急性白血病实验室诊断分型程

因此要求流式细胞术的标本采集、保 存、送检和检测都要按严格的程序进行， 检测人员应通过培训，并具有一定免疫分 型经验，同时要结合细胞形态学进行结果 的解释。当流式细胞术检测得不出确定结 果时，BCSH提出可用免疫细胞化学方法 核查。（2）在我国尚难普及流式细胞术 的情况下，基层实验室可采用免疫细胞化 学染色方法。
1. 镜检 严格按先低倍视野后油镜观察的 步骤进行形态学分析，分类计数至少200个 有核细胞。
2. 分型注意事项 （1）原始细胞典型形态的鉴别十分重 要。按天津会议精神，原粒细胞应分两型 ：Ⅰ型为典型原粒细胞；Ⅱ型具有典型原 粒细胞特征，但胞质中出现少量、细小嗜 天青颗粒。
（2）伴随细胞：白血病细胞难以 判断类型时，可观察伴随细胞形态学 特点，有利于原始或早期细胞形态的 鉴别。 （3）非红系细胞（NEC）：急性髓 细胞白血病（AML）分型应强调NEC， 准确计数原始细胞的比例。
为了提高急性白血病的实验室诊断 水平，减少医患之间的矛盾，在“举 证倒置”情况下，应做到程序明确， 证据充足。参照国际血液学标准化委 员会(ICSH)[1] 、英国血液学标准制定委 员会(BCSH)[2]及欧州白血病免疫分型研 究组(EGIL)推荐的方法，结合我国国情， 提出适合基层临床实验室急性白血病 诊断分型程序如下。
（4）Auer小体：仔细寻找涂片中 Auer小体有利于AML的诊断，一般认为 急性淋巴细胞白血病（ALL）Auer小体 缺如。 （5）丝状分裂：ALL白血病细胞有 丝分裂染色体短而粗，且占细胞绝大 部分，可供分型时参考。
（6）浆细胞：急性单核细胞白血病 （AMoL）时，浆细胞出现率高于其他类型 白血病，对急性白血病分型具有参考意义。 （7）核影：也称篮细胞，多数出现在 治疗前骨髓中，为ALL特征之一，但决非特 异性的。 （8）分型应以骨髓象为准，血象仅供 参考。但在白血病细胞识别困难时，观察 血象中白血病细胞分化程度，有助于细胞 类型的正确判断。
我国的实验室目前已推行了FAB协作 组分型方案，形态学分型都严格执行 1986年天津会议提出的分型诊断标准。 这种标准尽管不够完善，但简便易行， 已为国内广大血液学工作者所接受。单 纯的骨髓细胞形态学有主观因素，其诊 断符合率常为60%~70%，若结合细胞化 学染色，可使诊断符合率接近90%。
1. 骨髓涂片 取有骨髓小粒部分，制备 厚薄、长短适宜的涂片数张，同时作外周 血涂片数张。 2. 染色 虽然国际血液学标准化委员 会（ICSH）推荐使用纯化天青B和伊红Y 的Romanowsky染色，限于天青B难以买到 和价格较贵的原因，提倡使用瑞（Wright ）—姬（Giemsa）染色，兼取两种染色之 优点进行骨髓涂片染色。
急性白血病(AL)的诊断除临床症状、 体征与血象外，骨髓细胞形态学分类是 确诊AL的主要依据之一。急性白血病因 分型不同，导致治疗方案和疗效不同， 预后也不同，因而正确诊断分型非常重 要。日常工作中急性白血病的诊断分型 常因骨髓取材、制片或经验不足而造成 漏检，也可能由于染色、形态学鉴别能 力或未按程序进行而致误诊，从而引发 医疗纠纷。
表1 主要细胞化学染色结果
MPO （SBB） + + + +/α -NAE （ANAE） +/+ + -/+ 诊 断 说 明
AML-M1、M2 AML- M3 AML-M4、M5 AML-M5 分类不明、 ALL、AML-M7 部 分 T-ALL 、 M7 ANAE阳性 M3a 的ANAE 阳性
1. 髓过氧化物酶 MPO是髓系特征 的专有酶，应作为识别髓系细胞的首 选。一般原粒细胞多为阴性，有的可 阳性，阳性率>3%，有助于诊断AML。 ICSH增补SBB意义在于MPO-的AL时SBB 可提供诊断依据。
免疫细胞化学染色方法容易普及， 但常用的抗体质量问题较多，国内应组 织专业人员研究生产用于免疫细胞化学 染色的常用抗体，以使尚无流式细胞仪 的单位用免疫细胞化学染色检测白血病 细胞免疫表型。采用免疫细胞化学染色 方法也应注意除外正常细胞的干扰。
