如何用PCR法检测基因的多态性

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采用PCR-CTPP检测白细胞介素2基因多态性

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中国实验诊断学２Ｏ年５Ｏ７月
第ｌ卷第５１期
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文章编号：０７— ２７２Ｏ）５５９ｏ１０４８（Ｏ７Ｏ～０６一３
采用ＰＲＣＰＣ．ＴＰ检测白细介素２基因多态性胞
或Ｇ的单核苷酸的多态性，并与测序结果相符合。１１０位体检个体中Ｔ纯合子为４例（２６，Ｇ纯合子为ｌ例ｒ３４．％）Ｇ１

等位基因特异性PCR在ACE基因多态性检测中的应用

等位基因特异性PCR在ACE基因多态性检测中的应用目的：采用等位基因特异性PCR法对ACE基因多态性进行检测，并对脑血管疾病（CVD）与ACE基因多态性的相关性进行探讨。

方法：将2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族共73例CVD患者（CVD组）和43例健康人员（对照组）进行ACE基因多态性检测，并对结果进行分析。

结果：116例受检人员均获得扩增产物，CVD组患者73例扩增产物中，DD型14例（19.2%），II型30例，ID型29例；对照组43例扩增产物中，DD型5例（11.6%），II型19例，ID型19例，对照组中DD型基因频率低于CVD组，差异无统计学意义（P>0.05）。

结论：等位基因特异性PCR检测技术可对ACE基因多态性进行有效检测，对于CVD的防治具有重要的参考意义。

标签：等位基因特异性PCR；脑血管疾病；ACE基因多态性脑血管疾病（cerebrovascular disease，CVD）由脑血管病变所引起，主要高发于65岁以上人群，患者发病后易残留后遗症，导致劳动和生活能力丧失，也是人类死亡的重要原因之一。

CVD主要分为缺血性脑血管病和出血性脑血管病，其中以缺血性为多见。

CVD的产生由遗传因素和环境因素共同作用所引起，高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病是CVD发生的首要高危因素[1]，而血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性与高血压等心血管疾病的发生有关[2]。

笔者选择等位基因特异性PCR技术对云南景颇族和傣族73例CVD患者的ACE基因多态性进行检测，以期为ACE基因多态性与CVD的相关性提供临床依据，现将结果报道如下。

1 资料与方法1.1 一般资料选取2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族46例健康人员（对照组）和73例CVD患者（CVD组），取早晨空腹静脉血10 ml，肝素抗凝后离心分离血浆，采用酚抽提法抽提患者外周血白细胞DNA模板，所有受检人员无血缘关系。

