处理后采用 过滤或离心的方法将酶液与菌体分离，然 后在酶液中加入(NH4)2SO4 盐析沉淀获得 酶泥，最后干燥即可。
完整版pt
5
二、实验原理
在酶的分离纯化过程中，每步都需要测定 酶活力、体积，以计算酶的总活力和比活 力，进而计算酶活力回收率和纯化倍数， 以监测每步纯化步骤中酶的回收和纯化效 果，从而可以判断每步所使用的纯化手段 是否适宜目的酶的分离。
完整版pt
淀粉酶生产工艺
淀粉酶生产工艺淀粉酶作为一种重要的工业酶，广泛应用于食品、医药、饲料、糖化、纺织、皮革等领域。
下面将主要介绍淀粉酶的生产工艺。
淀粉酶的生产工艺通常分为两个步骤：种子培养和发酵生产。
1. 种子培养淀粉酶的种子一般由菌丝体制备而得，种子菌株的选取非常重要。
首先，从土壤、植物、食品中分离得到淀粉酶产生菌株，并经过传代培养筛选出优良菌株。
然后，选择合适的培养基进行菌株的预培养，以获得高活性和高产量的种子菌株。
培养基的选择要考虑到菌株的特性和经济性。
在种子培养过程中，通常采用摇瓶培养或容器培养的方式，控制好温度、pH值和氧气供应等条件，优化菌株的生长。
2. 发酵生产种子培养完成后，将种子菌株接种到大型发酵罐中进行发酵生产。
发酵过程需要控制好发酵温度、pH值、氧气供应和添加剂的投放等条件。
温度：淀粉酶的产生通常在30-50°C之间，具体温度要根据菌株的特性来确定。
温度过高或过低都会影响酶活性和产量。
pH值：淀粉酶一般在中性或微酸性环境下活性最高，一般在pH 5.0-7.0 的范围内进行发酵。
氧气供应：氧气供应对淀粉酶的产生有重要影响，因为淀粉酶属于需要氧气的好氧菌株。
因此，在发酵过程中需要控制好氧气的供应，提供充足的氧气以促进酶的产生。
添加剂：为了提高淀粉酶的产量和稳定性，常常会在发酵过程中添加一些助产剂或诱导剂，如优质动物蛋白、磷酸盐和氨基酸等。
这些添加剂能够提供菌株合成淀粉酶所需的营养物质，增加产酶能力。
发酵时间一般为24-72小时，根据菌株的生长速率和淀粉酶产量进行调整。
发酵过程中，可以通过监测酶活性和生物量的变化来掌握发酵的进程和产酶情况。
在发酵结束后，可通过离心、超滤等技术手段将淀粉酶提取和分离出来，经过加工和精制，最终得到纯净的淀粉酶产品。
综上所述，淀粉酶的生产工艺主要包括菌株的培养和发酵生产两个步骤。
通过控制好培养条件和发酵参数，能够提高淀粉酶的产量和质量，达到产业化生产的要求。
淀粉经a淀粉酶作用后的主要产物
淀粉经a淀粉酶作用后的主要产物
淀粉是植物体内储存能量的重要形式，是由α-葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键连接而成的多糖。
淀粉酶是一类能够催化淀粉分解的酶，可以将淀粉分解为较小的糖分子，其中主要产物包括葡萄糖、麦芽糖和低聚糖。
淀粉酶通过水解作用将淀粉分解为葡萄糖。
淀粉是由两种不同的多糖组成的：支链淀粉和直链淀粉。
支链淀粉由于其分支的存在，使得淀粉酶在催化过程中需经历两个步骤：首先是α-1,6-糖苷酶的作用，将支链切断，生成较短的直链淀粉；然后是α-1,4-糖苷酶的作用，将直链淀粉水解为葡萄糖分子。
淀粉酶还能将淀粉分解为麦芽糖。
麦芽糖是由两个葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键连接而成，是淀粉水解的中间产物。
在淀粉酶的作用下，一部分葡萄糖分子被水解为麦芽糖，而另一部分则继续被水解为单糖。
淀粉酶还能产生低聚糖。
低聚糖是淀粉水解的副产物，由3-10个葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键连接而成。
淀粉酶在催化淀粉分解的过程中，会产生一定数量的低聚糖，这些低聚糖可以被其他酶进一步水解为单糖。
淀粉经a淀粉酶作用后的主要产物包括葡萄糖、麦芽糖和低聚糖。
葡萄糖和麦芽糖是淀粉水解的主要产物，而低聚糖则是副产物。
这
些产物在生物体内具有重要的生理功能，可以为细胞提供能量和构建其他生物分子所需的原料。
深入研究淀粉酶催化淀粉分解的机制和产物的性质，对于理解生物体内能量代谢和糖类物质的合成具有重要意义。
α-淀粉酶的生产工艺
a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验用。
1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。
⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。
倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。
然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。
⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。
把disc培养皿经37C,24h分别培养。
⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。
a淀粉酶
2、酶的生产 ①提取法 定义：采用一定的技术直接从动植物或微生 定义： 物的组织、 物的组织、细胞中将酶提取出来 优点：简单易行， 优点：简单易行，在动植物或微生物资源 丰富的地区具有应用价值 实例：在屠宰厂，可以从家畜胰脏中提取出 实例：在屠宰厂， 胰酶；在水果加工厂，可以从菠萝皮中提取 胰酶；在水果加工厂， 出菠萝蛋白酶 缺点： 要有充足的原材料， 缺点： 要有充足的原材料，广泛应用受到 限制
4、酶制剂特点 ①天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶 天然酶通常对强酸、强碱、 剂等条件非常敏感， 剂等条件非常敏感，容易失活 ②溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高 溶液中酶很难回收，不能再次利用， 了生产成本 ③反应后，酶会混在产物中，影响产品质量， 反应后，酶会混在产物中，影响产品质量， 难以在工业生产中广泛应用
