微生物的高密度培养
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法
一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法酿酒酵母是一种重要的微生物资源，广泛应用于酿造行业。
高密度发酵培养是提高酿酒酵母生产效率的关键技术之一。
本文将介绍一种高密度发酵酿酒酵母的培养方法。
首先，酿酒酵母的培养基是高密度发酵的关键。
传统的酵母培养基主要由碳源、氮源、无机盐和微量元素组成。
在高密度发酵中，碳源的选择对提高酵母生长速度和酒精产生率很重要。
常用的碳源有葡萄糖、麦芽糖和淀粉等。
氮源是合成蛋白质和酵母细胞增殖的关键，常用的氮源有尿素、酵母浸渍物和氨态氮等。
在培养基中添加适量的无机盐和微量元素可以提供必需的元素，维持酵母细胞的正常生长和代谢活动。
其次，培养条件的调控对高密度发酵效果也有影响。
温度是控制酵母生长速率和代谢的重要因素，一般酿酒酵母的适宜培养温度为28-32摄氏度。
pH值是影响酵母生长和酒精产生的重要因素，常规条件下酵母培养基的pH值在4.5-5.5之间。
通风条件也是高密度发酵的重要指标，合理的通风条件有利于提供足够的氧气，促进酵母的代谢活动。
此外，酿酒酵母的菌种的选取也是高密度发酵成功的关键。
目前常用的菌种包括酒链球菌、面包酵母等。
选取适宜的菌株是提高高密度发酵效率的前提，菌株应具有良好的生长能力和耐受性，能够在高浓度的酒精环境中生存和繁殖。
最后，监控和调控发酵过程对高密度发酵的成功也至关重要。
通过监测酵母生长曲线、酒精产量和其它重要的发酵参数，可以及时发现并纠正发酵过程中的问题，提高发酵效果。
在发酵过程中，定期采集发酵液进行物理化学分析和微生物检验，以确保发酵过程的有效控制。
综上所述，高密度发酵是提高酿酒酵母生产效率的重要手段之一。
通过优化培养基组成、调控培养条件、选用合适的菌株以及监控和调控发酵过程，可以取得较高的发酵效果。
酒精工业可以借鉴这些方法，提高酿酒酵母的生产效率，推动酒精工业的可持续发展。
微生物高细胞密度培养技术及其在食品添加剂生产中的应用
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蛭弧菌高密度培养方法
蛭弧菌高密度培养方法一.大肠杆菌的发酵罐培养1.斜面菌种制作:培养基:蛋白胨10g/L 牛肉膏5g/L 酵母粉，膏，5g/L 葡萄糖5g/L 氯化钠5g/L 琼脂15-20g/L PH7.0-7.2,方法1:冻干管，青霉素瓶，中加入4ml生理盐水,震荡均匀制成菌悬液,转接于30m/150ml牛膏蛋白胨培养液中,37? 200rpm/min培养24h,用接种环划线于固体培养基上,37? 培养18-24h,选择表面光滑园整大小形态均一的多个单菌落接种于斜面,其中22x200mm大斜面数十支，一月生产用种，,15x150mm斜面4-5支作为保种,保种至少两种方式,2支液体矿油保种,2支甘油保种，每支斜面注入2-4ml生理盐水、无菌水或培养液刮洗菌苔,然后集中于灭菌空试管中,震荡均匀,另叏含灭菌，至少两次，的浓度50,甘油的溶液备用,叏灭菌2ml离心管数个,分别用灭菌长径滴管吸叏菌悬液0.8-0.9ml 甘油浓度50,甘油的溶液0.8-0.9ml注入离心管中,旋盖震荡均匀后置于-20冰箱保存，甘油管的多少根据月生产量而定,每月使用1-2支甘油管活化,划线叏单菌落于生产斜面的制作,暂不进行保种，,一般保存6-12月,甘油冷冻保藏适用于好氧细菌和酵母菌中长期保存。
方法2:叏一支冻干管在无菌条件下用无菌吸管吸叏0.3-0.5 ml培养液,滴入内管内,轻微震荡，吸管协助，,直到均匀制成菌悬液。
用无菌滴管吸叏0.2-0.3ml菌悬液滴在两支空白斜面，18x180mm，上涂布(余下的菌悬液转接于4-5ml液体培养基中适温培养,镜检菌体个体形态等),用接种环蘸去少量菌液在平板或茄型瓶，45-50ml/200ml，平面划线,挑叏典型菌落，生长快菌落大，转接1于斜面,37?培养18-24h,再次转接于10支斜面,其中2-3支保种，至少两种保种方式，,其余作为生产用种出収种。
生产使用大试管，22x200mm，,注入20ml培养基/支,棉塞牛皮纸扎好,高压灭菌30-40min,稍冷,摆放斜面12-24h ,37?空培24h,基本无冷凝水,无杂菌时方可转接,每支出収菌种转接20-30支,37?培养18-24h,置于4-6?冰箱保存备用,使用期不过30d。
高密度培养裂壶藻的方法
高密度培养裂壶藻的方法
1.准备培养基：将适量的碳源（如糖、淀粉等）、氮源（如硝酸盐、磷酸盐等）、微量元素（如钙、镁、锌等）混合溶解，加入适量的硫酸钠，调节pH值至7.0，加入适量的抗生素，搅拌均匀，即可得到培养基。
2.接种：将裂壶藻细胞悬浮液加入培养基中，搅拌均匀，放入培养箱，控制温度为25℃，光照强度为100μmol/m2/s，湿度为80%，接种后24小时即可观察到细胞的增殖。
3.培养：每隔24小时，将培养基更换一次，以保持培养基的新鲜，控制细胞的增殖，使细胞达到高密度。
4.收获：当细胞达到高密度时，可以将细胞收集，用离心机将细胞分离，然后用适当的消毒剂处理，即可得到高密度培养的裂壶藻细胞。
微藻大规模高密度培养技术
120
80
细胞密度(106/ml)
细胞密度 溶氧%
110 100 90 80
0 1 2 3 4 5
40 20 0
培养时间(d)
反应器优化条件下纤细角毛藻的培养
溶氧%
60
从图中可以看出，优化条件下纤细角毛藻 具有很高的生长速率，在 120 小时内细胞浓度 从接种时的205万/ml迅速增加到8100万/ml，为 开放式培养的40倍。生物量产量达到了1.13g/L， 生长周期也由通常所需的8天缩短为5天，成功 实现了纤细角毛藻的高密度培养。
方差分析表
方差来源 KH2PO4 Na2SiO3 NaNO3 NaHCO3 Vb1/Vb12 Qe 平方和 61.57 38.99 9.92 6.49 2.02 8.52 自由度 3 3 3 3 3 6 均方 20.52 13.00 3.31 2.16 0.67 1.42 F比 14.45 ** 9.15* 2.33 1.50 0.48