基因多态性的检测方法

基因多态性的检测方法一、直接方法1.目标基因测序：通过对目标基因进行测序，可以直接得到其等位基因的序列信息。

目前，高通量测序技术的发展使得测序成为一种常用的基因多态性检测方法。

2.杂交技术：杂交技术可以用于检测单核苷酸多态性（SNP）和小片段插入/缺失等变异。

常用的方法包括限制性片段长度多态性（RFLP）和串联重复片段多态性（VNTR）等。

3.聚合酶链反应（PCR）：PCR可以通过扩增目标片段的方法，检测基因多态性。

例如，引物在目标序列上的配对使得PCR扩增产物的长度与目标基因的等位基因有关。

通过测定扩增产物的长度变化，可以确定基因多态性。

4.克隆测序：克隆测序是一种将目标基因克隆到载体中，并对克隆的DNA进行测序的方法。

这种技术可以用于检测较大的插入/缺失变异以及基因拷贝数变异等。

二、间接方法1.单核苷酸多态性（SNP）芯片：SNP芯片是一种高通量并行检测SNP 的技术。

它通过固定在芯片上的特异性探针与待测样品中的SNP位点进行杂交，然后使用荧光信号检测方法来确定不同等位基因的存在情况。

2.DNA芯片：DNA芯片可以广泛用于基因多态性的检测。

它可以同时测定数百甚至数千个基因，快速、准确地检测多个等位基因的存在情况。

3.高分辨率融解曲线分析：高分辨率融解曲线分析可以用来区分等位基因之间的序列差异。

该方法通过双链DNA在升温过程中解旋变性的温度差异，来分析目标序列中的等位基因。

4. 二代测序技术：二代测序技术（如Illumina和Ion Torrent）基于多组重叠的小片段测序，可以用于高通量的基因多态性检测。

它可以同时测定数百万个SNP位点，识别多个等位基因的存在情况。

综上所述，基因多态性的检测方法涵盖了直接方法和间接方法。

这些方法可以用于检测单核苷酸多态性、插入/缺失变异、基因拷贝数变异等不同类型的基因多态性。

随着技术的不断发展，基因多态性的检测方法将变得更加高效、准确和经济。

如何用PCR法检测基因的多态性

如何用PCR法检测基因的多态性PCR法（聚合酶链反应法）是一种广泛应用于分子生物学领域的基因检测技术。

它能够在短时间内扩增特定序列的DNA片段，从而实现对基因多态性的检测。

以下是使用PCR法检测基因多态性的步骤：1.设计引物首先，需要根据目标基因的序列设计引物（寡核苷酸序列）。

引物一般包括一对前、后引物，它们各自与目标序列的两侧互补配对。

引物的设计应考虑到目标基因区域的多态性，以确保引物与所有可能的变体都能配对。

2.提取DNA从目标生物体的组织样本（如血液或组织）中提取DNA。

DNA提取方法可以选择物理法或化学法，如离心法和盐析法等。

3.PCR反应将提取到的DNA作为PCR反应的模板，加入引物、四个核苷酸和聚合酶等反应物，进行PCR反应。

PCR反应由多个循环组成，每个循环包括DNA的变性、引物的结合和DNA的扩增。

4.凝胶电泳分析将PCR反应产生的扩增产物进行凝胶电泳分析。

凝胶电泳是一种将DNA分子根据大小分离的方法。

将PCR产物加载到琼脂糖凝胶槽中，然后通过电场进行电泳。

根据其大小，DNA片段将在凝胶中移动到不同的位置。

通过与大小已知的DNA分子比较，可以确定PCR产物的大小。

5.基因型分析通过比较PCR产物的大小，可以检测到基因的多态性。

在不同基因型的个体中，PCR产物的大小可能会有所不同。

可以将PCR产物分成不同的等级，以进行基因型分析。

6.数据分析最后，对PCR结果进行数据分析和解释。

根据PCR产物的大小和基因型等信息，可以确定个体的基因型。

如果一些基因型与一种特定的表型相关联，那么可以推测该基因是多态的，并且可能与该表型相关。

除了上述步骤，还可以通过引入序列特异性的限制酶切位点、单特异性引物扩增等方法，进一步确定基因多态性。

此外，PCR法还可以与其他技术如测序、SNP分析等相结合，以获得更详细的多态性信息。

总之，PCR法是一种快速、敏感且广泛应用的检测基因多态性的方法。

通过合理的引物设计、PCR反应、凝胶电泳和数据分析等步骤，可以确定基因的多态性及其与表型相关性，为遗传研究和疾病诊断等领域提供重要信息。

PCR-单链构型多态性分析

银染原理
根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基，一定条件下可以与银离子结合，在甲醛等还原剂的作用下，形成黑或褐色的银沉淀条带。
银染过程
凝胶
10%乙酸、30%乙醇固定10min
dH2O漂洗两次
0.1%AgNO3 染色10min
dH2O漂洗两次
2.5%碳酸钠-0.03%甲醛显色 1%乙酸终止 dH2O漂洗
PCR-SSห้องสมุดไป่ตู้P 的应用
1.基因点突变的监测 2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查
2. 将提取的DNA在20l变性溶液（95% 甲酰胺、1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、 0.05%二甲苯青），95℃ 10分钟，冰浴 3分钟。
3. 将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶板孔中，在含1xTBE的电泳液中，电泳。
4. 将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄膜上，烘干后以放射自显影拍摄记录。或银染色
SSCP原理
在SSCP凝胶中电泳时，单链DNA的泳动速率主要取决于二级空间结构，因此若DNA片段中碱基发生突变，将会引起单链DNA二级空间结构的改变，使 SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带（即 SSCP 阳性）。
PCR-SSCP 操作步骤
1. 常规PCR扩增DNA片段或其他被标 DNA片段的提取。
影响PCR-SSCP的因素
1.DNA片段大小 2.复制错误发生 3.电泳条件 :（1）丙烯酰胺的浓度
（2）交联剂的浓度（3）电泳的物理环境（4）甘油浓度
PCR-SSCP与RFLP比较
无需特殊的限制性内切酶作用可测出理论上任何一个碱基突变位点操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂电泳条件的改变容易影响SSCP
PCR-单链构型多态性分析

检测目的基因的方法

检测目的基因的方法现代基因检测技术逐渐成为生命科学领域重要的工具之一。

在检测目的基因时，科学家可以运用多种方法。

下面将介绍几种常见的目的基因检测方法。

1. 聚合酶链反应（PCR）PCR是一种常用的基因检测方法，通过扩增DNA片段来检测目的基因。

PCR 包括三个步骤：变性、退火和延伸。

变性过程中，高温将DNA双链分离；退火过程中，引物与目的DNA序列互补结合；延伸过程中，酶聚合物延伸引物，并复制目的DNA。

PCR可以在短时间内扩增特定DNA片段，为后续分析提供足够的样本。

PCR技术在医学、生物学和犯罪学等领域广泛应用。

2. 基因测序基因测序是确定DNA序列的方法，可用于检测目的基因是否存在突变或多态性。

测序技术包括传统的电泳测序和新兴的高通量测序。

传统电泳测序通过测量DNA链延伸过程中释放的辅助标记物（如荧光标记的二聚脱氧核苷酸）来确定序列。

高通量测序同时测定数百万个DNA片段，大大提高了测序速度和效率。

基因测序技术广泛应用于疾病诊断、遗传研究和基因组学研究。

3. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA是一种常用的免疫学方法，通过检测目的基因的蛋白质水平来间接确定基因的表达情况。

ELISA主要分为直接ELISA和间接ELISA两种类型。

直接ELISA 将特异性抗体直接与目的基因相关的蛋白质结合，通过检测酶标记来定量检测目的基因的蛋白质水平。

间接ELISA则需要两个不同的抗体，一个与目的基因相关的抗体，另一个与第一个抗体结合的酶标记抗体。

通过间接ELISA，可以更加灵敏地检测目的基因的表达水平。

4. 基因芯片技术（Microarray）基因芯片是用于高通量基因检测的一种技术。

它可以同时检测数千个基因的表达水平，有助于揭示多基因与疾病发生和发展之间的关联。

基因芯片通常包括一系列具有不同基因特异性探针的微型孔洞，这些探针可以与待检测样本中的特定基因序列杂交。

然后，通过对信号的检测和分析，可以确定各个基因的表达水平。

PCR—RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C／G多态性的实验研究

ｐｉ（ＣｈｓｍＰＲ—ＲＬ）．ｔｏ．ＴｅｍｉｆｅｔｌａｔｓｅｅｄｔｃｅｙＰＲｉｓｒｌｏｃｎｒｔｎｇａＦＰＭｅｈｄｈａｎｉｌｎｉｃｏｒｅｅｔｄｂＣｅａｃｎｅｔｉｒ— ｎｕａｆｒｗｎｉａｏ
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昆明医学院学报
２００６，（）２— ５５：３３
ＣＮ３一ｌ４／５Ｏ９Ｒ
ＪｕｎｌｏｎｎｅｉａｌｇｏｒａｆＫｕｍｉｇＭｄｃｌＣｏｌｅｅ
论著
ＰＲ —ＲＬＣＦＰ技术检测ＲＴＳ基因启动子区一２ＣＧＡＮＥ８／
［ｙｗｏｄ］ＰｌｅａｅｃａａｔｎｅｔｃｏａｍｅｔｅｇｏｙｒｈｓＫｅｒｓｏｍｒｓｈｉｒｃｏ；Ｒｓｔｎｆｇｎｎｈｐｌｐｉｙｎｅｉｉｒｉｒｌｔｍｏｍ；ＲＮＥｅｅｘＡＴＳｇｎ；Ｅ —
Ｇｅｏｏｅｇｏ・２ｎｅＰｒｍｔｒＲｅｉｎ－８Ｃ／Ｇｌｍｏｐｉｍ－Ｐｏｙｒｈｓ