（四）直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点 直接使用酶、
类型 优点 不足 对环境条件非常敏感，容易失活； 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液 中的酶很难回收，不能被再次利用， 中的酶很难回收，不能被再次利用，提 高了生产成本；反应后酶会混在产物中， 高了生产成本；反应后酶会混在产物中， 可能影响产品质量 一种酶只能催化一种化学反应，而在生 一种酶只能催化一种化学反应， 产实践中，很多产物的形成都通过一系 产实践中， 列的酶促反应才能得到的 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近， 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近， 可能导致反应效果下降由于大分子物质 难以自由通过细胞膜， 难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞 的应用也受到限制
枯草杆菌α-淀粉酶的生产 -回复
枯草杆菌α-淀粉酶的生产-回复枯草杆菌是一种常见的土壤细菌，它具有广泛的生态功能和应用潜力。
其中，枯草杆菌所产生的α淀粉酶具有重要的工业应用价值。
本文将重点介绍枯草杆菌α淀粉酶的生产过程，并一步一步回答相关问题。
第一步：枯草杆菌的筛选和培养枯草杆菌存在于自然环境中，但数量相对较少。
因此，首先需要对土壤、水体等样品进行筛选，以获得富集了枯草杆菌的样品。
一般来说，筛选方法包括稀释平板法、滤膜法等。
将样品分别稀释后接种到富含淀粉的培养基上，通过观察形状、颜色等特征，选择出生长较好的菌落。
筛选获得枯草杆菌后，需要进行培养。
枯草杆菌的培养基一般包括有机氮源、无机盐和适度的碳源。
常用的培养基主要有液体培养基和固体培养基。
液体培养基的优点是便于大规模生产，而固体培养基适用于纯化和保存菌株。
第二步：对枯草杆菌的生理特性进行研究在获得培养好的枯草杆菌后，需要进一步研究其生理特性，了解其适宜生长条件和产酶规律。
主要考察的因素包括温度、pH、碳源和氮源等。
通过调整这些因素，可以获得最佳的生长条件，提高α淀粉酶的产量。
第三步：淀粉诱导条件的优化淀粉是枯草杆菌产生α淀粉酶的主要诱导物。
在培养基中添加适量的淀粉，并对其浓度、添加时间和添加方式等进行优化。
一般来说，较高的淀粉浓度和适当的诱导时间可以促进α淀粉酶的合成和分泌。
第四步：分离和纯化α淀粉酶枯草杆菌培养物中产生了大量的α淀粉酶，但还同时存在其他杂质和细胞碎片等。
因此，需要对培养物进行分离和纯化，以得到纯度较高的α淀粉酶。
分离和纯化方法主要有凝胶过滤、柱层析、凝胶电泳等。
其中，柱层析常用于大规模生产，通过调节柱层析的条件（例如树脂种类、流速等），可以将α淀粉酶与其他杂质分离。
第五步：对纯化后的α淀粉酶进行特性研究分离和纯化后的α淀粉酶需要进行特性研究，了解其催化特性、抗温性和酸碱稳定性等。
这些特性研究有助于评估α淀粉酶在不同工业应用中的潜力和适用性。
除了以上步骤，还可以利用遗传工程手段对枯草杆菌的基因进行改造，提高α淀粉酶的产量和活性。
微生物发酵工程复习试题_答案版
第一篇微生物工业菌种与培养基一、选择题2．实验室常用的培养细菌的培养基是（A）A 牛肉膏蛋白胨培养基B 马铃薯培养基C 高氏一号培养基D 麦芽汁培养基3．在实验中我们所用到的淀粉水解培养基是一种（ D）培养基A 基础培养基B 加富培养基C 选择培养基D 鉴别培养基7．实验室常用的培养放线菌的培养基是（C）A 牛肉膏蛋白胨培养基B 马铃薯培养基C 高氏一号培养基D 麦芽汁培养基8．酵母菌适宜的生长pH值为（ A ）4.5-5A 5.0-6.0B 3.0-4.0C 8.0-9.0D 7.0-7.59．细菌适宜的生长pH值为（ D ）A 5.0-6.0B 3.0-4.0C 8.0-9.0D 7.0-7.510.培养下列哪种微生物可以得到淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、多肽类抗生素、氨基酸、维生素及丁二醇等产品。
( A )A 枯草芽孢杆菌 B 醋酸杆菌 C 链霉素 D 假丝酵母二、是非题1.根据透明圈的大小可以初步判断菌株利用底物的能力( X )2.凡是影响微生物生长速率的营养成分均称为生长限制性基质。
（X ）3.在最适生长温度下，微生物生长繁殖速度最快，因此生产单细胞蛋白的发酵温度应选择最适生长温度。
（ X ）4.液体石蜡覆盖保藏菌种中的液体石蜡的作用是提供碳源( X ).5.种子的扩大培养时种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌体的生长速度、产物品种、生产规模等（√）6.碳源对配制任何微生物的培养基都是必不可少的．（√）7.亚硝基胍能使细胞发生一次或多次突变,尤其适合于诱发营养缺陷型突变株,有超诱变剂之称.√9.参与淀粉酶法水解的酶包括淀粉酶、麦芽糖酶和纤维素酶等。
（X）三、填空题1.菌种扩大培养的目的是接种量的需要、菌种的纯化、缩短发酵时间、保证生产水平。
2.进行紫外线诱变时,要求菌悬液浓度:细菌约为10^6个/mL,放线菌为,霉菌为10^6~10^7个/mL.3.培养基应具备微生物生长所需要的六大营养要素是碳源、氮源、无机盐和微量元素、前体、促进剂和抑制剂和水。
α-淀粉酶结构
α-淀粉酶结构引言：α-淀粉酶是一种重要的酶类蛋白，广泛存在于生物体内。
它在食物消化、工业生产和医学应用等方面具有重要作用。
本文将主要介绍α-淀粉酶的结构特点和功能。
一、α-淀粉酶的基本结构：α-淀粉酶是一种酶类蛋白，它由多肽链组成，具有复杂的三维结构。
其结构特点主要包括以下几个方面：1.1 氨基酸序列：α-淀粉酶的氨基酸序列决定了其空间结构和功能。
通过测序技术可以确定α-淀粉酶的氨基酸序列，从而进一步研究其结构和功能。