通气率对纤细角毛藻生长的影响
80
细胞密度(106 /ml)
70 60 50 40 20 21 22 23 24 25 26
培养温度(℃)
培养温度对纤细角毛藻生长影响
实验结果
• 光照强度对纤细角毛藻生长速率的影响高度显 著，通气率的影响显著。 • 纤细角毛藻在反应器中的优化培养条件为：光 强8mW/cm2﹑、通气量0.6vvm、培养温度23℃。
4 纤细角毛藻的光生物 反应器高密度培养
• 目的： 实现纤细角毛藻在光生物反应器中的高密 度培养 • 方法： 在PhR—L20C气升内环流光生物反应器采 用正交实验针对光照强度、培养温度、通气率 等因素进行培养条件优化。
PhR--L20C光生物反应
名词解释
鞭毛：生长在某些细菌表面的长丝状、波曲的蛋白质附属物，称为鞭毛，其数目为一至数十条，具有运动功能。
消毒：杀死病原微生物的措施。以防止传染病。
灭菌：杀死物体上所有微生物的措施。包括病原、非病原微生物。
商业灭菌：杀菌，从商品的需要出发对食品进行的灭菌。经处理后，按照一定的检验方法检不出活的微生物或者仅能检出极少数的非病原微生物，而且，它们在一定的保存期内不致引起食品变质腐败。
热（力致）死时间TDT：指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间。
D值：在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90%的活菌被杀死）时，所需要的时间。
Z值：在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）所需要升高的温度。
F值：在一定的基质中，其温度为121.1℃，加热杀死一定数量微生物所需要的时间。
二次生长：微生物在同时含有速效碳源（或氮源）和迟效碳源（或氮源）的培养基中生长时，微生物会首先利用速效碳源（或氮源）生长直到该速效碳源（或氮源）耗尽。然后经过短暂的停滞后，再利用迟效碳源（或氮源）重新开始生长。这种两相生长或应答称为二次生长。
感受态：能从周围环境中吸取DNA的一种生理状态。
准性生殖：指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。在该过程中染色体的交换和染色体的减少不象有性生殖那样有规律，而且也是不协调的。
烈性噬菌体：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环。
微生物高密度培养的研究概况
微生物高密度培养的研究概况刘元东;袁乐;余润兰【摘要】为了提高综合生产效率，减少资源浪费，高密度培养技术已成为目前发酵工程领域研究的热点问题之一，高密度培养技术能显著提高菌体浓度和产品产量，缩短生产周期、缩小反应器体积、减少设备投资，它已应用于几乎所有微生物的培养过程，使得发酵行业有了巨大的进步与发展，在节约资源和环境保护方面也作出了巨大贡献。
首先简单介绍了高密度培养技术的研究概况，综述了微生物高密度培养的限制性因素，分析了其优化策略，概括了高密度培养的方式及应用举例，同时对目前微生物高密度培养技术进行了展望。
%In order to improve the comprehensive productivity and reduce the waste of resource,high cell density cultivation (HCDC) has been one of current hot issues in researchof fermentation engineering .It can improve microbial biomass and product production substantially ,and also shorten the production cycle ,as well as reduce reactor volume and equipment investment.HCDC has been used in the cultivation process of almost all the microorganisms to benefit for the development of the fermentation industry and made great contribution to the aspect of resource conservation and environmental protection as well .An overview of HCDC of microorganisms was made to analyze its limitations and possible optimization strategies .Ways of HCDC and some applied examples were introduced to forecast the prospect of HCDC technology .【期刊名称】《有色金属科学与工程》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】5页(P76-80)【关键词】微生物;高密度培养;条件优化【作者】刘元东;袁乐;余润兰【作者单位】中南大学资源加工与生物工程学院，长沙 410083;中南大学资源加工与生物工程学院，长沙 410083;中南大学资源加工与生物工程学院，长沙410083【正文语种】中文【中图分类】Q93-335;TF18大部分的发酵产物都积累于菌体细胞内部，要获得高浓度产物，首先就要获得高细胞密度.20世纪90年代高密度培养技术已成为发酵工程领域研究的热点问题之一，随着市场经济不断发展，人们需求日益提高，高质量和短周期生产发酵剂行业迅速增加，以最低的成本消耗获得最高的细胞浓度及其产物收益成为目前整个生产发酵行业的关注焦点，因此关于高密度培养技术和工艺方面的研究越来越热.