ＬＩＨｕｉ— ｆｎ ¨ ａｇ
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ＬＩＨｕ，ＳＵａＯＮＤａ —ｐｉｇＤｉｎｎ¨
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ＷＡＮＧＹｕ — ｍｉｇ）ｎ
对主要影响因素设系列浓度梯度进行ＰＲ后观察电泳结果，设置不同的体系对ＲＬＣＦＰ方法进行了研究．最适变性温度为９４℃；最适退火温度为６０ｏＣ；最适引物浓度为０６ＩｏＬ．ｍｌ；最经济有效的酶切体系为ｘ／最佳的实验条件的摸索是进行大批量实验研究的关键．［关键词］聚合酶链反应；限制性片段长度多态性；ＲＴＳ基因；实验条件ＡＮＥ［中图分类号］Ｒ９．；Ｒ８．３４３５７１［文献标识码］Ａ［文章编号］１０４０（０６５—０３００３— ７６２０）００２— ４

pcr分析方法

PCR分析方法一、引言PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的核酸分析技术。

PCR方法通过体外放大DNA片段，以便于后续的分析和研究。

PCR方法的引入，在遗传学、病原微生物检测、基因工程等领域都发挥了重要作用。

本文将介绍PCR方法的原理、步骤和应用。

二、PCR原理PCR方法是在体外复制DNA片段的技术，其原理基于DNA的双链不稳定性。

PCR 反应主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。

首先，将待扩增的DNA样本加热至95℃，使其两个互补链解离，得到两条单链DNA模板。

然后，将PCR反应液温度降至较低的温度（50-60℃），引入引物（PCR的序列特异性引导）。

引物结合到DNA模板链的3’末端，形成DNA-引物复合物。

最后，在适宜的温度下（50-75℃），通过热稳定的DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）的活性来合成新的DNA链。

Taq DNA聚合酶能够从引物末端向3’端延伸合成互补链。

通过反复的循环，PCR反应能够将目标DNA片段扩增为数以亿计的复制品。

这样，仅有微量的出发DNA，也能被PCR反应扩增至足够的数量，以便于后续分析。

三、PCR步骤PCR方法通常包括三个主要步骤：前处理、PCR反应和分析。

前处理步骤用于提取DNA样本并准备PCR反应所需的DNA模板。

通常使用化学或机械方法从细胞或组织中提取DNA。

提取的DNA样本经过纯化和浓缩之后，可以进入下一步的PCR反应。

2. PCR反应在PCR反应过程中，需要准备PCR反应液和合适的PCR条件。

PCR反应液需要包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷三磷酸盐）、缓冲液和DNA聚合酶等成分。

根据不同的PCR应用，反应条件如温度、时间和循环次数等也会有所变化。

3. 分析PCR反应结束后，扩增产物可以通过多种方式进行分析。

常用的分析方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应实时定量分析（qPCR）、变性高效液相色谱法（DHPLC）等。

PCR—Pyrosequencing快速检测药物代谢酶基因CYP2C19多态性方法的建立及应用

关键词：ＹＰＣ９焦磷酸测序Ｃ２１；中图分类号：８文献标志码：文章编号：６１７１（０２Ｏ —６ —５Ｑ７６Ａ１７ —４４２１）１０６０
ｄｉ１．９９Ｊｉｓ．６１７１．Ｏ２０．２ｏ：０３６／．ｓｎ１７ — ４４２１．１Ｏ１
ＳＩＨｏｇＹＵｎｌＭＡｉ —ｅ，Ｈｎ，Ｒｕ－ｉｕ，ＪｎｆｉＲＥＮ — ｉ（ｓａｃｎＸｕｙＲｅｅｒｈａｄＤｅｅｏｍｅｔｎｒ，ａｇｚｏＡ．ｅｃｌｂｒｔｒＨａｇｈｕ３０３Ｃｈｎ）ｖｌｐｎＣｅｔｅＨｎｈｕＤ．ＭｄｉａＬａｏａｏｙ，ｎｚｏ１００，ｉａＡｓａｔＯｊｃｖＦｅｅｐａｎｗｉｒｕｈｕｔｏｒｄｔｃｉｇｇｎｔｏｙｒｈｓｏＹ２１ｂｕｒｇｂｔｃ：ｂｅｔｅｏｄｖｌｅｈｇｔｏｇｐｔｒｉｏｈｈｍｅｈｄｆｅｅｔｅｅｉｐｌｏｎｃｍｏｐｉｆＰＣａｏｔｕｍＣ９ｄ
参考。方法
ＰｒＭａｋＩ焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序，以Ｓｎｅ测序法测序结果为对照，察分析准确性。结果运用焦磷ｙｏｒＤ且ａｇｒ观酸测序可以成功检测Ｃ２１ＹＰＣ９相关基因型；个ＳＰ住点检测经与Ｓｎｅ测序方法比较，合率为１０。同时，过单Ｎａｇｒ符０通