1.2 二级结构：α-淀粉酶的二级结构主要包括α螺旋和β折叠。
这些二级结构的排列方式决定了α-淀粉酶的立体结构和稳定性。
1.3 三级结构：α-淀粉酶的三级结构是指其氨基酸链的空间排列方式。
它由多个不同的结构域组成，包括催化结构域、结合结构域等。
这些结构域相互作用形成具有特定功能的酶活性中心。
二、α-淀粉酶的功能：α-淀粉酶作为一种消化酶，在生物体内起着关键的作用。
它的功能主要包括以下几个方面：2.1 淀粉消化：α-淀粉酶能够将淀粉分解成糊精和糊精酶。
糊精酶进一步将糊精分解成葡萄糖，提供能量给生物体。
2.2 食物消化：α-淀粉酶在胃和小肠中发挥作用，帮助人体消化食物中的淀粉，使其转化为可供人体吸收利用的简单糖类。
2.3 工业生产：α-淀粉酶在工业生产中也有重要应用。
它可以用于酿造、制糖、制醋等过程中，促进淀粉的降解和转化，提高产品质量和产量。
2.4 医学应用：α-淀粉酶在医学上也具有一定的应用价值。
它可以用于治疗胃肠道疾病、辅助食物消化和促进营养吸收等方面。
三、α-淀粉酶的研究进展：随着科学技术的不断发展，对α-淀粉酶的研究也取得了许多重要进展。
3.1 结构解析：通过X射线晶体学和核磁共振等技术，研究人员对α-淀粉酶的结构进行了深入解析，揭示了其复杂的三维结构。
3.2 功能研究：通过对α-淀粉酶的功能及其活性中心的研究，人们对其催化机理和底物特异性有了更深入的了解。
3.3 应用拓展：近年来，研究人员还通过工程菌株和蛋白工程等手段，改造和改良α-淀粉酶，使其在工业生产和医学应用中发挥更大的作用。
a-淀粉酶
4 医药中的应用 由于黑曲霉a-淀粉酶具有耐酸 性，故可用来制造帮助消化一类的药物，开 发适合于胃酸性环境的耐酸性a-淀粉酶，用 于制备消化助剂。 5饲料中的应用 在饲粮中添加外源a-淀粉酶可 以帮助幼龄动物消化利用淀粉，其生长性能 与饲料转化率十分有益。肉鸡日粮中添加产 a-淀粉酶的活大肠杆菌培养物可以起到抗生 素生长促进剂的作用，改善肠道形态，提高 生产性能。
a-淀粉酶的应用
1 食品工业 a-淀粉酶具有液化作用和糖化 作用，在饮料工业中常常用作甜味剂。在 冷饮中，使冷饮黏度降低，流动性增高， 保证高淀粉冷饮的口感。在面制品行业中 作为安全、高效的改良剂，可改良面包品 质。另外耐高温 a-淀粉酶作为一种新型液 化酶制剂，大量应用于发酵行业，其热稳 定性是由蛋白质本身的热稳定性决定的， 所以广泛应用于啤酒酿造和酒精工业等
收集发酵液，高速冷冻离心机离心，弃沉淀收集上清液 ↓ 硫酸铵沉淀，置于4℃下静置过夜，离心，收集沉淀 ↓ 少量醋酸缓冲液溶解沉淀，透析除盐，超滤浓缩酶液 ↓ DEAE Sepharose 离子交换层析，分管收集，测酶活将酶 活较高的各管合并，超滤浓缩 ↓ 相应的缓冲液溶解，Sephacry S-200凝胶层析，分管收集， 测酶活将最高管收集，超滤浓缩 ↓ SDS-PAGE电泳进行酶纯度检测
a-淀粉酶在30~90 ℃ 时都有活力,最适反应 温度为55 ℃ ，在40~70 ℃有较高活力， >70 ℃时活力较低。在PH 6.0~9.0 有较高 的活力，
钙离子、锰离子、钴离子对酶活有强烈激活 作用，EDTA部分抑制淀粉酶活性
a-淀粉酶的分离纯化
发酵产a-淀粉酶的过程中，发酵液中除了含有a淀粉酶外还有其他杂质，所以要对发酵液进行 目标蛋白质的提纯。 对a-淀粉酶的分离纯化 最常用的方法就是： 预处理→硫酸铵沉淀→脱盐→层析分离
淀粉酶
α-淀粉酶是一种金属酶，每分子酶含有一 个Ca² ，Ca² + ﹢可使酶分子保持相当稳 定的构象，从而可以维持酶的最大活性及 热稳定性。 Ca² ﹢对酶的结合度，按产生菌而言依次 是霉菌＞细菌＞动物＞植物。除了Ca² ﹢ 其他金属离子也可以提高酶的热稳定性。
催化机制
α-淀粉酶的催化过程包括三步，共发生2次置换 反应。
结构
研究表明所有α-淀粉酶均为分子量在50ku左右 的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中 心区域A由一个(β/α)8圆筒构成；区域B由一个 小的β-折叠突出于β3和α3之间构成；而C-末端 球型区域C则由一个Greek-key基序组成，为该 酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。 为保持α-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要 一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是α-淀 粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的 α-淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保 守的。
a-淀粉酶
张杨
LOGO
简介 a-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高 等植物，其国际酶学分类编号为 EC.3.2.1.1，作用于淀粉时分子的内部随 机切开a-1,4糖苷键，生成糊精和还原糖， 由于产物的末端残基碳原子构型为A型，故 称α-淀粉酶。 现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随 机切开a-1,4糖苷键,起液化作用的一类酶 。
分离纯化及活性测定方法
分离提纯
