核酸的理化性质

DNA变性的特点－爆发式
变性作用发生于一个很窄温度范围内。
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Tm值
DNA 的 双 螺 旋 结 构 失 去 一 半 时 对 应 的 温 度 称 为 DNA的解链温度（Tm）。
浓 度 50ug/mL 时 ， 双 链 DNA A260=1.00; 完全变性（单链）时， A260= 1.37 。当 A260 增加到最大 增大值一半时，即 1.185 时，对 应的温度即为Tm 。
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P503
③按磷酸二酯键断裂方式分类： 3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶 5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
P482
蛇毒磷酸二酯酶从核酸的5’端逐个水解下5’核苷酸 牛脾磷酸二酯酶从核酸的3’端逐个水解下3’核苷酸
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蛇毒磷酸二酯酶从核酸的5’端逐个水解下5’核苷酸,称为核酸5’ 外切酶，水解3’-OH形成的酯键。 牛脾磷酸二酯酶从核酸的3’端逐个水解下3’核苷酸，称为核酸3’ 外切酶，水解5’-OH形成的酯键。 10
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四、N-糖苷酶类：各种非特异的糖苷酶或对碱基特异
的N-糖苷酶，可水解糖苷键。
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第二节 核酸的酸碱性质
核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸
也就具备了可解离的酸碱性质。
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1.碱基的解离
由于嘧啶和嘌呤化合物杂环中N以及各取代基（-OH） 具结合和释放质子的能力，所以这些物质既有碱性解离又 有酸性解离。 各种碱基的解离特点及其常数见课本P505
1、Southern Blotting (DNA-blotting) 2、Northern Blotting (RNA-blotting) 3、Western Blotting (protein-blotting)
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
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核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一特 定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。
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核酸分子杂交技术的应用
基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列的定量 和定性、突变分析、疾病诊断等.
核酸分子杂交技术的类型
O O N O P O CH2 O H H O H H OH OH CMP
腺嘌呤核苷酸 pK2 = 3.7 含氮环 pK3 = 6.2 pK1 = 0.9 第二磷酸基 第一磷酸基
核 苷 酸 的 解 离 曲 线
鸟嘌呤核苷酸 pK2 = 3.7 pK3 = 6.1 含氮环 第二磷酸基 pK1 = 0.7 第一磷酸基 烯醇式羟基 胞嘧啶核苷酸 pK2 = 4.3 含氮环 pK3 = 6.3 pK1 = 0.8 第二磷酸基 第一磷酸基
测定Tm，可推知G-C含量: [(G-C)%]=（Tm-69.3）×2.44
DNA的Tm值与DNA的G－C碱基含量之间的关系
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③ 介质中离子强度
离子强度高，Tm高；介质离子强度低，Tm低。
因此，DNA制品不应该保存在很稀的电解质溶液中， 一般来说，在含盐缓冲液中保存DNA是比较稳定的。
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4. RNA的变性
离 子 化 程 度
尿嘧啶核苷酸 pK1 = 1.0 第一磷酸基 pK3 = 6.4 第二磷酸基 烯醇式羟基
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pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性 离子。 在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
RNase只作用于RNA
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（三）脱氧核糖核酸酶类(DNase)
1.牛胰脱氧核糖核酸酶:DNaseⅠ
切断双链或单链DNA，产物：以5′-磷酸为末端的寡核苷酸
2.牛脾脱氧核糖核酸酶:DNaseⅡ
产物：以3′-磷酸为末端的寡核苷酸
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
测核酸的ε(p)可判断DNA制剂是否变性或降解。
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第四节 核酸的变性、复性和杂交
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一、核酸的变性
1. 核酸变性的概念：
(denaturation)
核酸的变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉 及共价键的断裂。 核酸的降解：多核苷酸骨架上共价键(3′,5′-磷酸二酯键) 的断裂。
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一、核酸的变性
2. 核酸的变性因素：
温度升高 ： 热变性 酸碱度改变： 酸碱变性 变性剂使用：
(denaturation)
DNA测序
尿素：PAGE中常用变性剂； 甲醛：琼脂糖凝胶电泳常用变性剂
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★核酸变性后的理化性质：
260nm吸收值升高。
粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。
光 吸 收
3
0.4 2
0.3
1
0.2
1 2 3 天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值
0.1
220
240
260
280