PCR-荧光探针法检测MTHFR C677T基因多态性及其与复发性流产的相关性

收稿日期:2019-03-06 通讯作者:唐少华作者简介:白微(1987-),浙江温州人,本科㊂研究方向:临床检验诊断㊂ *温州市中医院文章编号:1004-4337(2019)06-0868-03 中图分类号:R 34 文献标识码:A㊃统计分析㊃P C R -荧光探针法检测MT H F RC 677T 基因多态性及其与复发性流产的相关性白微* 唐少华(温州医科大学温州325000)摘要: 目的:探讨温州地区复发性流产与5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(M T H F R )C 677T 多态性的相关性㊂方法:回顾性分析2015年6月~2016年6月某院中医妇科保胎住院患者188例,根据自然流产病史分为对照组和R S A 组㊂无自然流产史及无其他不良妊娠史且生育过健孩为对照组,连续自然流产2次及以上为R S A 组,利用P C R -荧光探针法检测MT H F RC 677T 基因型,分析该方法的性能,比较R S A 组和对照组基因型㊁等位基因的分布频率,分析MT H F R677T 与R S A 的关系㊂结果:MT H F RC 677T 三种基因型及等位基因在对照组中的分布频率分别为C C (41.4%)㊁C T (46.5%)㊁T T (12.1%)和C (65.7%)㊁T (32.3%);在R S A 组中的分布频率分别为C C (37.5%)㊁C T (38.9%)㊁T T (23.6%)和C (56.9%)㊁T (43.1%),两组中的分布差异无统计学意义㊂结论:尚不能认为温州地区M T H F RC 677T 基因多态性与复发性流产具有相关性㊂关键词: 复发性流产; 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶; P C R -荧光探针法d o i :10.3969/j .i s s n .1004-4337.2019.06.035复发性流产(r e c u r r e n t s po n t a n e o u s a b o r t i o n ,R S A ),是指自然流产连续2次或2次以上,在全世界范围内其发生率为1%~2%,在中国其发生率高达5%㊂复发性流产的病因复杂,包括遗产因素㊁生殖道解剖异常㊁免疫因素㊁内分泌因素㊁感染因素等,还有部分原因不明㊂5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(m e t h y l e n e t e t r ah y d r o f o l a t e r e d u c t a ,M T H F R )是叶酸代谢中的一个重要的酶,可将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸㊂5-甲基四氢叶酸通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程,间接为D N A 甲基化和蛋白质甲基化提供甲基,并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平㊂M T H F R 的突变会引起一系列的病理变化,现已证实与神经管畸形㊁唇腭裂㊁先天性心脏病㊁妊娠期高血压等密切相关㊂国内外皆有M T H F RC 677T 与复发性流产的相关性报道,但两者的相关性存在较大的争议㊂目前M T H F R 基因多态性的检测方法主要有聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(P C R -R F L P )㊁高分辨溶解曲线突变检测(H R M )和二代测序等,P C R -荧光探针法具有灵敏度高㊁结果准确的优点,检测M T H F R 具有优越性㊂本文旨在简要评价P C R -荧光检测M T H F R 的性能,探讨温州地区复发性流产与M T H F R 的相关性㊂1 资料与方法1.1 资料来源收集2015年6月~2016年6月我院中医妇科保胎住院患者188例,排除染色体异常㊁内分泌疾病㊁解剖结构异常㊁人工受精等㊂根据自然流产病史,连续自然流产2次及以上为实验组即R S A 组,无自然流产史及无其他不良妊娠史且生育过健孩为对照组㊂R S A 组年龄(31.46ʃ4.64)岁,对照组年龄(31.33ʃ4.46)岁,两组年龄差异无统计学意义(F =0.027,P=0.869)㊂所有患者均签署知情同意书,本研究获得温州市医科大学伦理委员会批准㊂1.2 研究方法1.2.1 P C R -荧光探针法检测M T H F RC 677T 基因多态性采集E D T A 抗凝的外周静脉血2m l,提取全血的全基因D N A ,借助P C R -荧光探针技术,利用探针可与D N A 模板特异性结合的特点,通过报告荧光的不同来分辨出样本的基因型㊂试剂盒购自深圳奥萨医疗有限公司㊂1.2.2 测序法检测M T H F RC 677T 基因多态性选取20例不同基因型的样本,送第三方机构进行全基因测序㊂1.2.3 统计方法采用S P S S 22.0软件进行统计分析,两种方法一致性分析用K a p p a 检验,对基因型进行H a r d y -W e i n b e r g 平衡检验㊂计量资料用(x ʃs)表示,比较采用方差分析;计数资料用百分数表示,比较采用χ2检验㊂以P <0.05表示有统计学意义㊂2 结果2.1 P C R -荧光探针法的性能评价2.1.1 最低检测限最低检测限为200p g/u l ,有文献报道[1]最低检测限5.0n g /u l 可作为临床应用,本试剂盒最低检测限适应临床需求㊂2.1.2 准确性以测序法作为金标准,检测结果见表1㊂经K a p pa 检验,K a p pa 值=1.0,说明两种方法具有完全一致性㊂表1 两种检测方法检测结果基因型C C C T T T C C800C T 0100T T022.2 H -W 平衡检验㊃868㊃J o u r n a l o fM a t h e m a t i c a lM e d i c i n eV o l .32 N o .6 2019M T H F R有三种基因型:C C基因型㊁C T基因型㊁T T基因型㊂经过H a r d-W e i n b e r g平衡分析,对照组(χ2=0.005,P= 0.997)和R S A组(χ2=1.624,P=0.444)两组人群处于均处于H-W平衡状态,样本具有本区域群体代表性㊂2.3 M T H F RC677T基因型及等位基因频率分布三种基因型及等位基因在对照组中的分布频率分别为C C(41.4%)㊁C T(46.5%)㊁T T(12.1%)和C(65.7%)㊁T(32.3%);在R S A组中的分布频率分别为C C(37.5%)㊁C T (38.9%)㊁T T(23.6%)和C(56.9%)㊁T(43.1%)㊂两组中的分布差异无统计学意义,见表2㊂表2基因型及等位基因分布频率[n(%)]基因型等位基因C C C T T T C T 对照组48(41.4)54(46.5)14(12.1)15(65.7)82(32.3) R S A组27(37.5)28(38.9)17(23.6)82(56.9)62(43.1)χ2/P4.355/0.1132.236/0.1353讨论M T H F R是位于第一号染色体1p36.3位置㊂M T H F R 全长20.374k b,共有外显子12个,m R N A全长7,150b p㊂目前该基因中研究较为透彻的多态性位点是第五外显子677位的C/T多态㊂目前M T H F R基因多态性的检测方法主要有聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(P C R-R F L P)㊁高分辨溶解曲线突变检测(H R M)和二代测序等,P C R-荧光探针法特异性高,方法灵敏,封闭管分析可有效避免污染㊂本研究使用P C R-荧光探针法和测序法同时检测了20例样本,C C型的符合率100%,C T型的符合率100%,T T型的符合率100%,K a p p a值=1,两种方法表现出了完全的一致性,说明P C R-荧光探针法具有高准确度㊂该位点的突变引起酶活性的下降或缺失,使血浆中同型半胱氨酸浓度升高,从而导致高同型半胱氨酸血症,造成血管内皮损伤及血栓形成,而血液高凝状态是胎盘动脉栓塞形成的内在原因,同时高同型半胱氨酸对胚胎有毒性作用,可能与复发性流产有关[2]㊂国内有学者[3]对相关文献进行M e t a分析显示,基因型为C T或T T的女性发生R S A的风险较C C者分别高出93%和22%㊂王贤军等人[4]研究了杭州地区R S A 的情况,分析得出,携带T T基因型的女性发生R S A的风险是正常女性的2.344倍㊂国外学者M a n j u[5]和A h m a d[6]等人分别对北印度和伊朗R S A妇女研究发现,M T H F RC677T基因多态性在病例组和对照组中的分布无差异㊂B a u m a n n等[7]以高加索人为研究对象,认为M T H T F R C677T多态性可能是R S A的病理生理机制㊂本研究未发现M T H F RC677T基因多态性与R S A存在相关性㊂T T基因型和T等位基因在R S A组的分布频率较对照组增高,但其差异无统计学意义㊂本研究的结果与上述王贤军等人的研究结果不一致,与M a n j u和A h m a d等人的结果相一致㊂究其原因,M T H F R的分布受人种㊁地域影响,例如中国人群中T T基因型频率约为20%,而在非洲撒哈拉地区黑人种未发现有T T纯合突变[8];R S A的影响因素包括环境因素,生活习惯因素等;另外,研究的样本大小㊁研究方法的不同亦造成研究结果的差异㊂复发性流产在妊娠妇女中的发生率日益增高,虽本次研究显示其与M T H F RC677T基因多态性的相关性较小,但两者之间的相关性从其他角度,如R S A妇女再妊娠的妊娠结局㊁早产儿㊁低体重胎儿等的关系值得深入研究㊂参考文献1金速速,余坚,陈向南,等.P C R-金磁微粒层析法检测M T H F R C677T基因多态性及初步临床应用.中国卫生检验,2017,27(22): 3196~3199.2 S z t e n c S.H p e r h o m o c y s t e i n e m i aa n d P r e g n a n c y C o m p l i c a t i o n s.G i n e k o l P o l,2004,75:317~325.3刘宇岩,杨博逸,李永芳,等.5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶C677T 基因多态性与原因不明复发性流产关联的M e t a分析.中国全科医学,2013,31:2992~2997.4王贤军,罗丽,王莉,等.不明原因复发性流产与M T H F RC677T突变的关系.