高纯度α－淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂 ，可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常 数等。分离纯化α－淀粉酶的方法很多，一般都是 依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、 稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到 高纯度α－淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用 。 通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶 电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸 性α一淀粉酶进行纯化，得到电泳纯级的超耐热耐 酸α一淀粉酶，纯化倍数为11．7，活力回收率 为29.8%。但上述方法存在的共同问题是，连 续操作和规模放大都比较困难。
测定α-淀粉酶活力的方法
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。
酶催化的反应称为酶促反应。
生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。
For personal use only in study and research; not for commercial use能提高酶活力的物质，称为激活剂。
激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。
使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。
氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。
应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。
酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。
温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。
同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。
食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。
但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。
α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。
α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。
a-淀粉酶产菌株筛选实验
a-淀粉酶高产菌株的分离鉴定及固定化枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究中应用广泛。
其芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
广泛生长在中性的的含淀粉多的环境中，如富含淀粉的面粉厂、土壤等。
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。
淀粉酶家族包括α- 淀粉酶、β- 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α- 1，4 糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。
β- 淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。
葡萄糖淀粉酶是一种作用于α- 1，4 糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。
a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题，其中α -淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。
另可尝试探索用一定浓度的凝胶包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交联法将枯草芽孢杆菌固定化，使菌体不能流动而酶可以存在反应液里。
凝胶柱底部可选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物可以流出。
【实验一】一、a-淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选二、【实验原理】大多数枯草芽孢杆菌好氧，最适生长温度为32℃,PH为7.2，转速为140r/min，接种量为9％，芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min。
在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线法分离纯化出产a-淀粉酶的菌株，根据是否可产生透明圈来筛选。
透明圈越大，产酶能力越强。
三、【实验仪器和材料】1、试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml；B 液：0.0l% KOH l00ml。
淀粉经a淀粉酶作用后的主要产物
淀粉经a淀粉酶作用后的主要产物淀粉是一种由葡萄糖分子组成的多糖，是植物中储存能量的主要形式。
它存在于许多植物的种子、块茎和根部中，并且在人类的日常饮食中也是一种重要的碳水化合物来源。
当淀粉遇到a淀粉酶时，酶会催化淀粉的分解，产生多种产物，其中包括麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等。
a淀粉酶作用后的主要产物之一是麦芽糖。
麦芽糖是由两个葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键连接而成的二糖。