经主要细胞化学和免疫表型仍不能 诊断的不典型白血病，ICSH方案又选 用一些系列相关的McAb进一步检测， 其中包括AML-M7 的CD41 、CD61 及AMLM6 的血型糖蛋白A等。BCSH方案二线 McAb组合也提出CD41 、CD42 、CD61 及 血型糖蛋白A等。
（2）氯乙酸AS-D萘酯酶虽为粒细胞标志 酶，且ICSH又推荐为主要细胞化学染色， 但这种染色在AML-M1时多为阴性，不如 MPO敏感，而在AML-M2、M3及M4时其结 果与MPO一致，从减少工作量和经济负 担考虑，可不列入常规项目。 （3）非特异性酯酶染色中，α -丁酸萘 酯酶（α -NBE）染色对单核细胞系特异 性强，但试剂价格较贵，不宜在国内推 广。α -NAE及ANAE各有优点，两种染色 可任选一种。
2. 非特异性酯酶：α -乙酸萘酯 酶（α -NAE）和酸性α -乙酸萘酯酶 （ANAE）均属非特异性酯酶，其基 质液都是α -乙酸萘酚，前者要求PH 为7.6，后者PH为5.9~6.3。单核细胞系 为阳性反应，并对氟化钠敏感。
1. 3. 方法学评价
（1）髓过氧化物酶染色方法较多， 国内多使用Washburn法，由于联苯胺 有致癌作用，ICSH推荐使用3，3’-二氨 基联苯胺的配方，目前国内已有试剂 盒生产。从检验人员免受化学品损害 方面考虑，建议使用ICSH推荐的方法。
免疫细胞化学方法虽然不如流式细胞 术客观、精确，但对形态学和细胞化学难 以分型的急性白血病，仍有十分重要的诊 断价值，如T-ALL与非T-ALL的鉴别，伴有 淋巴细胞系相关抗原阳性的急性髓系白血 病（Ly+ -AML）和伴有髓细胞系相关抗原 阳性的急性淋巴细胞白血病（My+ -ALL） 的诊断，以及急性巨核细胞白血病 （AML-M7）的确诊等。
（4）苏丹黑B染色是鉴别急性白血病较 好的染色方法，BCSH主张选SBB或MPO， ICSH由于SBB+的ALL已有报道，认为 SBB的特异性不如MPO，因此列为补充 细胞化学染色，基层医院不能开展MPO 的实验室可选用SBB。 （5）ICSH提倡使用主要细胞化学以外， 也主张在有条件的单位应用其他细胞化 学染色协助AL诊断。
目前国内有的实验室采用阿利新 蓝染色协助诊断AML-M3a，采用罗丹 尼蓝染色协助诊断AML-M7，采用甲苯 胺蓝染色协助诊断嗜碱粒细胞白血病， 采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色协助诊 断毛细胞白血病等。
一般认为细胞形态学和主要细胞化学 可使绝大多数髓系白血病得出正确诊断， 当MPO和NSE均为阴性或结果不明确时， 应选用免疫表型确定诊断。ICSH主张分为 细胞内免疫表型和膜免疫表型两个程序。
5. ICSH建议，在有条件的实验室特别是 诊断研究较先进的领域内，急性白血病的 诊断还可开展细胞遗传学及分子生物学诊 断技术，不断提高AL诊断分型的水平。
6.方法学评价 （1）AML-M7国内有些实 验室以免疫细胞化学染色方法检测，由于 国产CD41单抗质量较好，可协助AML-M7的 诊断。（2）有些AML-M3从形态学难以确 定，若HLA-DR阴性，也有助于诊断。
从事急性白血病诊断的实验室都应采 用细胞化学染色方法。ICSH提出使用髓过 氧化物酶（MPO）、氯乙酸AS-D萘酯酶（ CAE）和α -乙酸萘酯酶（ANAE）三种染色 ，必要时再加苏丹黑B（SBB）染色。BCSH 则主张使用SBB或MPO和非特异性酯酶（ NSE）染色。
史敏等[3]以ICSH推荐的三种主要细胞 化学染色对110例急性白血病骨髓标本进行 观察，结果表明基本符合专家小组设定的 模式。从我国实际情况出发，同时考虑到 患者的经济负担，细胞化学染色选项宜少 的原则，主要细胞化学提倡使用两项， MPO（SBB）、α -NAE（ANAE）见表1。
1. AML-M7 的原始细胞形态学鉴别比较困难， 常容易漏检或误诊，细胞化学染色虽有一 定参考意义，但特异性不如免疫表型， CD41、CD42、CD61对AML-M7具有重要诊断价 值。 2. AML-M6细胞形态学诊断并不困难，细 胞化学染色的过碘酸-Schiff反应也可提供诊 断依据，但AML-M6变异型以细胞形态学和 细胞化学进行诊断则非常困难，常借助血 型糖蛋白A确诊。同时CD36在早期红系急性 白血病细胞也呈阳性。
