CaCl2法制备感受态细胞知识讲解
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）实验目的1.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
2.了解大肠杆菌感受态细胞的生理特性和制备原理。
实验原理受体或宿主细胞容易接受外源DNA的状态称为感受态，通过物理或化学的方法，人工诱导细胞成为敏感的感受态细胞，以便外源DNA 进入，从而实现外源DNA在宿主细胞内大量复制和表达。
在低温、低浓度CaCl2的作用下，大肠杆菌细胞膜的磷脂双分子层形成液晶结构，细胞外膜和细胞内膜间隙中的部分核酸酶解离，细胞膜的通透性增加，此时大肠杆菌成为感受态细胞。
实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、牙签、移液器、移液器吸头、离心管、离心管架、EP管、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机等。
实验试剂（1）培养基：LB，LA。
（2）溶液：10%甘油+0.1mol/L CaCl2溶液，0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液。
（3）菌株：E.coli DH5α。
实验操作（1）用灭菌的牙签蘸取少量E.coli DH5α菌液划线接种于LA 培养基上，放在恒温培养箱37℃培养后，挑取单菌落接种于10ml LB 培养基中，于37℃摇床、200rpm过夜培养。
（2）按1∶100的接种比例将过夜培养的菌液转接至100～200ml 的LB培养基中，于37℃摇床、200rpm培养3～4h，使菌液的OD600达到0.6～0.8。
（3）冰浴菌液30min，同时将灭菌过的离心管、移液器吸头、“10%甘油+0.1mol/L CaCl2”溶液等放进冰箱预冷，在超净工作台中将菌液分装到预冷的50ml的离心管中，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（4）离心后尽量除去培养液，用预冷的“0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液”重悬菌体，冰浴25min后，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（5）离心后弃去上清液，重复步骤（4）一次。
（6）弃去上清液后，将菌体重悬于冰冷的“10%甘油+0.1mol/LCaCl2溶液”中，按每管80μl分装至预冷的灭菌的EP管中，-80℃保存备用。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理1. 了解感受态细胞1.1 什么是感受态细胞？好啦，首先咱们得搞清楚什么叫“感受态细胞”。
简单来说，这种细胞就像是打了鸡血的年轻人，随时准备接受外界的挑战。
它们能吸收外来的DNA，就像海绵吸水一样，真是个“好学生”啊！这在基因工程和克隆技术中可是个大角色。
1.2 为啥要制备感受态细胞？那么，咱们为什么要制造这些细胞呢？想想吧，想把外来的基因塞到细胞里，就得让这些细胞有能力“接受”这些信息。
而氯化钙法就是个好帮手，让细胞变得更“友好”。
一旦细胞“接受”了外来的DNA，后面就能大展拳脚，生产咱们需要的各种蛋白质，真是太棒了！2. 氯化钙法的原理2.1 氯化钙的角色接下来，咱们来聊聊氯化钙的神奇之处。
它就像个“催化剂”，帮助细胞的膜变得更加通透。
要知道，细胞膜可不是随便就能让东西进来的，这可得讲究技巧。
氯化钙通过改变细胞膜的电位，让细胞“开门迎客”，让外来的DNA能顺利进来。
2.2 制备过程制备感受态细胞的过程其实也蛮有趣的，像是做一顿大餐，得准备好所有的食材。
首先，咱们需要培养一些细胞，让它们长得壮壮的。
接着，拿氯化钙溶液把这些细胞“泡”一下，时间可不能太长，否则细胞就变得“过于紧张”，容易出事。
然后，把细胞和DNA混在一起，稍微摇一摇，让它们互相“认识”。
最后，再给它们一个“热身”，放到37度的环境中，让它们慢慢适应，这样就能提高DNA的吸收率了。
3. 注意事项3.1 细胞的选择不过，制造感受态细胞并不是一帆风顺的，选择合适的细胞可是个技术活。
不同的细胞对氯化钙的反应可不一样，有些可能会对你说“谢谢，不用了”，而有些则会欢呼雀跃，接受外来的DNA。
所以，选择细胞时可得好好研究，别瞎撞。
3.2 实验环境此外，实验环境也很重要。
实验室就像是一个小宇宙，必须保持整洁和稳定。
温度、湿度、气体成分，这些都得像对待女朋友一样小心翼翼，稍有不慎，细胞就可能“罢工”。
所以，千万别小看这些细节，搞不好就得重头再来，真是得不偿失。
CaCl2法大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~4ml LB液体培养中，37℃振荡培养~12h左右，直至对数生长期。
将该菌悬液以1:100～1:50转接于3 x 100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2）取培养液50ml转入50ml离心管中，在冰上冷却30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，用15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10Min；（4）0～4℃，4000r／min离心10min；
（5）弃去上清液，加入~15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。
冰浴10 min 后，0～4℃，4000r／min离心10min；
（6）弃去上清液，加入2ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）加入占总体积10％左右高压灭菌过的甘油，混匀后以200 l为单位分装于0.5ml EP 管中，置于-80℃保存。
制备感受态细胞(CaCl2法)(Jin Lab)
Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。
次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。