a淀粉酶能够将淀粉链中的α-1,4-糖苷键水解，释放出单个的葡萄糖分子，这些葡萄糖分子再通过α-1,4-糖苷键连接在一起形成麦芽糖。
麦芽糖是一种甜味物质，在食品工业中被广泛应用，如啤酒、糖果等。
a淀粉酶作用后的另一个重要产物是麦芽三糖。
麦芽三糖是由三个葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键连接而成的三糖。
a淀粉酶在水解淀粉链的过程中，当水解到淀粉链上的第三个葡萄糖分子时，会停止水解，形成麦芽三糖。
麦芽三糖在食品工业中也有一定的应用，如在面包、饼干等烘焙食品中作为添加剂，可以增加其甜味和口感。
a淀粉酶作用后的另一种产物是麦芽四糖。
麦芽四糖是由四个葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键连接而成的四糖。
当a淀粉酶进一步水解麦芽三糖时，会形成麦芽四糖。
麦芽四糖在食品工业中也有一定的应用，如在饮料、冰淇淋等中作为甜味剂使用。
除了以上提到的主要产物外，a淀粉酶还能产生一些其他的产物。
根据酶的作用位置和特异性，淀粉分解还会产生葡萄糖、麦芽五糖、麦芽六糖等。
这些产物在食品工业中也有着各种各样的应用，如在糕点、果酱等食品中作为添加剂，用于增加甜味和改善口感。
a淀粉酶在淀粉分解过程中起着重要的作用，可以将淀粉分解为多种产物，包括麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等。
这些产物在食品工业中有着广泛的应用，不仅能够增加食品的甜味，还可以改善口感和增加食品的营养价值。
通过研究淀粉经a淀粉酶作用后的主要产物，我们可以更好地理解淀粉的分解过程，并且可以为食品工业的发展提供有益的参考。
a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验教案--
实验三 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测一、实验目的1.制备固定化的淀粉酶。
2.进行淀粉水解的测定。
二、实验原理用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。
这里使用的是枯草杆菌的a-淀粉酶，其作用的最适pH 范围为 5.5-7.5，最是温度为50-75℃。
1、酶的固定化酶：生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。
固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
一般酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。
吸附法：P32利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。
通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
2.石英砂的吸附作用石英砂吸附酶的物理吸附也称范德华吸附，它是由吸附质和吸附剂分子间作用力所引起，此力也称作范德华力。
由于它是分子间的吸力所引起的吸附，所以结合力较弱，吸附热较小，吸附和解吸速度也都较快。
被吸附物质也较容易解吸出来，所以物理吸附在一定程度上是可逆的。
3.淀粉酶催化反应 淀粉酶：淀粉酶是指一类能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷键的酶之总称。
淀粉酶包括α—淀粉酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、麦芽寡糖生成酶等水解酶类和葡萄糖苷转移酶、环状糊精葡萄糖苷转移酶等。
α—淀粉酶是一种内切酶，它随机地从分子内部切开α—1．4糖苷键(水解中间的α—1．4键比分子末端的α—1．4键概率大)，遇到分支点的α—1．6键不能切，但能跨越分支点而切开内部的α—1．4糖苷键，由于产物的还原性末端葡萄糖残基上的C1碳原子呈直接使用酶缺点固定化酶优点 通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间地储存和使用；（更能耐受温度、PH 的变化） 溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本固定化酶可以被反复使用，更经济，更利于生产 反应后会混在产物中，可能影响产品质量(难分离） 酶既能与反应物接触，又能与产物分离纯化α—构型(光学)，故称这种酶为α—淀粉酶。
a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验方案
实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用背景资料一、酶酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。
具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。
1．高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；2．专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；因此在食用酵素当今在功能上，主要有四种：高浓缩SOD酵素如复方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿等肿瘤方面；长生酵素直接补脾补肾补气血，全面调理；纤体酵素专门转化脂肪减肥；肠毒清酵素则专门清理肠皱褶的毒素。
3．多样性：酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。
4．温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的，因此，纯正酵素是中性的，温和的，不存在副作用，或“好转反应”。