中华检验医学杂志,2015,38(4):243~246.5 M a n j uP u r i,L o v e j e e tK a u r,G a g a n d e e p K a u rW a l i a,e t a l.M T H F R C677TP o l y m o r p h i s m,F o l a t e,V i t a m i nB12a n d H o m o c y s t e i n ei n R e c u r r e n t P r e g n a n c y L o s s e s:A C a s eC o n t r o l S t u d y A m o n g N o r t h I n d i a n W o m e n.J o u r n a l o fP e r i n a t a lM e d i c i n e,2013,41(5):549~ 552.6 P o u r s a d e g hZ o n o u z iA,C h a p a r z a d e h N,A s g h a r iE s t i a r M,e ta l. M e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t eR e d u c t a s e C677T a n d A1298C M u t a-t i o n si n W o m e n w i t h R e c u r r e n t S p o n t a n e o u s A b o r t i o n si n t h e N o r t h w e s t o f I r a n.I S R N O b s t e t r i c s a n dG y n e c o l o g y,2012,1~6.7 B a u m a n nK,B e u t e rW i n k l e rP,H a c k e t h a lA,e t a l.M a t e r n a l f a c t o r VL e i d e na n dP r o t h r o m i n M u t a t i o nd on o tS e e m d oC o n t r i b u t e t o t h eO c c u r r e n c e o f t w oo rM o r e t h a n t w oC o n s e c u t i v eM i s c a r r i a g e s i nC a u c a s i a nP a t i e n t s.A mJR e p r o d I mm u n o l,2013,70(6):518~ 521.8S c h n e i d e r J A,R e e sD C,L i uY T,e t a l.W o r l dW i d eD i s t r i b u t i o n o f a C o mm o nM e t h y l e n e t r a h y d r o f o l a t eR e d u c t a s eM u t a t i o n.A mJH u m G e n e t,1998,65(5):1258~1260.R e l a t i o n s h i p b e t w e e n M T H F RC677TG e n eP o l y m o r p h i s ma n dR e c u r r e n t S p o n t a n e o u sA b o r t i o nD e t e c t e db y P C R-f l u o r e s c e n c eP r o b eM e t h o dB a iW e i,e t a l(W e n z h o u M e d i c a lU n i v e r s i t y,W e n z h o u325000)A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nr e c u r r e n t s p o n t a n e o u s a b o r t i o na n d5,10-m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e(MT H F R)C677T p o l y m o r p h i s mi n W e n z h o ua r e a.M e t h o d s:Ar e t r o-㊃968㊃数理医药学杂志2019年第32卷第6期收稿日期:2019-02-14通讯作者:李昌崇作者简介:韩红卫(1985-),浙江温州人,女,本科,主治医师㊂研究方向:儿童感染肝病疾病㊂ *温州医科大学附属第二医院㊁췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍育英儿童医院儿童呼吸科s p e c t i v e a n a l y s i s o f 188c a s e s h o s p i t a l i z e d i n a h o s p i t a l f r o mJ u n e 2015t o J u n e 2016w a s c o n d u c t e d .A c c o r d -i n g t o t h eh i s t o r y o fs p o n t a n e o u sa b o r t i o n ,t h e p a t i e n t sw e r ed i v i d e di n t oc o n t r o l g r o u p a n d R S A g r o u p .T h e r ew a sn oh i s t o r y o f s p o n t a n e o u s a b o r t i o na n dn oh i s t o r y o f o t h e r a d v e r s e p r e g n a n c y wi t ho n eo rm o r e c h i l d r e na s c o n t r o l g r o u p ,c o n t i n u o u s s p o n t a n e o u s a b o r t i o n 2t i m e s a n d a b o v e a s t h eR S A g r o u p.T o v a l i d a t e f l u o r e s c e n c eP C Ra s s a y a n dd e t e c t e MT H F R C 677T g e n o t y p e .T h e f r e q u e n c i e so f g e n o t y pe sa n da l l e l e s i n R S A g r o u p a n d c o n t r o l g r o u p w e r e c o m p a r e d ,a n d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nMT H F R677Ta n dR S A w a s a n -a l y z e d .R e s u l t s :T h e d i s t r i b u t i o nf r e q u e n c y o fMT H F RC 677Tg e n o t y pe s a n d a l l e l e sw e r eC C (41.4%),C T (46.5%),T T (12.1%)a n dC (65.7%)a n dT (32.3%)i n t h e c o n t r o l g r o u p r e s p e c t i v e l y.T h e d i s t r i b u t i o n f r e q u e n c y i n t h eR S A g r o u p wa sC C (37.5%),C T (38.9%),T T (23.6%)a n dC (56.9%)a n dT (43.1%)r e s p e c t i v e l y .T h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i nd i s t r ib u t i o nb e t w e e nt h e t w o g r o u ps .C o n c l u s i o n :T h e MT H F RC 677T g e n e p o l y m o r p h i s mi nW e n z h o u c a n n o t b e c o n s i d e r e d t o b e c o r r e l a t e dw i t h r e c u r r e n t s p o n t a -n e o u s a b o r t i o n .K e y w o r d s r e c u r r e n ts p o n t a n e o u sa b o r t i o n ;5,10-m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t er e d u c t a s e ;P C R -f l u o r e s -c e n c e p r o b em e t h o d 文章编号:1004-4337(2019)06-0870-03 中图分类号:R 725.1 文献标识码:A㊃统计分析㊃E V 71感染型手足口病患儿特征及高危因素分析韩红卫李昌崇*(温州医科大学温州325000)摘要: 目的:研究分析E V 71感染型手足口病患儿特征及高危因素㊂方法:选取2010年1月~2017年12月某院儿科收治的80例E V 71感染型手足口病患儿作为研究对象,并采取同期确诊的75例普通手足口病患儿进行对照,比较E V 71感染型手足口病患儿与普通手足口病患儿的临床特征以及高危因素㊂结果:比较患儿的年龄㊁患儿首次确诊㊁患儿嗜睡萎靡㊁患儿肢体震颤以及各实验室检查结果共17项指标,差异具有统计学意义(P <0.05)㊂根据L o g i s t i c 回归分析E V 71感染型手足口病患儿特征或高危因素有:非典型皮疹㊁嗜睡萎靡㊁肢体震颤㊁影像学表现以及血压升高㊂结论:3岁及其以下E V 71感染型患儿出现非典型皮疹㊁胸片㊁血压以及血糖异常提示患儿病情出现恶化㊂关键词: E V 71感染型; 手足口病; 特征; 高危因素d o i :10.3969/j .i s s n .1004-4337.2019.06.036手足口病是肠道病毒引起的传染病之一,常发于5岁及其以下的儿童,临床表现多为口痛㊁厌食㊁低热,且手㊁足以及口腔等部位出现小疱疹,部分患儿一周左右会自愈,少数手足口病患儿会引起心肌炎等并发症[1~3]㊂故本次研究选取E V 71感染型手足口病患儿的临床资料进行回顾性研究分析,目的在于研究分析E V 71感染型手足口病患儿特征及高危因素㊂1 一般资料与方法1.1 一般资料选取2010年1月~2017年12月我院儿科收治的80例E V 71感染型手足口病患儿作为观察组,并采取同期确诊的75例普通手足口病患儿作为对照组,所有患儿均符合‘手足口病诊疗指南“[4]中对手足口病的诊断标准,且患儿的监护人知情并签署知情同意书,排除合并其他严重疾病的患儿㊂1.2 方法收集记录并分析两组患儿的临床病例,调查表格包括患儿年龄㊁性别㊁城乡分布㊁初步诊断㊁皮疹性质㊁发热情况㊁神志以及中枢神经系统表现㊁影像学检查等临床症状㊂1.3 统计学方法所有数据资料均采用S P S S 20.0软件对数据进行统计分析,计数资料采用例数(%)的方式表示,计数资料组间比较采用χ2检验;对E V 71感染型手足口病患儿的高危因素选用L o -gi s t i c 回归模型前进法进行比较分析㊂以P <0.05表示差异具有统计学意义㊂2 结果2.1 比较两组患儿高危因素本次调查研究中,比较患儿的年龄㊁患儿首次确诊㊁患儿嗜睡萎靡㊁患儿肢体震颤㊁患儿伴随呕吐㊁患儿眼球活动异常㊁㊃078㊃J o u r n a l o fM a t h e m a t i c a lM e d i c i n eV o l .32 N o .6 2019。

