溶菌酶活性的AFM研究

食品工业科技
反应， 反应菌液始终混浊， 吸光度也不改变。
３ 讨论
溶菌酶来源广泛， 种类很多， 其酶活也相差较 大， 作为一种蛋白质， 影响其活力的因素也很多， 和 具体反应条件有很大关系。在溶菌酶溶液浓度为 ０．０１ｍｇ／ｍＬ 的 情 况 下 ， 我 们 使 用 ＡＦＭ， 成 功 观 察 到 了 随时间延长， 溶菌酶对溶壁微球菌细胞壁逐渐破坏 裂解的过程， 从实验结果可见， 溶菌酶的作用是非常 迅速的， 在加入菌液后 ０．５ｍｉｎ 溶壁微球菌细胞壁已 经受到了明显的损伤， 局部出现一些凹陷， 并随着反 应时间的增加， 逐渐形成遍布整个菌体的裂纹， 最终 裂解为数小块残骸。除了裂开的方式， 我们还在反应 １０ｍｉｎ 菌体表面观察到了许多直径几十纳米的小孔， 这可能是由于细胞壁降解后， 溶壁微球菌破裂， 内部 的内毒素和水解酶溢出继续攻击菌体造成的。而当 溶菌酶浓度上升到 １ｍｇ／ｍＬ 后， 反应菌液反而不再变 澄 清 ， 而 我 们 用 ＡＦＭ 观 察 的 结 果 表 明 ， 反 应 并 非 没 有发生， 溶壁微球菌的形态发生了明显的改变， 变得 扁平而不规则， 这显然是由于失去了细胞壁的支持 而形成的现象， 只是由于细菌依然保持完整， 所以用 传统的比浊度法无法观察到酶活作用的现象。可 见， 在某些特定的反应条件下， 比浊度法并不能有 效的测定反应的结果 ， 而 ＡＦＭ 由于其简便、直观、可 视及高分辩的特点， 在生理反应的观察方面具有独 特的优势， 能观测到传统比浊法所不能探测的酶活 现象。
当其他反应条件不变， 仅把溶菌酶溶液浓度增 加 到 １ｍｇ／ｍＬ 进 行 反 应 时 发 现 ， 反 应 菌 液 不 再 变 澄 清， 菌液的吸光度值也不发生变化， 似乎溶菌酶突然 间失去了活性， 不再裂解细菌。取反 应 ５ｍｉｎ 的 菌 液 滴于云母片上， 空气中迅速干燥后在 ＡＦＭ 下 观 察 ， 发现溶壁微球菌的形态已发生了改变， 由原来饱满 鼓胀的球形变得扁平， 呈不太规则的圆形， 菌的高度 从反应前的约 ７００ｎｍ 下降到 ２００～３００ｎｍ， 直径增加 到 １．５μｍ 以上， 其表面也不再均匀光滑， 出现一些轻 微的褶皱和起伏， 但是细菌整体却没有出现大的损 伤， 未发现有破裂和孔洞凹陷（ 图 ４） ， 溶壁微球菌的 整体性得以维持， 内容物也没有泄漏出来， 所以反应 菌液一直保持浑浊。ＡＦＭ 观察的结果说明， 溶菌酶并 未失去活性， 溶壁微球菌的细胞壁依然受到了一定 程度的损伤， 使其无法继续维持溶壁微球菌的形态， 菌的形状变得扁平不规则， 但是细胞壁的损伤尚不 足以导致细菌的破裂解体， 细菌基本保持完整， 所以 从宏观上来看， 似乎溶菌酶并未与溶壁微球菌发生
０．００ １．００
２．００!ｍ ０．００
１．００
２．００!ｍ
图 ２ ０．０１ｍｇ／ｍＬ 溶菌酶作用于微壁溶球菌 ０．５ｍｉｎ 和 ５ｍｉｎ 后的 ＡＦＭ 图像
注： Ａ 为作用 ０．５ｍｉｎ 后的图像， Ｂ 为作用 ５ｍｉｎ 后的图像。 扫描范围： Ａ： ２．２μｍ×２．２μｍ； Ｂ： ２μｍ×２μｍ。
０．００
１．００
２．００!ｍ ０
２００ ４００ｎｍ
图 ３ ０．０１ｍｇ／ｍＬ 溶菌酶作用于微壁溶球菌 １０ｍｉｎ 后的 ＡＦＭ 图像
注： 图 Ｂ 为 Ａ 中方框部分的超微结构扫描。 扫描范围： Ａ： ２μｍ×２μｍ； Ｂ： ５００ｎｍ×５００ｎｍ。
生裂纹外， 其表面还有许多直径几十纳米的小孔。