对于有刺激性而必然存的“好转反应”，除了本身腐败以外，也有可能有药品的添加。
5．活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
6.易变性：大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏；7.有些酶的催化性与辅助因子有关。
酶与无机催化剂的比较但酶易受环境影响而失活，包括温度、PH值等，例如一般来说动物体内的酶最适温度在35到40℃之间，植物体内的酶最适温度在40-50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。
动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.8，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。
另外，反应中反应产物和酶的分工和回收困难等缺点限制了酶在工业上的广泛应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
武汉轻工大学设计α-淀粉酶的发酵生产工艺系部食品科学与工程学院专业粮食工程班级粮工1002姓名郑开旭学号100107502指导教师易阳2013年6月9日设计α-淀粉酶发酵的生产工艺摘要:α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
本次设计的淀粉酶发酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的生产工艺。
关键词：α-淀粉酶；工艺设计；发酵正文:α-淀粉酶的生产工艺1 α-淀粉酶的生产方法1.1生产方法的选择枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。
我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。
该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。
∙固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。
麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。
∙深层发酵法生产α-淀粉酶斜面菌种制法同前。
将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。
然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时。
当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时。
中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1∕3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。
停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老，80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。
而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。
冷却到35℃，加入硅藻土为助滤剂过滤。
滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真空浓缩数倍后，加（NH4）2SO4盐析，盐析物加硅藻土后压滤，滤饼于40℃烘干，磨粉而成。
按此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70％。
对于固体发酵有以下缺点：1. 限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较适合于真菌。
2. 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。
3. 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固体发酵，pH值、湿度、基质浓度不易调控，Biomass不易量测，每批次发酵条件不易一致，再现性差。
4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到均匀。
5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。
6. 固体发酵的培养时间较长，其产量及产能常低于液体发酵。
7. 萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。
而对于发酵罐深层培养具有生产周期短、产量高、效益大等优点故选用层发酵法生产α-淀粉酶。
1.2 α-淀粉酶培养基的制作（1）培养基的类型培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。
微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。
（2）孢子培养基孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。
对孢子培养基的要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。
α-淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。
（3）种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。