生物大数据分析中的遗传多态性检测方法与技巧

生物大数据分析中的遗传多态性检测方法与技巧遗传多态性是生物学研究中非常重要的一个概念，它指的是个体或群体基因组中存在的多个变异形式或等位基因。

遗传多态性不仅与个体间的差异有关，还与个体在适应环境和抵抗疾病方面的差异密切相关。

因此，在生物大数据分析中，准确检测和分析遗传多态性至关重要。

本文将介绍一些常用的遗传多态性检测方法与技巧。

1. 单核苷酸多态性（SNP）的检测方法：SNP是最为常见的遗传多态性形式之一，它是DNA中单个核苷酸（A、T、C或G）的变异。

SNP的检测可通过基于测序技术的方法，如Sanger测序、测序用探针芯片和下一代测序技术等。

这些方法可以快速、准确地检测出SNP位点上的碱基变异情况。

此外，还可以利用聚合酶链式反应（PCR）结合限制性内切酶（RFLP）方法，通过分析产生的DNA片段长度差异来检测SNP位点。

2. 微卫星序列的分析方法：微卫星序列是在基因组中广泛分布的、重复的DNA序列，由于个体间的插入、缺失或重复次数的差异，微卫星序列具有高度多态性。

检测微卫星序列的多态性可以通过PCR扩增方法，使用特异性引物扩增目标微卫星位点，然后通过电泳检测扩增片段的长度差异。

此外，还可以利用基于测序的方法来检测微卫星序列的变异情况。

3. 多态性标记的选择与筛选：在生物大数据分析中，选择适当的多态性标记对于准确检测遗传多样性至关重要。

一种常用的多态性标记是限制性片段长度多态性（RFLP），其基本原理是利用限制性内切酶切割DNA产生的不同长度的片段。

此外，还有单序列重复多态性（SSR）和随机扩增多态性（RAPD）等多态性标记可以选择。

在筛选多态性标记时，通常考虑标记的多态性、位点的连锁关系、扩增效果等因素。

4. 基于群体遗传学的分析方法：群体遗传学是研究个体在群体中遗传结构和动态变化的学科。

在生物大数据分析中，利用群体遗传学的方法可以检测遗传多样性和演化过程。

例如，可以通过计算群体间的遗传距离和群体结构来判断不同种群间的基因流程度。

ACE基因多态性分析

刘嘉杰1353354ACE基因多态性分析【实验目的】1.从微量来源的组织细胞中抽提基因组DNA2.PCR法分析基因多态性分析【实验原理】以DNA为模板，ACE基因特异的引物序列位于287bp插入/缺失片段的两侧进行PCR扩增，故II型扩增片段长度约为490bp，DD型扩增片段长度约为190bp，ID型扩增片段为２个，分别为190bp和490bp。