表2 免疫表型结果
抗MPO （CD13） +
CD3 （CD2） -
CD22（CD19） -
诊断 AML
说 明
-
+
-
+
T-ALL
B-ALL
-Hale Waihona Puke Baidu
-
-
分类不明
ALL可能性不 大
注：优选细胞质CD3 、CD22
1. ICSH方案中推荐B淋巴细胞系列特异 的胞质CD22（cCD22）。BCSH方案中一线 单克隆抗体（McAb）推荐cCD79a、cCD22、 CD19和CD10。结合我国实际情况，可选 cCD22或CD19。由于新抗体cCD79a对B系的 高度特异性和敏感性，有条件的实验室 也可选用。
随着流式细胞术及分子生物学技术在 临床上的普及，大大提高了急性白血病的 诊断水平。但有经验的血液学家一直认为， 骨髓细胞形态学和主要细胞化学染色仍然 是急性白血病诊断的首选程序，在此基础 上，择优选出系列特异性和系列相关性免 疫表型进行检测，可使绝大多数急性白血 病获得正确诊断，从而减少漏诊和误诊， 避免医疗纠纷。
BCSH 则 主 张 一 线 和 二 线 单 克 隆 抗 体 （McAb）组合。检测免疫表型的方法，国 外多采用流式细胞术，国内有条件的医院 已使用流式细胞术，有的采用骨髓涂片进 行免疫细胞化学染色，尚有一些实验室未 能开展上述技术。根据我国实际情况，从 事急性白血病诊断的实验室，最低的要求 应开展免疫细胞化学染色方法，并以最少 单克隆抗体进行诊断，免疫表型提倡使用 两项，cCD3（CD2）和cCD22（CD19），必要 时加作抗MPO（CD13），见表2。
2. ICSH方案中推荐T 淋巴细胞系列 特异的胞质CD3（cCD3）。BCSH方案 中一线McAb为 cCD3和CD2。结合我国 实际情况，可选cCD3或CD2。
3. 当细胞化学MPO/NSE阴性或模棱两 可时，ICSH方案检测cCD22和cCD3表达常 可得到明确结果。由于抗MPO抗体容易得 到，必要时可加做抗MPO。抗MPO 是急性 髓细胞白血病敏感的特异性标志，特别是 对于未分化型急性白血病和双表型急性白 血病的诊断有重要意义。可选用抗MPO或 CD13。近年又推出新抗体CD117，其对髓系 的特异性比CD13和CD33更好，且有较好的 敏感性，也可选用。
3. HLA-DR虽为非特异性McAb，临床实践证 明，AML-M3 、AML-M6 和半数以上的AML-M7 的HLA-DR为阴性，这一结果对急性白血病 诊断分型也有参考价值。 4.急性混合性白血病（MAL）时，骨髓 细胞形态学和细胞化学对诊断帮助不大， 免疫表型分析对确认双表型急性白血病 （BAL）是有意义的。尤其是EGIL修改积分 系统，可供AL诊断分型时参考。
4. 上述McAb的选择是从实用和经济方 面考虑的，且适合于基层实验室免疫细胞 化学染色方法，但若实验室条件许可，也 可多选用一些系列特异性或系列相关性标 志，如B淋巴系的CD10、T淋巴系的CD7等。 在髓系相关McAb中，选用CD13而不用CD33， 因为前者能检出更多的AML患者［2］ 。
5. 方法学评价（1）流式细胞术是检 测白血病细胞内和细胞膜免疫表型最好 的方法，近年又有许多新技术和新抗体 在临床上应用，而且具有非常良好的发 展前景。有条件的实验室应选用这种技 术。但常规标本中一般是正常细胞和白 血病细胞混杂存在，使标志报告和结果 解释会遇到一些困难。可用SSC/CD45设 门，多色免疫表型分析法。
1. Scott CS，Ottolander GJD, Swirsky D, et al.Recommended Procedures for the Classification of Acute Leukemias. Leukemia and Lymphoma ,1995,18:1-12 2. 王 一 译，肖志坚、郝玉书校. 急性白血病和慢性淋巴 增殖性疾患免疫分型的修订指南.国外医学输血及血液学 分册，2002,25（4）：289 3. 史敏、李波、李顺义，等.主要细胞化学染色在急性白 血病分型中的评价.临床检验杂志，2002，20（5）：303