12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。
可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。
计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
CaCl2法制备感受态细胞-1
CaCl2法制备感受态细胞1）从新划线的平皿上挑取一个单菌落接种到10ml的LB培养基中于37℃过夜培养2）吸取500μl上述过夜培养的新鲜菌液，接种到一个盛有50ml LB的锥形瓶中，在37℃，200rpm条件下振荡培养直至菌浓度达到5×107个/ml，对大多数大肠杆菌菌株来说这时的OD600值为0.4~0.5。
一般从转接到达到此OD值约需2.5―3小时。
3）将培养液转至一灭菌并已预冷的50ml离心管（聚丙烯管）中于冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
4）然后于4℃以3000 rpm离心10min沉淀细胞，小心地弃去上清液，并倒转管子将残余的液体沥干。
5）将细胞悬浮在10ml冷的0.1mol/lCaCl2中，置冰上10min。
重复第4步操作，以沉淀菌体细胞。
6）收集菌体，加入1.5ml预冷的0.1mol/lCaCl2,小心悬浮，分装于200ul/管，若不马上进行转化，该感受态细胞可加入终浓度为10%的灭菌甘油，置于-70℃保存小刚论文：大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备挑取新鲜的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种于5ml LB培养基中，于37℃摇床培养过夜；培养物按1%接种量接种于100ml LB培养基中，37℃培养至OD600为0.5。
培养物冰上放置10分钟，然后于4℃，4000r/min 离心收集菌体（无菌离心管）；将菌体用10ml冰冷的0.1M CaCl2洗一次；4℃，4000r/min 离心收集菌体，用10ml冰冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min；4℃，4000r/min 离心收集菌体，加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液，即制备成大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
质粒转化过程操作步骤（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5 10min。
（3）加入5–10 μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上30min。
cacl2制备感受态细胞的原理
cacl2制备感受态细胞的原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!CaCl2制备感受态细胞的原理1. 导言感受态细胞在生物学和医学领域中起着至关重要的作用。
细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞
实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。
实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。
菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。
目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。
复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。
感受态细胞制备原理
感受态细胞制备原理
原理：
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。
此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
转化效率可达106-107转化子/微克DNA。
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。
操作：
1、取-70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。
2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）
3、当菌落600nm OD值达到时，将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。
在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。
4℃，4000g离心10分钟。
4、弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。
5、4℃，4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体。
每管分装，至4℃保存备用，24-48小时内使用效果较好。
如果暂时不用，可再保存于-70℃的低温冰箱中。
CaCl2法制备感受态细胞知识讲解