高密度培养技术最早用于酵母细胞培养提高生物量，利用烷烃或有机废水生产单细胞蛋白及乙醇[1].随着许多重要工业微生物的遗传背景和生理特性被逐渐认识，加上分子生物学技术和基因工程技术的不断发展和成熟，使微生物高密度培养技术在其它更多领域得到了更广泛的应用.1 高密度培养的概述高密度培养技术只是一个相对概念，能让菌体发酵密度较普通培养有显著提高的技术都可以称为高密度培养技术[2].但是由于培养过程中选择的菌种菌株不同，培养目标也存在较大的差异，因此高密度培养的最终菌体生物量也无法用一个确切的值或范围来界定，根据广义的概念来讲，凡是细胞密度比较高或以至接近其理论值的均可称为高细胞密度.在微生物培养过程中，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要因素，而高密度培养技术不仅能提高微生物的可培养性、增加菌体活性，而且可以提高单位体积培养液中菌体数量和代谢产物浓度、更高效利用营养物质、缩短生产周期、减少设备投资，从而降低成本，节约资源，减少污染，提高综合生产效率.2 微生物高密度培养的限制性因素及优化策略影响微生物高密度培养的因素有很多，主要包括：接种量、培养基组成、有害代谢产物的积累、培养条件等.2.1 接种量不同的接种量对菌体活性影响不同，从而影响菌体的适应能力和生长速率.在营养物质充足的条件下适当加大接种量能加快菌体生长，缩短达到最高菌体浓度所需的时间.胡爽等人研究发现，在200 L的发酵罐中，分别接种5%和10%的大肠杆菌，接种量为10%的最终菌浓度较5%的有显著提高[3].2.2 培养基普通微生物的培养基类型主要有3种：合成培养基、半合成培养基和复合型培养基.复合型培养基通常采用天然原料，其化学组成不明确且不可调控，因此不适合用于微生物的高密度培养.合成培养基的化学成分明确且质量稳定，适合于研究微生物基本代谢途径和探索代谢过程中物质变化规律，但是合成培养基营养较为单一，也不利于微生物的高密度培养.为了避免以上2种培养基的缺点，保持其优点，就出现了半合成培养基，半合成培养基是在合成培养基中添加少量天然营养物（如酵母粉、蛋白胨、氨基酸、无机盐等），这些天然物质能有效促进菌体细胞生长和代谢产物合成.半合成培养基更常用于微生物高密度培养.在微生物高密度培养过程中，充足的营养供给是微生物快速生长和代谢产物大量合成的基础，它为微生物的正常生长提供碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等基础物质，这些是微生物菌体生长繁殖以及合成代谢产物所必需的物质.但是当普通培养的体系中营养成分浓度过高时，菌体生长会受到明显抑制[4]，不利于微生物菌体积累.另外培养基各成分比例也要恰当，特别是碳氮比例.在分析营养源对大肠杆菌生长的影响时，文献[5-6]研究表明，碳氮比较低，在培养初期菌体自身生长繁殖旺盛，产生大量代谢废物，抑制菌体后期生长，甚至容易造成菌体提前衰老自溶；而碳氮比过高，菌体利用的营养物质主要用于合成积累代谢产物，菌体生长代谢缓慢.因此，需要根据培养微生物的生理特性来选择合适的营养组成物质和控制适当的物质浓度，这是解决限制高密度培养因素的重要策略之一.2.3 代谢产物分批培养微生物过程中，经过一定时间，细胞超过一定浓度时，菌体生长会变缓甚至停止.分析其生长曲线可知，微生物生长停止的一个主要原因就是代谢产物的积累.另外，有害副产物的出现也会严重影响菌体生长和产物形成.在大肠杆菌、乳酸菌等细菌的培养过程中，菌体利用葡萄糖产生代谢副产物如乙酸、乙醇和二氧化碳等，对菌体生长繁殖具有抑制作用[7].文献[8]研究表明，当乙酸浓度大于5 g/L时，大肠杆菌菌体生长缓慢，最大菌浓度下降；当其浓度超过14 g/L时，菌体停止生长.在微生物高密度培养过程中，可通过优化培养基组成、调整碳源种类和比例、维持较高的溶解氧等方式，来缓解代谢物积累带来的抑制作用.另外，目前也已经有研究通过代谢工程技术构造工程菌改变其代谢途径，从而阻止抑制物产生.比如有文献[9]提到，乙酸的分解代谢过程需要许多酶共同参与完成，而通常情况下，葡萄糖能够抑制这些酶的活性，所以在含有葡萄糖的培养基中高密度培养大肠杆菌等细菌时，这些乙酸分解酶都处于失活状态，使得乙酸积累，抑制微生物生长繁殖.因此，解除葡萄糖对乙酸分解酶的抑制就可以不断消耗乙酸，从而解除乙酸对菌体生长繁殖的抑制作用.文献[10]研究发现，某种突变菌株就能解除葡萄糖抑制作用，在消耗利用葡萄糖的同时不断地分解消耗代谢产生的乙酸.另外，采用降温、流加营养物或者透析等方法，可以有效降低抑制物质的产生.2.4 培养条件培养条件是影响菌体细胞生长繁殖的重要因素，它能影响菌体的生理生化特性，从而影响其高密度培养.在不同环境条件下，各种不同微生物在不同的培养阶段所需条件都是不同的，因此应该根据微生物生理特性、结合培养目标、充分分析并确定最佳的培养条件，以达到高细胞密度.2.4.1 温度温度对于微生物的影响很大，它不仅可以改变菌体内各种反应速率和蛋白质性质，而且能影响培养液的物理特性，从而影响菌体生长繁殖和代谢活动，同时，它能影响培养体系中各种物理参数特性，间接对菌体产生一定影响.在一定范围内温度升高时，细胞内的酶催化和化学反应速率都会加快，菌体生长也会加快，同时营养物和代谢物的溶解度提高，细胞膜流动性增大，有利于营养物质的吸收和代谢产物的排除.一般温度每升高10℃，生化反应速率会增加1倍.但是超过一定温度后继续升温，会使蛋白质和核酸等受到不可逆的损害，从而抑制菌体生长代谢甚至导致死亡.因此，通常采用121℃、20 min来灭菌，因为在121℃条件下几乎所有的微生物都已经死亡.最适宜温度并不是一个特定值，通常是一个范围区间，也不是一个菌种的特征性常数，它会随着培养基组成、培养条件、培养目标和菌体生长阶段的不同而改变.如，主要的浸矿菌氧化亚铁硫杆菌属于嗜热中温菌，其最适浸矿温度为30～35℃，而同样属于浸矿菌的高温嗜热菌金属硫化叶菌的最适宜浸矿温度为65℃[11].2.4.2 pH值稳定的pH值是菌体维持在最佳生长状态的必要条件.