波长（nm）
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3. DNA的变性
双链DNA
部分变性解链DNA
完全变性后分离开的单链DNA
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结构：
DNA稀盐液
80～100℃
双螺旋解体
无规线团
链内碱基配对
性质：
A260升高,粘度降低,浮力密度升高,比旋下降,酸碱滴定曲线改变
DNA
pH1.6, 37℃ 对水透析
无嘌呤酸
(除去嘌呤碱)
pH2.8 100℃、1hr
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嘧啶糖苷键的水解则需要较高温度：
嘧啶糖苷键(DNA或RNA)
甲酸(98~100%) 加热
密封(175℃ 2hr)
完全水解 尿嘧啶碱回收低
三氟乙酸加热
(DNA)
(155℃ 60min) 三氟乙酸加热
完全水解 嘧啶碱回收率高
嘌呤糖苷键
磷酸酯键
嘧啶糖 苷键
核酸的水解：所有的糖苷键、磷酸酯键能被酸、碱和酶水解。
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一、酸水解
糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，但糖苷键更易被酸
水解，嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱更易被酸水解。

对酸的敏感性：
糖苷键＞磷酸酯键
嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键
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对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键 （嘌呤碱） ：
Dase只作用于DNA
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4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限 制性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
大肠杆菌属名第一字母 所用大肠杆菌的菌株
EcoR I
种名头2个字母 细菌中已分离的这一类酶的编号
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三、酶水解
（一）核酸酶的分类
RNase（核糖核酸酶） ①按底物专一性分类：
DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶
②按对底物作用方式分类：
核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类： 3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶 5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶 ④其它分类标准
（二）核糖核酸酶类(RNase)
1.牛胰核糖核酸酶（RNaseⅠ）
最适pH ：7.0-8.2 产物：3′-嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。是高度专 一的内切酶
2.RNase T1
耐热、耐酸 产物：3′-鸟苷酸或以其为结尾的寡核苷酸，专一性更高。
3. RNase T2
产物：将tRNA完全水解为以3′-腺苷酸结尾的寡核苷酸
小牛胸腺DNA 的滴定曲线
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pH
第三节 核酸的紫外吸收P
507
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嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸 在240～290nm的紫外波段有较强吸收峰，最大吸收在260nm附近。 不同核苷酸有不同吸收特征，据此可对核酸进行定量和定性测定。 紫外吸收是实验室中最常用的定量测DNA或RNA的方法。对待 测核酸样品的纯度也可用紫外分光光度法测定。
核酸的物理化学性质
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核酸的一般物理性质
分子大小：DNA Mr 106～1010或更大 RNA Mr 104～106或更大 性状： DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微 溶于水，但它们的钠盐在水中溶解度较大。
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第一节 核酸的水解(P )
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ε(p)=
每升中磷的重量(g)
30.98A WL
比色杯内径
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ε(p)=
30.98A WL
天然DNA的ε (p)=～6600 RNA的ε (p)= 7700～7800
单链多核苷酸ε (p)比双螺旋结构多核苷酸的ε (p)值高： 核酸发生变性时，ε (p)升高，此现象称增色效应。
变性后的核酸复性后ε (p)又降低，称减色效应。
列，那么在复性时会形成杂交DNA分子。这种现象叫做核酸的 杂交。
不同的DNA单链间，或者DNA单链与互补的RNA链之间都可有
杂交现象发生。
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三、核酸的杂交 (hybridization)
双链DNA 变性解链后的两条单链DNA
能与单链DNA碱基互补的RNA
DNA-RNA杂化双链
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变性
复性
A260
>1.8-----纯DNA
A280
A260可测含量
>2.0------纯RNA
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1.通常：A260=1 相当于50μg/ml双螺旋DNA或40μg/ml单链DNA(或
RNA)或20μg/ml寡核苷酸 。