根据PCR扩增片段的大小可进行多态性分析。

【实验步骤】1.基因组DNA抽提1.1溶液Ⅰ(10 ml )漱口20秒，收集漱口水；3000g×5min×RT，弃上清；1.2溶液Ⅱ(250 μl)重悬沉淀；3000g×1min，弃上清；1.3溶液Ⅲ(250 μl）重悬沉淀，振荡10秒；（变性）转至1.5 ml离心管，99℃×5min；1.4加溶液IV (50 μl)振荡5秒；（中和）3000g×5min，1.5上清转移至新0.5 ml离心管，取5 ul用于PCR.2.PCR反应1.1取消毒的0.2ml 离心管，加入下列成分：2×PCR Buffer mix(10 μl)DNA模板(5μl)引物混合物(10μM each) (2μl)ddH2O (3μl)1.2PCR扩增3.琼脂糖凝胶电泳检测1.1制备1.5％琼脂糖凝胶1.2点样，电泳1.3紫外灯下观察结果【注意事项】1.清洁口腔，充分漱口。

2.裂解细胞后震荡时间不易长，以免DNA断裂。

【实验结果】由电泳结果可以看到，明显分两个条带，并且接近190bp和490bp，故推测ACE基因型位ID。

检测基因多态性的方法

检测基因多态性的方法基因多态性是指一个基因在个体或种群中存在两个或更多的等位基因，并且这些等位基因的频率大于1％。

基因多态性在人类的特征和疾病的研究中具有重要意义，因为它可以帮助我们了解基因对特定特征和疾病的贡献程度以及个体对药物治疗的反应程度。

下面将介绍几种常见的基因多态性检测方法。

1.PCR-RFLP（聚合酶链反应限制性片段长度多态性）PCR-RFLP是一种基于聚合酶链反应（PCR）和限制性酶切的技术。

首先，通过PCR扩增目标DNA区域，然后使用限制性内切酶切割PCR产物。

由于不同的等位基因可能在限制性酶切位点处有不同的序列，因此切割后的片段长度也会不同。

通过电泳分离不同长度的片段后，可以通过比较不同样本的片段模式来确定等位基因型。

2.SNP（单核苷酸多态性）芯片3.测序技术传统的测序技术，如Sanger测序，已被广泛用于检测基因多态性。

通过PCR扩增目标基因区域并分离纯化PCR产物后，使用测序方法确定其序列。

通过与已知参考序列比较，可以确定等位基因的存在和基因型。

近年来，高通量测序技术的快速发展，如Illumina测序和Ion Torrent测序等，使得更大规模的基因多态性检测成为可能。

4.扩增片段长度多态性（AFLP）AFLP是一种通过PCR扩增特定DNA片段来检测多态性的方法。

它结合了限制性酶切和PCR扩增的原理。

首先，使用特定的限制性酶切割DNA样本，然后使用一对特定的引物进行PCR扩增。

由于每个DNA片段在PCR 扩增时会加上特定的引物顺带序列，因此PCR产物的长度会有差异。

通过电泳分离PCR产物后，可以通过比较不同样本的PCR产物长度模式来确定等位基因型。

5.基因芯片基因芯片是基因多态性检测的一种常用方法，特别适用于密集编码的基因区域。

基因芯片使用固定的DNA探针，通过和样品DNA杂交检测目标基因区域的多态性。

探针可以是PCR产物、cDNA或合成的oligonucleotide。

利用PCR-SacⅡ-RFLP技术检测绵羊IGFBP-3基因多态性的研究

Ｅｇｎｅｉｇ，ＪａｇｉｇｉｕｔｒｌＵｗｍｑ，Ｎｎｈｎ３０５，ｈｎ；．ＺｎｑａｅｅｒｈＩｓｔｔｈｅｎｉｅｒｎｉｎｘｒｌａｎｅｉＡｃｕａａｇ３０４Ｃｉ３ｃａｉｉｕｎＲｓａｃｎｔｕｅｏＳｅｉｆｐＢｅｄｎｒｅｉｇ・Ｓｉｈｔｉｉｎ３０５，ｈｎ４．ｔｔＫｙＬｂｒｔｒｏｇｏｉｔｈｏｏｙ。ＣｉｇｉｕｔｒｌｈｈｏｚＸｎａｇ８２２Ｃｉａ；Ｓａｅｅｏａｏｙｆ，ＡｒｂｅｎｌｅｊａｏｃｇｈｎＡｒｌｕａａｃＵｉｅｉｎｖｒｔｓｙ－Ｂｉｎ００４，ｈｎｅｉｇ１０９Ｃｉｊａ）
（．ｅｂｒｔｙｏＢｏｃｎｌｙｏｈｅＢｅｉｉｉｎｒｕｔｎ＆Ｃｎｔｃｏｏｓｉｉｇ１ＫｙＬｏｏｆ，ｉｅｈｏｇａａｒｔｏｆＳｅｒｄｎｏｎａｇＰｏｃｏｐｅｇｆＸｊｄｉｏｓｕｔｎＣｒ。Ｘｎａｒｉｐｊｎ
美利奴羊细毛羊得到三种基因型：Ｔ２９ｂ）Ｇ（３ｐ１０ｂ）Ｔ（４ｐ１９ｂ／１ｐ；泊羊中出现Ｔ（４ｐ、Ｇ１９ｂ／１ｐ和Ｇ２９ｂ／３ｐ１０ｂ）杜ＧＧ和两种基因型；羊、尾寒羊以及萨福克羊中只有Ｇ湖小Ｇ一种基因型。关联性分析表明不同基因型与
中图分类号：８６Ｓ８￥２；１８文献标识码：Ａ文章编号：０ — ３０２１）５８９５１１４３（０００ —０４ —００