高密度培养过程中营养物质被分解利用和代谢产物形成积累，都会导致培养环境pH发生变化，改变营养物质分子的电离状态，影响微生物利用效率[12].另一方面，培养环境的pH变化会引起细胞内pH值改变，从而影响细胞内结构的状态和性质，最终对菌体生长代谢活动产生负面影响.因此，必须对培养基的pH条件进行控制，使其保持在一定的范围内.向培养体系中添加缓冲液提高缓冲能力能有效控制pH值的变化幅度，这样使得微生物处于最佳的生长繁殖状态，有利于积累大量菌体数量或产生目标代谢产物.另外，在微生物高密度培养过程中，也有人提出通过流加新鲜培养基来调节pH值，成功控制pH值范围.2.4.3 溶氧浓度溶氧浓度的高低能明显影响菌体生长、产物合成以及产物性质.在高密度培养过程中，菌体密度不断增大，耗氧量也随之加大，使得培养基中溶氧水平逐渐下降，造成供氧不足，不利于各种代谢活动，从而抑制菌体生长和产物生成.40%左右的溶氧水平最适合嗜酸氧化亚铁硫杆菌的高密度培养[13].但是氧是一种难溶气体，常温常压下纯水中的氧容量仅7 mg/L，因此在试验中常常会用摇床、发酵罐和通气设备等来增加溶氧[14].但是也有资料[15]曾报道在高密度培养重组大肠杆菌过程中，溶氧水平并不是越高越好，溶解氧高于10 mg/L时，菌体浓度和色氨酸合成酶活力存在降低趋势，从而对产物的形成造成不利影响.因此，需要根据不同微生物特性和培养目标来确定最佳溶氧浓度.3 高密度培养方式及其应用培养方式对菌体积累也有很大的影响.一般微生物高密度培养方式主要有：透析培养、细胞循环培养、补料分批培养等，其中补料分批培养研究最为成熟且应用最为广泛.3.1 透析培养现在的透析培养其实是一种“Nutrient-split”补料策略[16]，即将培养基分成2部分，一种是含有必须营养物的浓缩型培养液，另一种是基本只含用来平衡渗透压的无机盐溶液.同时培养器也分为培养室和透析室2部分.浓缩型培养液以分批或连续的方式加入培养室为微生物提供充足的营养物质，同时，半透膜能除去有害代谢产物，解除其积累带来的抑制作用；无机盐溶液则加入透析室以维持渗透压平衡. 透析培养能明显延长对数期的菌体增殖、增大稳定期的细胞积累、提高营养物的利用率，且在培养室中可获得密度较高且较为纯化的菌体以及高分子目标产物.文献[17]曾利用透析培养技术培养不同微生物（包括葡萄球菌，大肠杆菌，极端微生物等），细胞密度约为普通发酵方式的30倍.但是，透析培养反应器本身还需要透析组件及一些其他辅助装置，因此设备投资较大，操作技术要求较高.透析培养在生产方面一般用于营养要求严格、培养条件复杂的淋球菌的浓缩培养，以及培养哺乳动物细胞的悬浮液生产病毒、毒素和酶制剂等[18].近年，Baehr等[19]将此方式成功应用于实验研究，用透析式摇瓶小规模流加培养大肠杆菌BL21（DE3），发现培养过程中代谢副产物大幅度减少，产酸途径明显受抑制，较分批培养过程，目标产物产量提高约1 000倍，菌体浓度增加约200倍.3.2 细胞循环培养微生物培养过程中采用一定方式将细胞与培养液分开，无细胞的培养废液被转移出去，同时注入同样体积的新鲜培养基.细胞则加以循环利用，这种培养方式称为细胞循环培养.一般通过沉降、离心和膜过滤3种方式进行.该培养方式一般可用于食品工业中为牛奶、酸奶培养乳杆菌等，Sung等[20]用带有陶瓷过滤装置的发酵罐培养乳酸细菌柠檬明串珠菌，获得了OD660为75的菌体密度，高出分批培养约6倍，培养周期延长至105 h.除此之外，也有人将细胞循环培养方式应用于活细胞的培养，如Kang等[21]采用细胞循环培养方式培养苏云金芽孢杆菌孢子，获得了浓度为82.2 g/L的菌体生物量，较分批培养高出4倍，孢子含量在95%以上.3.3 补料分批培养以上2种培养方式都是采用补料策略，主要原则都是将代谢废物以不同的方式转移出去，消除其抑制作用，同时不断补加新鲜培养液，为微生物提供充足的养分，使细胞达到较高密度.补料分批培养[22]就是通常所说的流加培养，它是根据菌体实时生长情况和培养基特点动态调节补加新鲜营养液速度[23]，防止营养过剩给细胞生长带来抑制作用，使菌体生长及其目标产物生产的时间最大限度延长，数量最大限度增多.文献[24]研究发现，首先采用较稀的麦芽汁培养酵母菌，中途补充几次新鲜培养液，可以提高酵母产量，减少乙醇积累，这是最原始的补料技术.如今技术逐渐发展，应用日益深入，补料方式也得到了不断改进和丰富.其补料控制类型主要包括反馈控制和非反馈控制2种.反馈控制法是基于生理模型的，通过控制培养过程中菌体浓度、底物浓度、pH值、溶解氧浓度和CO2释放速率等生理参数来实现实时补料调节，但是根据微生物生长状况的反馈需要一定时间，对营养物流加控制具有一定的滞后性，因此培养过程中有可能会出现糖浓度的不稳定波动或者有害物质的积累.而非反馈控制策略是基于动力学模型的，设定固定参数按动力学模型流加培养液，常用的动力学模型主要有恒速流加、变速流加、间歇流加和指数流加.补料分批培养不仅能为微生物提供充足的养分，以维持细胞生长和产物形成处于最优化状态，进而使培养液中菌体浓度达到较高水平，而且能有效解除高浓度底物或代谢物的抑制作用，延长生产时间.比如酵母工业研究中，段学辉等[25]比较了普通分批培养和补料分批培养对酒精酵母细胞生长的影响，结果发现补料分批培养不仅有利于酒精酵母的快速生长，得到较高的菌体浓度，而且酵母的有效重复利用次数达4批次，培养44 h后，菌体浓度达到了71.82 g DCW/L，比分批培养提高了155.68%.补料分批培养过程中必须要确定最佳的补料策略[26]，即找出最佳的培养条件和最合适的补料方式，使菌体生长和产物产生始终处于最佳状态.补料策略的理论依据主要有格林原理、庞特里金最小值或最大值原理等，加上计算机技术的迅猛发展，也为补料分批培养的监测与控制提供了更精准有效的手段.目前补料分批培养的应用已经相当广泛，成功应用于高效生产有机酸、抗生素、维生素、氨基酸、酶制剂及生长激素等.如，分批培养高山被孢霉高产花生四烯酸需要很长的发酵时间，因为此菌体生长速率较慢，生长周期大约为7 d，Xiao-Jun Ji 等用分批补料培养策略将其周期缩短至5 d，花生四烯酸产量由0.9 g/（L·d）增加至 1.3 g/（L·d）[27].4 结束语我国发酵行业多数产品的技术经济指标都处于较低的水平，存在着产品分离纯化技术落后，高质量产品产量低、资源浪费、环境污染、成本高、代价大等问题.