２．３ １ｍｇ／ｍＬ 浓 度 的 溶 菌 酶 对 溶 壁 微 球 菌 作 用 的 ＡＦＭ 观察
本试验在其他条件一致， 仅提高溶菌酶浓度的 情况下， 得到了差异较大的试验结果， 在酶浓度提高 的情况下， 对底物溶壁微球菌的裂解程度反而降低。 这有可能是因为随着蛋白质浓度的提高， 在有盐存 在的情况下， 蛋白分子之间有可能形成聚集体， 甚至 结晶析出， 溶菌酶作为研究蛋白晶体的一种模式蛋 白， 对其在盐溶液中结晶和聚集已有广泛的报道［５］。 １ｍｇ／ｍＬ 的溶菌酶浓度虽然 不 高 ， 但 是 有 可 能 在 盐 溶
１１８ ２００７ 年第 ０２ 期
０．００ １．００ ２．００ ３．００!ｍ ０
４００
８００ｎｍ
图 ４ １ｍｇ／ｍＬ 溶菌酶作用于溶壁微球菌 ５ｍｉｎ 后的 ＡＦＭ 图像
注： Ｂ 是 Ａ 中方框部分的超微结构扫描， 扫描范围： Ａ： ３μｍ×３μｍ； Ｂ： ８００ｎｍ×８００ｎｍ。
研究与探讨
Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．０２，２００７
关键词： 溶菌酶， ＡＦＭ， 酶活
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｈｅ ｅ ｆｆｅ ｃ ｔ ｏｆ ｍｉｃ ｒｏｃ ｏｃ ｃ ｕｓ ｌｙｓ ｏｄ ｅ ｉｋｔｉｃ ｕｓ ｔｒｅ ａ ｔ ｗｉｔｈ ｌｙｓ ｏｚｙｍｅ ｏｆ ｄ ｉｆｆｅ ｒｅ ｎｔ ｃ ｏｎｃ ｅ ｎｔｒａ ｔｉｏｎ ｗｅ ｒｅ ｉｍａ ｇ ｅ ｄ ｂ ｙ ａ ｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃ ｅ ｍｉｃ ｒｏｓ ｃ ｏｐ ｙ， ｗｈｅ ｎ ｔｈｅ ｃ ｏｎｃ ｅ ｎｔｒａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓ ｏｚｙｍｅ ｉｓ ０．０１ｍｇ／ｍＬ， ｗａ ｓ ｄ ａ ｍａ ｇ ｅ ｄ ｒａ ｐ ｉｄ ｌｙ， ｗｈｅ ｎ ｔｈｅ ｃ ｏｎｃ ｅ ｎｔｒａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓ ｏｚｙｍｅ ｒａ ｉｓ ｅ ｔｏ １ｍｇ／ｍＬ ， ｄ ｉｓ ｔｏｒｔｉｏｎ ｗｅ ｒｅ ｏｂ ｓ ｅ ｒｖｅ ｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｃ ｒｏｃ ｏｃ ｃ ｕｓ ｌｙｓ ｏｄ ｅ ｉｋｔｉｃ ｕｓ ｉｎｓ ｔｅ ａ ｄ ｏｆ ｄ ｉｓ ｉｎｔｅ ｇ ｒａ ｔｅ ｄ ．
１．２ 实验方法
称取适量的溶菌酶干粉， 溶于预配好的磷酸盐 缓 冲 溶 液 （ ０．０５ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ６．２） 中 ， 分 别 配 成 酶 终 浓 度 为 ０．０１ 和 １ｍｇ／ｍＬ 两 种 不 同 浓 度 的 溶 菌 酶 溶 液 。 溶 壁微球菌以同样缓冲液配成 ３ｍｇ／ｍＬ 的菌液。取溶菌 酶 溶 液 ５０μＬ 加 入 菌 液 ２００μＬ， 混 匀 ， 置 于 ２５℃恒 温 摇 床 （ ５０ｒ／ｍｉｎ） ， 分 别 取 未 加 酶 的 菌 液 和 反 应 ０．５、５、 １０ｍｉｎ 时 间 点 的 反 应 液 少 量 ， 涂 于 新 揭 的 云 母 片 表 面， 置于干燥器内迅速干燥后， 将云母片固定在 ＡＦＭ 的扫描台上进行扫描观察， 试验采用 １００μｍ 扫描器， ＵＬ２０Ｂ 硅 探 针 ， 力 常 数 为 ２．８Ｎ／ｍ， 在 轻 敲 模 式 （ ｔａｐｐｉｎｇ ｍｏｄｅ） 下 进 行 扫 描 ， 所 得 图 像 以 仪 器 随 机 软