改良PCR-RFLP法检测MTHFR基因C677T位点多态性

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣ６７７ＴｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＭＴＨＦＲｇｅｎｅｂｙｉｍｐｒｏｖｅｄＲＣＲ￣ＲＦＬＰ
ＨＥＺｈｅｎｙｕ∗ ꎬＧＵＱｕｌｉａｎｇꎬＹＯＵＪｕａｎ ( ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６ꎬＣｈｉｎａ) ∗ ＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒＥｍａｉｌ: ｊｄｂｓｈｚｙ＠１６３.ｃｏｍ
广东药科大学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＯｃｔ. ２０１９ꎬ３５(５)
医学研究
改良ＰＣＲ￣ＲＦＬＰ法检测ＭＴＨＦＲ基因Ｃ６７７Ｔ位点多态性
何震宇ꎬபைடு நூலகம்取良ꎬ游娟
( 广东药科大学生物化学与分子生物学系ꎬ广东广州５１０００６)
ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｓｉｍｐｌｅｐｒａｃｔｉｃａｌａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅＣ６７７Ｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆ５１０￣ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅＭＴＨＦＲｇｅｎｅ. ＭｅｔｈｏｄｓＢａｓｅｄｏｎｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣ６７７ＴｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｌｏｃｕｓｏｆＭＴＨＦＲｇｅｎｅａｐａｉｒｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄａｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｏｆ５３５ｂｐｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＰＣＲ . ＴｈｉｓｆｒａｇｍｅｎｔｃｏｎｔａｉｎｅｄＣ６７７ＴｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｌｏｃｕｓｏｆＭＴＨＦＲｇｅｎｅａｎｄａｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＨｉｎｆＩｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｉｔｅ１６３ｂｐｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｌｏｃｕｓａｎｄｔｈｉｓｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｉｔｅｗａｓｕｓｅｄａｓａｎｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｆｏｒｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔＨｉｎｆＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ. ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｒａｐｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｙＨｉｎｆＩｄｉｇｅｓｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｍａｐｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｇｅｎｏｔｙｐｅｓ. ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｏｆＣ６７７ＴｌｏｃｕｓｏｆＭＴＨＦＲｇｅｎｅｏｆｅａｃｈｓａｍｐｌｅｗａｓｃｌｅａｒｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍａｐａｎｄｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＣＣＴａｎｄＴＴ

生化-年研究生实验2 PCR检测apoB基因多态性

实验二：PCR检测apoB基因多态性
中山医学院生化教研室
实验内容
• 1、基因PCR（已完成）；
• 2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；
一、DNA琼脂糖凝胶电泳
1 原理
在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度5 2.0
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
2 实验材料及试剂
琼脂糖电泳缓冲液：1TAE（Tris acetate-EDTA buffer ） 6加样缓冲液（溴酚蓝/二甲苯青/甘油） EB染色液（溴化乙锭，ethidium bromide）
DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
3
1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
• 1 DNA分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢； • 2 构象：共价闭环DNA分子>直线DNA>开环双链DNA； • 3 凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢； • 4 电压：电压越高， DNA分子迁移越快； • 5 缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电荷。
Buffer不要用成H2O，称量相对准确
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的

PCR-荧光探针法检测CYP2C19基因多态性的性能验证研究

·方法研究·ＰＣＲ荧光探针法检测ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性的性能验证研究陈柯霖，周　金，邵春青，吕　虹，康熙雄，张国军（首都医科大学附属北京天坛医院检验科北京市免疫试剂临床工程技术研究中心，北京１０００７１）ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０２０．０７．０２７收稿日期：２０２００５２４；修回日期：２０２００６１２基金项目：北京市科技计划（编号：Ｚ２０１１００００９３１９００５）作者简介：陈柯霖，女，主治医师，主要从事分子生物学研究。

通讯作者：张国军。

Ｅｍａｉｌ：ｔｉａｎｔａｎｚｇｊ＠１６３．ｃｏｍ摘要：目的　对人类ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性检测试剂盒（ＰＣＲ荧光探针法）检测ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性的符合率、检测限、交叉反应和抗干扰能力进行验证。

方法　依照最新版分子诊断检验程序性能验证指南（ＣＮＡＳＧＬ０３９）要求对试剂盒的符合率（与参比方法比较）、检测限、交叉反应和抗干扰能力进行性能评价。

结果　２０例临床样本的ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性检测结果，与原方法结果完全符合，符合率为１００％；稀释到检测限下的５次重复实验均能准确进行分型；交叉反应中检测结果未受影响，基因型之间无交叉污染情况；血红蛋白等干扰物质对结果无影响，检测结果与原结果符合率为１００％。

结论该人类ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性检测试剂盒通过ＰＣＲ方法进行的基因分型结果稳定、可靠，适用于医学实验室对ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性的检测。

关键词：基因多态性；　ＰＣＲ荧光探针法；　性能验证中图分类号：Ｒ３３１文献标识码：ＡＴｈｅＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＶｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＹＰ２Ｃ１９ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｂｙＰＣＲＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｂｉｎｇＣＨＥＮＫｅｌｉｎ，ＺＨＯＵＪｉｎ，ＳＨＡＯＣｈｕｎｑｉｎｇ，ＬＹＵＨｏｎｇ，ＫＡＮＧＸｉｘｉｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｕｏｊｕｎ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＴｉａｎｔａｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＢｅｉｊｉｎｇＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００７１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｏｍｐｌｉａｎｃｅｒａｔｅ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔ，ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｎｔｉｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｈｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ１９ｇｅｎｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ．ＭｅｔｈｏｄｓＷｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｋｉｔ′ｓｃｏｍｐｌｉａｎｃｅｒａｔｅ（ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ），ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｓ，ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄａｎｔｉｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅａｂｉｌｉｔｙｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｌａｔｅｓｔｖｅｒｓｉｏｎｏｆｔｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＴｅｓｔＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＶｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＧｕｉｄｅ（ＣＮＡＳＧＬ０３９）．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＹＰ２Ｃ１９ｇｅｎｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｔｅｓｔｉｎ２０ｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｗａｓ１００％．Ｆｉｖｅｒｅｐｅａｔｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｄｉｌｕｔｅｄｂｅｌｏｗｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗｅｒｅａｂｌｅｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅ．Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｎｏｔａｆｆｅｃｔｅｄｉｎｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｃｒｏｓｓｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｓｕｃｈａｓｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｈａｄｎｏｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄｔｈｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｂｅｔｗｅｅｎｔｅｓｔａｎｄｏｒｉｇｉｎａｌｒｅｓｕｌｔｓｗａｓ１００％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｈｕｍａｎＣＹＰ２Ｃ１９ｇｅｎｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔｈａｓｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｂｙＰＣＲｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣＹＰ２Ｃ１９ｇｅｎｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎｍｅｄｉｃａｌｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣＹＰ２Ｃ１９；　Ｇｅｎｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；　ＰＣＲｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｂｉｎｇ；　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ近些年国内外有关基因多态性的个体化诊断治疗正成为前沿热点，细胞色素Ｐ４５０作为一类体内药物代谢的主要酶系备受关注。