高效的培养技术和发酵技术为解决这些问题提供了可能性.高密度发酵技术既是生产高质量、高密度菌体和代谢产物的首要环节，也是菌体和代谢产物实现工业化生产的有力支撑，现已经逐渐成为了生化工程重要研究领域.而着重于研究优化微生物高密度培养的限制性条件，并且将高密度培养技术从实验室水平推广到工业化领域，从工程菌的培养推广至非工程菌的培养，这将是今后研究的重点.参考文献：[1]吴松刚．微生物工程[M].北京：科学出版社，2004．[2]刘子宇，李平兰，郑海涛，等．微生物高密度培养的研究进展[J].乳品加工，2005（12）：47-50.[3]胡爽，蔡海波，蒋加庆，等．重组大肠杆菌HT02高密度表达HT-1融合蛋白发酵过程优化[J]．化工学报，2009，60（12）：3063-3070.[4]Schaepe S，Kuprijanov A，Simutis R，et al．Avoiding overfeeding in high celldensity fed-batch culturesof E.coliduring the production of heterologous proteins[J]．Journal of Biotechnology，2014，192：146-153.[5]黎鸿平，黄海婵，钟卫鸿，等．大肠杆菌高密度培养研究进展[J]．化学与生物工程，2012，29（8）：1-5.[6]Dishisha T，Ibrahim MHA，Cavero V H，et al．Improved propionic acid production from glycerol：Combining cyclic batch and sequential batch fermentationswith optimal nutrient composition[J]．Bioresourse 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双歧杆菌高密度培养
从微生物的营养要素和外界条件方面设计一个能够达到双歧杆菌高密度培养的方法
（1）微生物生长的六大营养要素方面
碳源、氮源、能源、水、无机盐、生长因子是微生物生长所需的六大营养要素。
可以通过测量双歧杆菌生长代谢产物以及菌体的生长量来确定所需最佳六大营养要素，再通过正交分析法确定最佳六大营养要素之间的比例。
（2）微生物生长的外界条件方面
控制微生物生长的外界条件主要有温度、PH、溶氧、渗透压、光线等。
要使双歧杆菌达到高密度培养，可使温度控制在其最佳生长温度范围内，这可以通过在线菌体密度检测来确定。
由于双歧杆菌在发酵时会产生代谢产物乳酸而使培养基PH下降，双歧杆菌必须在近中性环境下才能正常生长，所以必须控制培养基的PH，主要控制方法有：向培养基中补加碱或碳酸钙，不断提出代谢产物或流加新鲜的培养基。
又由于双歧杆菌是厌氧菌，溶氧对双歧杆菌有毒害作用，所以可通过添加还原剂来控制。
微生物的高密度培养
How
1、选取最佳培养基成分和各成分含量 2、补料
3、提高溶解氧的浓度
多肽类药物：人生长激素、胰岛素、包细胞介素 类、人干扰素等
why
1、提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量） 2、减少培养容器的体积
3、培养基的消耗
4、提高下游工程中分离、提取的效率
5、缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本
下游工程（down-stream processing）：
下游工程指生化产品的分离纯化阶段的工作。
4、防止有害代谢What 2、Where 2、Why 3、How
what
高密度培养（high cell-density culture，HCDC)有 时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞 群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技 术。
where
现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌 生产多肽类药物中实践中逐步发展起来的
高密度培养名词解释
高密度培养名词解释高密度培养是一种新型的生物技术，它可以促进生物体内的生长和强化存活率。
这种技术通过改变细胞增殖环境来提高培养基中细胞的生长和存活率。
通过使用高密度培养，生物技术人员可以研究出更多的生物分子，从而推动农业技术的发展和改善人类的生活质量。
高密度培养的定义是指在细胞培养基中添加大量细胞，以达到增加细胞的数量、形态和活力的效果。
在细胞培养基中，有多种不同的营养素，这些营养素可以为细胞提供必要的营养和养分，促进细胞增殖。
它也可以控制细胞环境，以确保它们具有良好的生长和存活率。
高密度培养技术也可以应用于细胞表面工程，以促进细胞增殖和调节细胞活动。
在细胞表面工程中，微米级的物质可以被放置在细胞表面，从而改变细胞表面蛋白的表达，影响细胞的生长和存活率。
同时，细胞表面工程也可以调节细胞的代谢过程，从而影响细胞的活性和特性。
高密度培养技术有助于提高培养细胞的速度和灵敏度，在很大程度上提高了细胞的存活比率。
高密度培养还可以节约种子和细胞培养基的成本，从而降低实验过程中制备细胞培养基的成本。
在细胞培养过程中，它还可以提高培养基的吸收率，使细胞增殖所需的时间减少。
此外，高密度培养技术还可以应用于基因工程中，从而更有效地避免变异。
基因工程是一种利用生物技术改变特定基因的技术，通过改变特定基因，可以改变外在表现。
高密度培养可以帮助基因工程技术更有效地抑制基因变异，从而提高改造后细胞的生长和存活率。
总之，高密度培养是一种先进的生物技术，可以有效地提高细胞的生长和存活率，从而提高农业技术的发展和改善人类生活质量。
