生物工业分析实验讲义1

实验一、滴定法测定酸奶总酸度生物样品中的酸味物质，主要是溶于水的一些有机酸和无机酸。

在果蔬及其制品中，以苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸和醋酸为主；在肉，鱼类样品中则以乳酸为例。

此外，还有一些无机酸，像盐酸，磷酸等。

这些酸味物质，有的是样品中的天然成分，像葡萄中的酒石酸，苹果中的苹果酸；有的是人为的加进去的，像配制型饮料中加入的柠檬酸；还有的是在发酵中产生的，像酸牛奶中的乳酸。

酸在生物样品中主要有以下三个方面的作用。

1、显味剂不论是哪种途径得到的酸味物质，都是生物样品重要的显味剂，对生物样品的风味有很大的影响。

其中大多数的有机酸具有很浓的水果香味，能刺激食欲，促进消化，有机酸在维持人体体液酸碱平衡方面起着重要的作用。

2、保持颜色稳定生物样品中的酸味物质的存在，即pH值的高低，对保持生物样品的颜色的稳定性，也起着一定的作用。

在水果加工过程中，如果加酸降低介质的pH值，可抑制水果的酶促褐度；选用pH 6.5-7.2的沸水热烫蔬菜，能很好地保持绿色蔬菜特有的鲜绿色。

3、防腐作用酸味物质在生物样品中还能起到一定的防腐作用。

当生物样品的pH小于2.5时，一般除霉菌外，大部分微生物的生长都受到了抑制；若将醋酸的浓度控制在6%时，可有效地抑制腐败菌的生长。

一、实验意义与目的酸度测定的意义1. 测定酸度可判断果蔬的成熟程度果品、蔬菜在其生长发育过程中，有机酸的种类和含量是在不断变化的，通过测定酸的种类或含量能够判别果蔬的成熟度。

例如：如果测定出葡萄所含的有机酸中苹果酸高于酒石酸时，说明葡萄还未成熟，因为成熟的葡萄含大量的酒石酸。

另外，不同种类的水果和蔬菜，酸的含量因成熟度、生长条件而异，一般成熟度越高，酸的含量越低。

如番茄在成熟过程中，总酸度从绿熟期的0.94%下降到完熟期的0.64%，同时糖的含量增加，糖酸比增大，具有良好的口感，故对酸度的测定是判断原料的成熟度的主要指标之一。

2. 可判断生物样品的新鲜程度原料的酸度常常是其新鲜的指标。

例如：新鲜牛奶中的乳酸含量过高，说明牛奶已腐败变质；水果制品中有游离的半乳糖醛酸，说明受到霉烂水果的污染。

因此酸度的测定是检测新鲜的指标之一。

3. 可反映了生物样品的质量生物样品中有机酸含量的多少，直接影响生物样品的风味、色泽、稳定性和品质的高低。

酸的测定对微生物发酵过程具有一定的指导意义。

如：酒和酒精生产中，对麦芽汁、发酵液、酒曲等的酸度都有一定的要求。

发酵制品中的酒、啤酒及酱油、食醋等中的酸也是一个重要的质量指标。

另外，酸在维持人体体液的酸碱平衡方面起着显著地作用。

人体体液pH值为7.3-7.4，如果体液的pH值过大，就要抽筋，过小则又会发生酸性中毒。

生物样品中的酸度通常用总酸度（滴定酸度）、有效酸度、挥发酸度来表示。

总酸度：是指生物样品中所有酸性物质的总量，包括已离解的酸浓度和未离解的酸浓度，采用标准碱液来滴定，并以样品中主要代表酸的百分含量表示。

有效酸度：指样品中呈离子状态的氢离子的浓度（严格地讲是活度）用pH计进行测定，用pH值表示。

挥发性酸度：指生物样品中易挥发部分的有机酸。

如乙酸、甲酸等，可用直接或间接法进行测定。

本实验的目的：学会用滴定法测定生物样品的总酸度。

二、原理生物样品中的有机酸（弱酸）用标准碱液滴定时，被中和生成盐类。

用酚酞作指示剂，当滴定到终点（pH=8.2，指示剂显红色）时，根据消耗的标准碱液体积，计算出样品总酸的含量。

其反应式如下：RCOOH + NaOH → RCOONa +H 2O三、试剂0.1mol/L 氢氧化钠，0.5%酚酞指示剂四、实验步骤1. 0.1mol/L 氢氧化钠的标定：称取0.3-0.4g （0.0001g ）干燥衡重后的基准物邻苯二甲酸氢钾，加25ml 水震荡溶解，加2-3滴酚酞指示剂，用待标定的0.1mol/L 氢氧化钠滴定至溶液呈微红色，15 S 不退色，平行两次，同时做空白实验，记录用量。

2. 酸奶样品的测定：称取5g （0.01g ）的酸奶于250ml 的锥形瓶中，加20ml 蒸馏水充分溶解摇匀，加2-3滴酚酞指示剂，用已标定的0.1mol/L 氢氧化钠溶液滴定样品至微红色15S 不退色，即为终点。

3. 计算总酸度（%） =式中：C ：标准氢氧化钠溶液的浓度mol/L 为V ：滴定所消耗标准碱液的体积mlV2：标定NaOH 所消耗碱液的平均体积mlM ：样品质量或体积（g 或ml ）100⨯m CVK10002.2042⨯⨯V WW：所称的基准物的质量（g）K：换算为适当酸的系数，0.09,即1mmol氢氧化钠相当于乳酸的克数是0.09克。