然 科 学 基 金 重 点 项 目 （ ３０２３０３５０） ； 国 家 自 然 科 学 基 金 （ ６０５７８０２５） ； 国家自然科学基金资助对外交流与 合 作 项 目 （ ３０５４０４２０３１１） 。
生物源， 不同来源的溶菌酶的活性各不相同， 加上制 备 方 法 、保 存 方 式 、具 体 反 应 条 件 等 的 差 异 都 会 影 响 酶 的 活 力 ［２］， 所 以 ， 在 溶 菌 酶 的 应 用 中 ， 溶 菌 酶 活 性 的测定是一个重要的步骤， 测定的方法也是多种多 样［３］， 不 同 的 方 法 测 定 的 结 果 也 有 较 大 差 异 。 目 前 ， 对于溶菌酶活性的测定方法主要是比浊度法， 以溶 壁微球菌为底物， 通过测定酶作用前后菌液的吸光 度的变化来表示。但对于溶菌酶对细菌作用的具体 过程目前尚不清楚。由于原子 力 显 微 镜 （ ＡＦＭ） 可 在 接近生理环境下对样品进行观察及亚纳米级的分辨 率等特点［４］， 使得其在生物学研究各领域有着越来越 广泛的应用。本文使用原子力显微镜， 对与溶菌酶溶 液作用不同时间段的溶壁微球菌进行了观察， 观测 了不同反应时间和不同酶浓度对溶壁微球菌的杀伤 作用， 并与传统的比浊度法进行了比较。
研究与探讨
Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．０２，２００７
食品工业科技
溶菌酶活性的 ＡＦＭ 研究
廖问陶， 刘源岗， 王云起， 王小平， 李国有， 蔡继业 ＊ （ 暨南大学化学系， 广东广州 ５１０６３２）
摘 要 ： 以 溶 壁 微 球 菌 为 底 物 ， 用 原 子 力 显 微 镜 （ Ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ＡＦＭ） 观察到了不同浓度的溶菌酶与溶壁微 球菌相反应的作用过程。结果发现， 在溶菌酶浓度为 ０．０１ｍｇ／ ｍＬ 的情况下， 反应菌液逐渐变澄清， 溶壁微球 菌 的裂解程度随着反应时间的延长而逐渐加剧； 而在酶浓 度增大为 １ｍｇ／ ｍＬ 时 ， 反 应 菌 液 反 而 不 再 变 清 ， ＡＦＭ 观 察到溶壁微球菌仅发生变形， 但 未 裂 解 。ＡＦＭ 是 观 测 酶 活生理过程的有力工具， 同时还为酶活测定开辟了新思 路， 是传统酶活测定方法的有力补充。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
溶菌酶 ２００００Ｕ／ｍｇ， 华美生物工程公司； 溶壁微 球菌 美国 Ｓｉｇｍａ 公司； 磷酸二氢钾、氢氧化钠 分析 纯， 广州化学试剂厂。
原 子 力 显 微 镜 （ Ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ＡＦＭ） ＡｕｔｏＰｒｏｂｅ ＣＰ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， 美 国 Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ 公 司。
Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ：ｌｙｓ ｏｚｙｍｅ ； ＡＦＭ； ｅ ｎｚｙｍｅ ａ ｃ ｔｉｖｉｔｙ
中图分类号： ＴＳ２０１．２＋５ 文献标识码： Ａ 文 章 编 号 ： １００２－ ０３０６（ ２００７） ０２－ ０１１７－ ０３
溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的非特异性 免疫分子 ， 能降解细菌细胞壁中 Ｎ－ 乙酰葡萄 糖 胺 与 Ｎ－ 乙酰胞壁酸之间的 β－ １， ４ 糖苷键， 引起细菌裂解， 尤其是革兰氏阳性菌， 同时对生物体没有毒害作用 且有一定保健效果。它能有效的抗菌， 抗病毒， 清除 坏死组织， 加快创口修复再生， 在医药保健和食品工 业中有着广泛的应用， 是一种理想的保鲜和防腐添 加剂［１］。此外， 溶菌酶在基础研究领域也发挥着重要 的作用， 是生物技术科研中一种重要的工具酶， 并且 是蛋白晶体研究中的一种常见的模式蛋白。溶菌酶
２００７ 年第 ０２ 期 １１７
食品工业科技
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｉ ｎｄｕｓｔｒｙ
研究与探讨
件 （ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ Ｐｒｏｓｃａｎ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１） 进行平滑处理与数据分析。
０ ４００ ８００ ｎｍ
０ １００ ２００ ｎｍ
图 １ 溶壁微球菌的 ＡＦＭ 图像
注： 图 Ｂ 为 Ａ 中方框部分。
扫描范围 Ａ： １μｍ×１μｍ； Ｂ： ３００ｎｍ×３００ｎｍ。
２．２ ０．０１ｍｇ／ｍＬ 浓度的溶菌酶对溶壁微球菌作用的 ＡＦＭ来自百度文库观察
菌液加入溶菌酶后， 开始明显逐渐变澄清， 吸光 度探测探测到反应菌液在逐渐变透明 （ 数据未附） 。 ＡＦＭ 观 察 发 现 ， 在 反 应 开 始 ０．５ｍｉｎ 之 后 ， 已 经 可 以 观测到细菌表面明显的损伤， 局部出现一些孔洞， 同 时由于内容物外泻， 导致细菌塌陷， 细菌的高度下降 到 ２００ｎｍ 左右。但是细菌并未解体， 仍然基本保持完 整。反应到５ｍｉｎ 时， 微球菌受到的损伤进一步加剧， 细菌表面布满大大小小的裂纹， 细菌的高度下降到 １５０ｎｍ 左右（ 图 ２） 。在反应到 １０ｍｉｎ 时， 细菌表面的 裂纹变大变深， 细菌基本裂解为数小块， 成为一些约 ６０ｎｍ 高的残骸， 周围散布许多细菌 内 溢 出 的 内 容 物 （ 图 ３） 。同时超微结构扫描显示， 细菌除了被裂解产
２ 结果与分析
２．１ 溶菌酶处理前溶壁微球菌的 ＡＦＭ 观察
未 添 加 溶 菌 酶 的 菌 液 呈 暗 黄 色 浑 浊 ， ＡＦＭ 扫 描 结果显示， 溶壁微球菌呈规则饱满的球形， 表面光滑 细致， 没有起伏凹陷或其他生理构造， 直径约为 １μｍ， 高度约为 ６００～７００ｎｍ 之间（ 图 １） 。
来源多种多样 ， 根据来源可分为动物源、植物源和微
收稿日期： ２００６－ ０６－ ０９ ＊ 通讯联系人 作 者 简 介 ： 廖 问 陶 （ １９７７－ ） ， 男 ， 博 士 ， 主 要 从 事 生 物 工 程 方 面 的 科 研
工作。 基金项目： 国家“十五”９７３ 重 大 项 目 子 项 目 （ ２００１ＣＢ５１０１０１） ； 国 家 自