这种技术的开发和应用不仅可以提高生物分子的研究和开发能力，而且还可以改善人们的健康和生活品质，为人类谋取更多的福祉。
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来
2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。
通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。
在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。
目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。
分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。
产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。
但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。
因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。
现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。
表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。
微型生物高密度培养技术的研究与应用
微型生物高密度培养技术的研究与应用一、引言微型生物高密度培养技术是生物技术领域中的一项重要技术，其研究与应用旨在提高微型生物的生长速率和生产效率。
该技术已在许多领域中得到成功的应用，例如生产工业酶、生物柴油、生物医药等。
本文将阐述微型生物高密度培养技术的定义、研究现状、发展趋势以及在各领域的具体应用情况。
二、微型生物高密度培养技术的定义微型生物高密度培养技术是指通过优化微型生物在培养条件和生理过程方面的特点，使其在少量培养基或介质中快速繁殖，达到高密度培养的一种技术。
该技术对于大规模微生物发酵和生产具有广泛的应用前景。
三、微型生物高密度培养技术的研究现状1. 培养基优化技术培养基优化技术是微型生物高密度培养过程中的重要环节。
其目的在于提高微生物在培养基中的生长速度和生产效率。
常用的优化方法包括添加蛋白胨、糖、脂肪酸、无机盐等营养成分，以及优化pH值、温度、气体浓度等培养条件。
2. 发酵设备提高技术发酵设备提高技术是微型生物高密度培养的另一个重要环节。
常用的优化方法包括增强氧气传输效率、提高底部搅拌速率、优化发酵罐结构等。
3. 种属筛选技术种属筛选技术是指通过筛选不同的微型生物种属，挑选出生长速率快、生产效率高、适应环境广泛的微型生物菌种，以达到高密度培养的目的。
该技术的主要优化方向是挑选高效能、快速生长的工业微生物，并对其进行基因组学研究和代谢调控。
四、微型生物高密度培养技术的发展趋势目前，微型生物高密度培养技术在国内外研究中的发展趋势体现在以下四个方面：1. 发酵设备自动化生产化目前，微型生物高密度培养技术生产规模仍存在较大的局限性，主要原因是缺乏自动化发酵生产设备。
未来发酵设备自动化生产化将是微型生物高密度培养技术的发展方向。
2. 稳定发酵过程的控制技术稳定的发酵过程控制是微型生物高密度培养技术取得成功的重要因素之一。
因此，未来稳定发酵过程的控制技术将成为微型生物高密度培养技术发展的关键技术，与之相关的是自适应控制、神经网络控制、模型预测控制等技术的研究。
高密度培养芽孢杆菌的原理
高密度培养芽孢杆菌的原理
高密度培养芽孢杆菌的原理是通过提供合适的培养基、温度、氧气和营养物质等条件，优化菌株的生长环境，促进芽孢杆菌的繁殖。
以下是具体的原理：
1.培养基选择：根据芽孢杆菌的营养需求选择适宜的培养基，如富含植物提取物、蛋白质、氨基酸、有机酸等成分的培养基。
培养基的选择要充分考虑芽孢杆菌的特性和需求。
2.温度控制：芽孢杆菌一般能在较广泛的温度范围内生长，通常在30-37摄氏度之间。
高密度培养时，要选择适宜的温度，可以通过控制培养器的加热或冷却系统来调节温度。
3.氧气供应：芽孢杆菌属于厌氧菌，因此在高密度培养时，可以采用配制一定比例的厌氧气体来供应菌体。
比如，可以使用混合气体中的一氧化碳替代空气中的氧气供应。
4.营养物质供给：为了促进芽孢杆菌的生长和繁殖，需要添加适量的营养物质，如碳源、氮源、矿物盐等。
不同菌株对营养物质的要求可能有所不同，因此根据具体情况调整和优化培养基的配方。
5.优化发酵参数：通过调整培养器的搅拌速度、通气速度、pH值等参数，可以进一步优化芽孢杆菌的生长环境，提高培养效果。
这些参数的优化需要结合具体
条件和菌株特性进行调试和测试。
6.控制污染：在高密度培养过程中，要注意控制外界污染源，如细菌、真菌等的进入，保持培养环境卫生和无菌状态，以避免影响芽孢杆菌的生长和繁殖。
大肠杆菌高密度培养
大肠杆菌发酵罐高密度培养1.菌种活化冻干管活化：甘油保存管及生产斜面制作另述甘油管活化：取冷冻甘油管一支室温下融化，划线于平板（根据一月的生产计划），挑取数个或数十个单菌落划密之字线于生产斜面，37℃22-24h培养，将斜面包扎好置于4℃冰箱保藏。
2.摇瓶培养取两支斜面，加无菌水或生理盐水4ml，用接种环刮洗制成菌悬液备用。
每支菌悬液接两个三角瓶，4x200ml/1000ml 37℃ 200r/min 16-18h 3.种子罐培养25l/50l种子罐，500ml/500ml补料瓶(500ml/1000ml三角瓶)补料培养基：葡萄糖500g/l 蛋白胨80g/l 酵母膏50g/l MgSO48g/l PH7.5-7.8（灭菌前）灭菌温度 115℃ 30min3.1通气量：1-4h 1:0.5-0.6 4-6h 1:0.8-0.9 7-10h 1:1.03.2转速：1-3h 120-150r/min 4-10h 180-200r/min 罐压保持0.05mpa 3.3PH：20％NaOH溶液（酸碱瓶灭菌，溶液不灭）补加量一般350-500ml3.4消泡剂：添加量：泡敌（GPE聚醚型—聚氧乙烯氧丙烯甘油）0.01-0.02％豆油 0.10-0.15％宁少勿多。