因为生物样品中含有多种有机酸，总酸度测定结果通常以样品含量最多的那种酸表示。

例如一般分析葡萄及其制品时，用酒石酸表示，其K=0.075；测柑橘类果实及其制品时，用柠檬酸表示，其K=0.064；分析苹果及其制品时，用苹果酸表示，其K=0.067；分析乳品、肉类、水产品及其制品时，用乳酸表示，其K=0.090；分析酒类、调味品，用乙酸表示，K=0.060。

五思考题1. 简述生物样品中有机酸的种类及其特点，对于颜色较深的一些样品，在测定其酸度时，如何排除干扰，以保证测定的准确度？2. 生物样品的总酸度，有效酸度，挥发酸测定值之间有什么关系？生物样品中酸度的测定有何意义？实验二、土豆中的淀粉含量的测定土豆，学名马铃薯，俗称“地蛋”、“山药蛋”，系多年生地下茎草本作物，现多为一年一季或一年两季栽培。

除了食用之外，大多数的土豆可以做淀粉、酒精等工业原料。

鲜马铃薯中的成分除了淀粉、水之外，还有1.8-8.5%的粗蛋白质和少量的纤维素和可溶性的糖。

一、目的要求掌握还原糖直接测定原理、方法；了解淀粉酸水解方法。

二、原理首先将淀粉水解成葡萄糖。

测定总糖通常以还原糖的测定法为基础，将生物样品中的非还原性双糖，经酸水解成还原性单糖，再按还原糖测定法测定，测出以转化糖计的总糖量。

其次标定葡萄糖的含量，之后换算成淀粉地含量。

葡萄糖的标定原理如下：将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。

在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。

根据样液消耗量可计算还原糖含量。

另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黃血盐)，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更为明显。

Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH(淡黃色)三、试剂1．碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜及0.05g四甲基蓝，溶于水中并稀释到1000 ml2．碱性酒石酸铜乙液:取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，在加4g亚铁氰化钾，完全溶解后，再用水稀到1000 ml，储存于橡胶塞玻璃瓶内。

3．106 g/L亚铁氰化钾溶液。

4．盐酸。

5．葡萄糖标准液：准确称取1.000 g干燥至恒量的纯葡萄糖，加水溶解后加入5 ml 盐酸，并以水稀释至1000 ml。

四、测定步驟1、样品处理：①精称0.2-0.4g（0.0001g）样品，用30 ml85%乙醇分三次洗涤过滤，弃滤液以除去可溶性的糖和蛋白，将残渣用100 ml水三次转移至磨口三角瓶中，并加入6 M盐酸15 ml。

②淀粉酸解为葡萄糖：样品煮沸回流加热1 h，冷却后加2滴甲基红指示剂，用40%（质量分数）氢氧化钠中和至黄色，再用盐酸调制红，改用10%的氢氧化钠调至黄色，加水定容250ml，混匀，用干燥滤纸过滤，弃初滤液，收集滤液备用。

2、碱性酒石酸铜溶液的标定①准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。

②从滴定管滴加9ml葡萄糖标准溶液，加热使其在2分钟内沸腾，并以每2秒一滴的速度滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。

平行操作3次，取其平均值。

F = c×V式中：F-----10 mg碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg;C-----葡萄糖标准溶液的浓度，mg/ml；-----标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，ml。

V3、样品溶液预测吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各 5 ml ，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml ，加玻璃珠3粒。

加热使其在2分钟内沸腾，以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品液，须始终保持溶液的沸腾状态，待溶液蓝色变浅时，再以每2秒一滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗溶液的体积。

4、样品溶液测定吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml ，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml ，加玻璃珠3粒。

从滴定管加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml 的样品液，使其在2分钟内加热至沸，以每2秒一滴的速度继续滴定，直至蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗样品液的体积。

平行操作3次，取其平均值五、结果计算土豆中的淀粉含量（以葡萄糖计%）式中：m-----样品质量, g ；F------10 ml 碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg ；V------测定时平均消耗样品溶液的体积，ml ；250------样品溶液的总体积, ml 。

0.9-----由葡萄糖换算成淀粉的系数(C 6H 10O 5)n+nH 2O →nC 6H 12O 6淀粉 葡萄糖n 162 g n 180 g162/180=0.9即1g 转化糖量相当于0.90g 淀粉0.2-----土豆中的淀粉含量10010002509.02.0⨯⨯⨯⨯⨯Vm F六、讨论和说明此法所用的氧化剂碱性酒石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都可被氧化，所以测得的是总还原糖量。

次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下氧化能力比Cu2+弱，故还原糖先与Cu2+反应， Cu2+完全反应后，稍过量的还原糖才与次甲基蓝指示剂反应，使之由蓝色变为无色，指示到达终点。

碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

七、思考题1 滴定必须在沸腾条件下进行，保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。

2 影响测定结果的主要操作因素。

实验三、凯氏（Kjeldahl ）定氮法测定面粉中的蛋白质蛋白质是重要的营养素之一。

蛋白质的测定方法很多，如总氮量法，福林—酚试剂法，双缩脲法，紫外吸收法等。

近来已有专用的蛋白质分析仪，但经典的凯氏定氮法仍是生物样品，饲料分析，种子鉴定及营养和生化研究中最广泛应用且具有足够精度的方法。

一、目的1、学习微量凯氏定氮法的原理2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。