微生物的高密度培养

微生物的高密度培养

定义一[1]

高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。单位：细胞干重/升（DCW/L）。凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。

定义二[2]

细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。

用途[1]

各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。

发展状况[2]

细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。

谷胱甘肽(GSH)的生产[3]

谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。本研究室[4～6]近来深入研究了影响面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产GSH的各种重要因素,目前仍在进行有关高菌种选育、发酵过程优化和产物提取的研究工作。构建具有高GSH合成活性的重组E.coli是近十年来GSH 生物合成研究中的一个新方向,其关键在于将分别编码GSHⅠ和GSHⅡ的基因gshⅠ和gshⅡ在宿主菌中高效表达。重组或非重组的S.cerevisiae相比,重组E.coli具有生长速度更快、产物提取更容易等优点。 Murata等[7,8]通过在细胞中扩增gshⅠ和gshⅡ成功地获得了具有较强GSH合成能力的重组E.coli,但没有深入研究高细胞密度培养技术。实际上,与其它胞内重组蛋白一样,GSH的体积生产率通常随着发酵液中的细胞密度增大而增加,故研究生产菌株的高密度培养方法,在保证GSH合成活性的前提下使反应器中工程菌的细胞密度尽可能高,不仅有利于提高生产率,也有利于后提取与纯化的进行。本文报道高密度培养重组大肠杆菌生产GSH的研究结果。

1 材料与方法

1.1 试剂

谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)、还原型辅酶Ⅱ (NADPH)、5′-三磷酸腺苷( ATP)和DTNB (5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid))均为Sigma公司产品。 GSH 和GSSG购自华美生物工程公司。酵母膏为Oxoid产品。葡萄糖购自无锡润生淀粉油脂公司。

其余试剂均为国产分析纯。

1.2 菌种

重组大肠杆菌(Escherichia coli)WSH-KE1,gshⅠ和gshⅡ基因的拷贝数为2∶1,由韩国仁荷大学生物工程系提供。

1.3 主要发酵设备

上海HYG-Ⅱ回转式恒温调速摇瓶柜。美国Virtis 2.5L实验用台式玻璃发酵罐,配备温度、pH自动控制系统、溶氧自动显示。

1.4 培养基

斜面培养基: (g /L)蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10,琼脂20,氨苄青霉0.05;pH=7.2。

种子培养基: (g /L)蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10,葡萄糖30;pH7.2。发酵培养基: (g /L)葡萄糖10.0, KH2PO4 13.3,(NH4)2HPO4 4.0,MgSO4·7H2O 1.2,柠檬酸1.7;(mg /L)EDTA 8.4, CoCl2·6H2O 2.5,MnCl2·4H2O 15.0,CuCl2·2H2O 1.5, H3BO3 3.0, Na2MoO4·2H2O 2.5,Zn(CH3COO)2·2H2O 13.0,柠檬酸铁(Ⅲ)100.0,盐酸硫胺 4.5;消泡剂0.5ml(摇瓶不加);pH=7.2。

流加培养基:(g /L)葡萄糖600,MgSO4·7H2O 20.0; (mg /L) EDTA 13.0, CoCl2·6H2O 4.0,MnCl2·4H2O23.5, CuCl2·2H2O 2.5, H3BO35.0,Na2MoO4·2H2O4.0, Zn(CH3COO)2·2H2O 16.0,柠檬酸铁(Ⅲ) 40.0;消泡剂1.0ml,pH=7.2。

1.5 培养方法

1.5.1 摇瓶培养

菌种在斜面培养基上30℃培养24 h后,接入种子培养基(装液量25 ml/250 ml锥形瓶)。30℃振荡培养24 h后,以10%接种量接入发酵培养基(装液量50 ml/500 ml锥形瓶),发酵时间如无特别注明均为24 h。

1.5.2 流加培养

2.5 L发酵罐中装液量1.0 L,接种量20% ,发酵温度30℃ ,通过调节搅拌转速和空气流速使溶氧百分数保持不低于30% ,当通空气无法满足溶氧要求时开始通纯氧。通过流加氨水控制pH在7.2左右。分批培养8h后,按不同实验要求进行流加培养。葡萄糖浓度反馈控制流加:发酵过程中每隔0.5 h测定罐内葡萄糖浓度,根据罐内残糖浓度的高低来调节葡萄糖流加速率,以便将罐内葡萄糖浓度控制在很低的范围内。恒速流加:以恒定的速率将流加培养基流加入发酵罐,流加速率可按实验要求变化。指数流加:按指数流加模式[9]: Fi=_*V0X0exp (_*t)/Yx/s(SF-S)计算得出流加曲线,因无法连续改变进料量,故采用每1 h变化一次流加量的阶梯式进料方式。

1.6 分析方法

葡萄糖浓度和细胞干重:见文献[10]。胞内GSH含量:按Murata[11]等报道的方法从大肠杆菌细胞内提取GSH,采用Tie-tze[12]的改良DTNB-GSSG循环分析法分析提取液中GSH含量。

参考文献

[1]刘子宇，李平兰，郑海涛，靳志强.微生物高密度培养的研究进展.中国乳业，2005

[2]齐士朋，徐尔尼，罗玉芬，巫小丹.细胞高密度培养技术的应用研究进展.南昌大学,2011

[3]李寅,陈坚,伦世仪.中国医药工业杂志,1999;01

[4]李寅,陈坚,周楠迪等.生物工程学报,1998;14(2)∶ 149

[5]李寅,陈坚,周楠迪等.中国医药工业杂志,1998;29(12)∶ 537

[6]周楠迪,李寅,陈坚等.生物技术,1997;7(4)∶ 30

[7]Murata K,KimuraA.Appl Environ Microbiol,1982;44∶ 1444

[8]MurataK,MiyaT,Gushima Het al. AgricBiol Chem,1983;47∶ 1381

[9]李寅,陈坚,宋祺等.生物工程学报,1997;13∶160