3.5补料：补料时间及补料量：4-6h 55ml/h 165ml 7-10h 80ml/h 320ml 总计约485ml3.6移种与取样：一般对数期后期移种，平板培养结合镜检4.发酵罐培养300l/500l种子罐 10l/20l补料罐补料培养基同种子罐4.1通气量：1-4h 1:0.5-0.6 4-6h 1:0.8-0.9 7-12h 1:1.0 4.2转速：1-3h 120-150r/min 4-12h 180-200r/min 罐压保持0.05mpa 4.3 PH：20％NaOH溶液（酸碱瓶灭菌，溶液不灭）补加量一般 4-6L （90ml/150ml发酵罐培养8h补加160g/l的NaOH溶液4.0L）.4.4消泡剂：添加量：泡敌0.01-0.02％豆油 0.10-0.15％宁少勿多。
微生物高密度培养的研究进展
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!" 值
在高密度培养过程中 ! $% 值的变化是菌体产酸
或产碱等生化代谢反应的综合结果 ! 也是确定补料 速率的依据 ! 把两者紧密结合起来可以实现高密度 培 养 发 酵 过 程 的 优 化 $ 在 响 应 曲 面 法 $%&’()( 流 加 高密度培养模式中 ! 就是通过不断补料的方法 ! 成 功调节 $% 使菌体达到了高密度 $
!""" 高密度培养的概述
121
定义 高密度培养没有确切的定义 ! 是一个相对概念 ! 指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度 ! 使菌体密度较普通培养有显著的提高 ! 最终提高特 定产物的比生产率 " 用以描述的单位是干细胞重量 3
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乳 品 加 工
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表! 细菌
几种细菌的高密度培养研究 培养方式 培养时间 $& % 通 过 控 制 甲 醇 # HL 和 @K? 比率来进行补料培养 补料流加培养 总产量 O $>K E (天 % 参考文献
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微生物的快速生长的措施
首先, 微生物培养基及培养条件在高密度培养过程中占有很重要的地位。
培养基与产量系数和比生长速率之间存在直接关系, 高浓度的培养基成分对高密度培养有一定的抑制作用; 培养条件则与发酵过程中不同菌体的生理生化特性有关。
两者都是在高密度培养过程中基本和必需的优化手段。
其次, 充足的底物是高密度培养的基础, 培养过程中可以通过流加补料等方式补充菌体所耗费的营养物质。
其中低浓度氨水是常用的底物之一, 它不仅可以作为氮源的补给还可以调节培养液的pH 。
最后, 由于积累的代谢物明显抑制了菌体的生长, 所以必须去除代谢副产物、提高比生长速率。
如过量的碳源导致了代谢物的积累( Esch erich ia co li的代谢副产物是乙酸盐, Bacillu s su bt ilis 为丙酸盐) ,反过来这些代谢产物的积累同时也抑制菌体对碳源的利用。
总之, 解决菌体浓度低的方法有很多, 但必须结合工艺过程的整体特点, 全方位考虑才能使菌体浓度达到高密度( 详细论述见后) 。
培养基优化、补料策略、pH 值的选择以及代谢调控都是减少代谢产物形成并使菌体以最大生长率达到高密度培养的有效途径。
一、透析培养通过半透膜有效地去除培养室中有害的低分子量代谢产物, 同时向培养液提供充足的营养物质的培养方式称为透析培养。
采用这种培养方式, 不仅可以增加生物量的积累, 大大降低营养物质的损失; 与微滤和超滤相比,在透析过程中透析膜不会被阻塞, 并且可以很长时间维持其渗透性能。
但是, 由于反应器本身需要内嵌的透析膜或外在的透析组件、辅助泵及其它发酵罐等, 透析培养的设备投资较大。
二、细胞循环培养通过某种方式将细胞保留在培养罐中加以循环利用的培养方式就是细胞循环培养。
一般通过沉降、离心和膜过滤3 种方式进行。
膜过滤培养是连续培养和超滤的结合, 它是在普通培养装置上附加一套膜过滤系统, 用泵使培养液流过过滤器, 将菌体截留, 滤液流出培养体系, 并通过液面计控制流加泵添加新鲜的培养基, 维持培养基体积不变。
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微生物的高密度培养
定义一[1]
高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。
单位：细胞干重/升（DCW/L）。
凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。
定义二[2]
细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。
用途[1]
各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。
发展状况[2]
细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。
随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。
但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。
谷胱甘肽(GSH)的生产[3]
谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。
迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。