对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。
α-淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.1～7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。
（4）发酵培养基发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。
α-淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h.本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。
设计流程如下：孢子→锥形瓶→种子罐→发酵罐（1）孢子制备将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。
(2)种子制备将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·7H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.7～7.0），37℃培养3天。
然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。
此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。
(3)发酵罐培养培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、Na2HPO4·12H2O0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至6.5～7.0。
发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。
培养条件为：温度37±1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h 为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培养时间为28～36 h。
（二）此培养基的制备1.培养基的制备与灭菌发酵培养基：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。
分装于100mL 锥形瓶中，每瓶50mL，121℃灭菌20min。
2.接种与产酶培养接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。
37℃振荡培养48 h。
3.离心将发酵液置高速冷冻离心机中10000r/min离心10 min，除菌体，上清液即为α－淀粉酶粗酶液。
2 α-淀粉酶的菌种选育α-淀粉酶生产：以枯草芽孢杆菌14140为出发菌株,经亚硝基胍反复多次处理和筛选生产α-淀粉酶。
分离纯化：以CTAB/正丁醇/异辛烷构成反胶团系统,通过反胶团萃取方式纯化精制α-淀粉酶。
最佳反应条件为：萃取温度40℃，水相组成为NaCl0. 03 mol/L，pH 12. 0，有机相：无机相=1∶2，振荡时间10 min；反萃取最佳条件为：温度60℃，水相组成为KCl3 mol/L，pH 4. 0，有机相∶无机相=2∶1，反萃取振荡时间10 min。
在上述条件下，经过一个萃取与反萃取循环后，α-淀粉酶的萃取率最高可达90. 78%。
2.1 菌株与培养方法2.1.1 培养基BY斜面培养基每100 g含可溶性淀粉1 g ，牛肉膏1 g，蛋白胨1 g，酵母膏0.2 g，NaCl 0.5 g，琼脂2 g. BY发酵培养基每100 g含可溶性淀粉5 g，牛肉膏1 g，蛋白胨1.5 g，酵母膏0.2 g，NaCl 0.5g，CaCl21 g。
调节pH7.0，经121℃，灭菌30 min，备用。
2.1.2 仪器设备全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
2. 2 实验方法2．2．1 细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-3 、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验用。
2．2．2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
2.3 诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量(μg/ml)，在一定pH值的缓冲液中30℃恒温振荡处理1~4 h。
③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24 h培养形成小菌落。
⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30℃培养36 h。
⑥用2#定性滤纸制成5 mm disc(小圆纸片)，并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素(抑菌)。
倒入200 mm×300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。
然后把5 mm disc纸顺序放在培养基表面。
⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。
把disc培养皿经37℃，24h分别培养。
⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc，用相对应的1 ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。