C a C l2法制备感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2法）及转化方法感受态细胞的制备：方案一：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；4）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min；5）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）方案二：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）将培养物连至锥形瓶至于冰上冰浴30min;4）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；5）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）热击转化步骤：1）在制备好的感受态细胞100 μL中，加入10 μl连接产物或1μl 质粒（依照质粒浓度而定）混匀，冰上放置30 min；2) 42 ℃温浴90 s（或者45℃温浴45 s）后迅速置入冰上1 min，加入800 μL LB培养基，37 ℃，180 r/min培养45min-1 h；3) 将孵化好的菌液涂布在相应的抗性平板上倒置，37 ℃培养过夜，PCR鉴定阳性转化子。
氯化钙制备感受态细胞
精品 Word 可修改 欢迎下载 氯化钙法（兴湘）制备感受态细胞什么是感受态细胞？感受态细胞（competent cell ）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态。
氯化钙法（兴湘）制备感受态细胞的原理？细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。
钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。
在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA 进入。
影响感受态细胞制备的因素有哪些？1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期 的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 ×107/ml ）。
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行。
3．经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）。
4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）。
5．所使用的器皿必须干净。
迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA 。
7．一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比感受态细胞制备中，加了两次氯化钙，它们的作用分别是什么？除了增加细胞通透性之外，第一次还有洗净之前一步残留的LB 液体的作用。
精品 Word 可修改 欢迎下载1、最困难的事就是认识自己。
21.5.175.17.202111:1511:15:16May-2111:152、自知之明是最难得的知识。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理【化学魔法，感受态细胞的秘密】哎哟喂，朋友们，咱们今天要聊的可是个高大上的科学话题——氯化钙法制备感受态细胞的原理。
这个听起来是不是有点像变魔术？没错，它就像是把普通的水变成了神奇的药水，让我们能够在实验室里轻松地培养出那种超级无敌的感受态细胞！咱们得知道什么是感受态细胞。
简单来说，就是那些经过特殊处理，能够接受外源DNA并稳定表达的细胞。
这些细胞就像是一个待命的“小精灵”，一旦有新的“任务”下达，它们就能立刻变身为执行者。
而氯化钙法，就是我们用来驯服这些小精灵的神奇魔法棒。
那么，氯化钙法是怎么做到的呢？其实，这全赖于氯化钙那神奇的“魔力”。
想象一下，你手里握着一根魔杖，轻轻一挥，那些原本呆若木鸡的细胞们就变得活跃起来，仿佛被施了魔法一样。
这个过程就像是在给细胞们穿上了一件隐形的斗篷，让他们能够在各种环境中自由穿梭，不受外界干扰。
接下来，咱们来聊聊氯化钙法的具体操作步骤。
你得准备好一些氯化钙溶液和感受态细胞。
然后，按照一定的比例将氯化钙溶液加入到感受态细胞的培养基中。
这时候，你只需要静静地等待，看着那些细胞们如何在氯化钙的“魔法”下翩翩起舞。
大约过了几分钟后，你就会发现，那些原本僵硬的细胞们已经变得活力四射，仿佛被注入了一股新生的力量。
当然啦，氯化钙法虽然神奇，但也不是万能的。
有时候，我们可能需要根据具体情况对氯化钙法进行调整。
比如，如果你需要培养的是一些对氯化钙敏感的细胞，那么你就得小心一些，避免过度使用氯化钙。
也要注意观察细胞的变化情况，以便及时调整实验条件。
我想说的是，氯化钙法制备感受态细胞的原理就像是一场精彩的魔术表演。
它不仅让我们能够在实验室里轻松地培养出感受态细胞，还让我们对生物学领域有了更深的了解和认识。
所以，下次当你看到有人用氯化钙法制备感受态细胞时，不妨学着用一颗好奇的心去探索这个神奇的世界吧！。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理揭秘！氯化钙法如何变身“魔法棒”，让感受态细胞翩翩起舞嘿，朋友们，咱们今天来聊聊那个让人既激动又神秘的化学小把戏——氯化钙法制备感受态细胞。
这个听起来有点高科技的玩意儿，其实就藏在我们实验室里那些小小的试剂瓶和试管里，就像是魔法师手里的魔杖一样，轻轻一挥，就能把感受态细胞变成超级英雄！你得知道什么是感受态细胞。
这可是个高科技生物工程中的宝贝疙瘩，它就像是一个经过特殊训练、随时准备接受新挑战的小战士。
科学家们用它来接收外源DNA，就像超人接住飞来的球一样，神奇极了！那么，氯化钙法是怎么做到的呢？简单来说，就是利用氯化钙这种化学物质的特性。
想象一下，你手里握着一根魔杖，轻轻一挥，魔杖尖端冒出了一束神奇的光，那光一接触到细胞，细胞就像被施了魔法一样，开始变得活泼起来。
这就是氯化钙法的魅力所在——它能让细胞“活”起来，准备好迎接新的挑战。
不过，别以为这个过程就这么轻松哦。
科学家们可是花了不少心思和功夫，才让这根魔杖变得如此强大。
他们先是小心翼翼地调配出一种特殊的溶液，然后轻轻地将细胞放入其中。
这个过程就像是在给细胞做一场“SPA”，让它在舒适的环境中彻底放松。
接下来，科学家们会耐心等待，就像看魔术表演一样，期待着那个神奇的时刻。
当看到细胞开始活跃起来，发出微微的荧光时，他们就知道成功了！那一刻，整个实验室都仿佛被喜悦和成就感充满。
当然啦，这个过程虽然看起来简单，但背后可是隐藏着许多科学原理和技巧。