本研究室[4～6]近来深入研究了影响面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产GSH的各种重要因素,目前仍在进行有关高菌种选育、发酵过程优化和产物提取的研究工作。
构建具有高GSH合成活性的重组E.coli是近十年来GSH 生物合成研究中的一个新方向,其关键在于将分别编码GSHⅠ和GSHⅡ的基因gshⅠ和gshⅡ在宿主菌中高效表达。
重组或非重组的S.cerevisiae相比,重组E.coli具有生长速度更快、产物提取更容易等优点。
Murata等[7,8]通过在细胞中扩增gshⅠ和gshⅡ成功地获得了具有较强GSH合成能力的重组E.coli,但没有深入研究高细胞密度培养技术。
实际上,与其它胞内重组蛋白一样,GSH的体积生产率通常随着发酵液中的细胞密度增大而增加,故研究生产菌株的高密度培养方法,在保证GSH合成活性的前提下使反应器中工程菌的细胞密度尽可能高,不仅有利于提高生产率,也有利于后提取与纯化的进行。
本文报道高密度培养重组大肠杆菌生产GSH的研究结果。
1 材料与方法
1.1 试剂
谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)、还原型辅酶Ⅱ (NADPH)、5′-三磷酸腺苷( ATP)和DTNB (5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid))均为Sigma公司产品。
GSH 和GSSG购自华美生物工程公司。
酵母膏为Oxoid产品。
葡萄糖购自无锡润生淀粉油脂公司。
其余试剂均为国产分析纯。
1.2 菌种
重组大肠杆菌(Escherichia coli)WSH-KE1,gshⅠ和gshⅡ基因的拷贝数为2∶1,由韩国仁荷大学生物工程系提供。
1.3 主要发酵设备
上海HYG-Ⅱ回转式恒温调速摇瓶柜。
美国Virtis 2.5L实验用台式玻璃发酵罐,配备温度、pH自动控制系统、溶氧自动显示。
1.4 培养基
斜面培养基: (g /L)蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10,琼脂20,氨苄青霉0.05;pH=7.2。
种子培养基: (g /L)蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10,葡萄糖30;pH7.2。
发酵培养基: (g /L)葡萄糖10.0, KH2PO4 13.3,(NH4)2HPO4 4.0,MgSO4·7H2O 1.2,柠檬酸1.7;(mg /L)EDTA 8.4, CoCl2·6H2O 2.5,MnCl2·4H2O 15.0,CuCl2·2H2O 1.5, H3BO3 3.0, Na2MoO4·2H2O 2.5,Zn(CH3COO)2·2H2O 13.0,柠檬酸铁(Ⅲ)100.0,盐酸硫胺 4.5;消泡剂0.5ml(摇瓶不加);pH=7.2。
流加培养基:(g /L)葡萄糖600,MgSO4·7H2O 20.0; (mg /L) EDTA 13.0, CoCl2·6H2O 4.0,MnCl2·4H2O23.5, CuCl2·2H2O 2.5, H3BO35.0,Na2MoO4·2H2O4.0, Zn(CH3COO)2·2H2O 16.0,柠檬酸铁(Ⅲ) 40.0;消泡剂1.0ml,pH=7.2。
1.5 培养方法
1.5.1 摇瓶培养
菌种在斜面培养基上30℃培养24 h后,接入种子培养基(装液量25 ml/250 ml锥形瓶)。
30℃振荡培养24 h后,以10%接种量接入发酵培养基(装液量50 ml/500 ml锥形瓶),发酵时间如无特别注明均为24 h。
1.5.2 流加培养
2.5 L发酵罐中装液量1.0 L,接种量20% ,发酵温度30℃ ,通过调节搅拌转速和空气流速使溶氧百分数保持不低于30% ,当通空气无法满足溶氧要求时开始通纯氧。
通过流加氨水控制pH在7.2左右。
分批培养8h后,按不同实验要求进行流加培养。
葡萄糖浓度反馈控制流加:发酵过程中每隔0.5 h测定罐内葡萄糖浓度,根据罐内残糖浓度的高低来调节葡萄糖流加速率,以便将罐内葡萄糖浓度控制在很低的范围内。
恒速流加:以恒定的速率将流加培养基流加入发酵罐,流加速率可按实验要求变化。
指数流加:按指数流加模式[9]: Fi=_*V0X0exp (_*t)/Yx/s(SF-S)计算得出流加曲线,因无法连续改变进料量,故采用每1 h变化一次流加量的阶梯式进料方式。
1.6 分析方法
葡萄糖浓度和细胞干重:见文献[10]。
胞内GSH含量:按Murata[11]等报道的方法从大肠杆菌细胞内提取GSH,采用Tie-tze[12]的改良DTNB-GSSG循环分析法分析提取液中GSH含量。
参考文献
[1]刘子宇，李平兰，郑海涛，靳志强.微生物高密度培养的研究进展.中国乳业，2005
[2]齐士朋，徐尔尼，罗玉芬，巫小丹.细胞高密度培养技术的应用研究进展.南昌大学,2011
[3]李寅,陈坚,伦世仪.中国医药工业杂志,1999;01
[4]李寅,陈坚,周楠迪等.生物工程学报,1998;14(2)∶ 149
[5]李寅,陈坚,周楠迪等.中国医药工业杂志,1998;29(12)∶ 537
[6]周楠迪,李寅,陈坚等.生物技术,1997;7(4)∶ 30
[7]Murata K,KimuraA.Appl Environ Microbiol,1982;44∶ 1444
[8]MurataK,MiyaT,Gushima Het al. AgricBiol Chem,1983;47∶ 1381
[9]李寅,陈坚,宋祺等.生物工程学报,1997;13∶160
[10]LiY,ChenJ,Mao YY et al. Proceedings of 4th Asia-Pacific Bioche-mistryEngineering Conference,Beijing,1997∶ 431-434
[11]MurataK,Kimura A. J Gen Microbiol,1982;128∶ 1047
[12]TietzeF.Anal Biochem,1969;29∶ 502。