比如，如何控制氯化钙溶液的浓度、如何避免污染、如何确保整个过程的无菌等等。
这些都是科学家们需要仔细研究和掌握的知识。
我想说的是，虽然氯化钙法制备感受态细胞听起来有点神秘兮兮的，但它其实并不是遥不可及的魔法。
只要我们掌握了正确的方法和技巧，就能像变魔术一样，轻松地将感受态细胞变成超级英雄！所以啊，下次当你看到实验室里的那些小小试剂瓶和试管时，不妨想想它们背后的科学原理和故事。
说不定你会发现，那些看似平凡的试剂瓶里，藏着多少令人惊叹的科学奥秘呢！。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
实验六 感受态大肠杆菌细胞的制备
实验六感受态大肠杆菌细胞的制备一、实验目的1、了解什么是感受态细胞。
2、掌握利用CaCL2制备感受态大肠杆菌细胞的方法。
二、实验原理感受态细胞是经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
CaCl2法：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。
三、实验仪器及药品耗材1、主要仪器：冷冻离心机，超净工作台、酒精灯、打火机、制冰机、冰盒、液器、接种针、镊子等。
2、主要药品及耗材：大肠杆菌DH5a，酵母粉、胰蛋白胨、琼脂粉、Nacl、CaCl2、1.5 ml离心管、移液器吸头、无水乙醇及医用棉花。
四、实验步骤1、从-70℃冰箱取出大肠杆菌DH5a，用划线法涂于LB固体平板培养基，放于37℃过夜培养12-16小时。
2、在平板上挑起一个单菌落，接种于100ml液体LB培养基中，放于恒温摇床，37℃,150 rpm，培养4-5个小时。
3、检测菌液OD值变化，当菌液OD值A600在0.4-0.6之间时，将菌液放在冰中停止培养。
4、取1ml菌液，放于1.5ml离心管中，4 ℃,4000r/min,离心10分钟。
5、将管口倒置尽量去除上清液。
6、加入1 ml 在冰中预冷的0.1 mol/l CaCl2溶液，轻轻弹动离心管，使沉淀悬浮（禁止剧烈震荡）。
7、4 ℃,4000 r/min,离心10分钟。
8、将管口倒置尽量去除上清液。
9、加入1ml 在冰中预冷的0.1 mol/l CaCl2，轻轻弹动离心管，使沉淀悬浮，禁止剧烈震荡。
此细胞即为感受态细胞。
10、将感受态放于-70℃冰箱保存，备用。
注意：以上操作尽量在冰上进行。
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理：转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。
准备：1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，高温高压灭菌；注：CaCl2必须为分析纯以上。
5.5492、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。
3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。
注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。
实验步骤：1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。
注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。
（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
C a C l2法制备感受态
细胞
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化
实验原理
处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备
出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂
(1)0.1mol/L CaCl2溶液
(2)LB液体培养基
(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备
(1)超净工作台
(2)冷冻离心机
(3)恒温摇床
(4)－70℃冰箱
(5)10mL移液管
(6)吸耳球
(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）
(8)50mL 离心管
(9)1.5mL离心管
实验材料
(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）
实验步骤
（一）受体菌的培养
(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。
）
(1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
(2)在4℃下，4000r/min离心10min。
弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。
(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置
30min。
(4)0～4℃ 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。
（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。
(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。
（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。
）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。
对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑶、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。