质谱技术在抗体药物分析中的应用

质谱技术在抗体药物分析中的应用

摘要：质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物

的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理，主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。一级结构的分析包括：精确

分子量的测定、抗体药物偶联比、肽指纹图谱等，高级结构的分析包括：氢/氘交换质谱、二硫键的分析等。质谱法相对于其他分析方法可以提供更为准确的数据，并可以得到多水平的分析结果。

关键词：抗体药物质谱一级结构高级结构

单克隆抗体药物的发展起源于1975年，Kohler 和Milstein 创立杂交瘤技术，

为大量制备鼠源单克隆抗体提供了技术条件，开创了大规模制备单克隆抗体时代。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，可以和靶抗原特异性结合，并且更

加安全有效，所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植

排斥等重大疾病上得到了快速的发展，是当前生物药物领域增长最快的一类药物。

[1]

1.抗体药物发展新趋势

在生物药物领域，抗体药物占据着越来越重要的地位，2015年全球销售排名

前10 位的药物中有6 个为抗体药物，分别是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin。抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。鼠源单克隆抗体是第一代的抗体药物，经过不

断改造过渡到全人源单抗。目前，FDA 批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和

全人源单抗数量已占据72%[2]

1.1抗体药物偶联物（ADC）

抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成，小分子

化合物通常是毒性很强的抗肿瘤小分子药物。通过抗体的靶向作用，ADC 的抗体

部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合，通过细胞内吞作用，将抗体和小分

子化合物一起带进肿瘤细胞内部，并在细胞内部发生水解反应，释放出小分子化

合物，从而杀死肿瘤细胞。[3]这样既可以降低小分子药物的毒性，同时具有靶向

结合的作用。已经上市的两个ADC是Kadyla和Adcetris。

1.2双特异性抗体（BsAb）

双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶

细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，现已成为

抗体工程领域的热点。由于基因工程的发展，目前双特异性抗体已经研发出多种

类型[4]，主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联

单链抗体(串联scFv) 、DVD-Ig 等多种形式。2014年第一个双特异性抗体Blinatumomab获FDA批准，靶向位点是CD19和CD3。

2.质谱技术

近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介

质辅助的激光解吸/离子化(matrix-assisted laser desorption/ionization.MALDI) [5]技术。另一种是电喷雾离子化（Electrospray ionization，ESI）[6]技术。由于这两种

电离技术的出现，使原本只能检测小分支的质谱技术，可以运用于检测生物大分子。

MALDI和ESI两种离子化方法都是软性离子化法，能够使生物大分子在离子

化过程中的保持完整性，分析灵敏度都极高，对低浓度的生物大分子样本也有很

好的检测效果。目前，高效液相色谱电喷雾质谱仪联用（HPLC-ESI-MS）及飞行时

间质谱仪(HPLC-ESI-TOF)联用已成为蛋白质组学实验中最常用的质谱技术。通过质

谱技术可以得到肽指纹图谱，并通过与二维电泳的联用分析蛋白质。现在这项技

术越来越多的应用于抗体药物分析中。与其它抗体方法相比，质谱分析具有准确

性高、灵敏度高、分析时间短和应用范围广的优势，但是由于质谱仪器高额的成

本限制了其发展。

在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征，而现在质谱技术越来

越多地运用于高级结构的分析，而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。

过去只有对于小分子药物，质谱可以进行定量分析，对于大分子蛋白只能够进行

定性分析，而现在生物质谱不断发展，现在已经可以进行半定量分析，相信在不

久的未来生物大分子的定量分析也可以实现。

3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用

3.1完整抗体药物精确分子量测定

当得到抗体药物时，可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分

子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测，可以对于抗体药物进行初步定性分析，并将可以作为药物常规放行的分析方法[7]。对于脱糖前的抗体药物进行分析，可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布[8]，对于快速了解生

产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。该方法可以对于样品的分子量进

行快速检测，适用于工艺过程样品的快速检定。

3.2药物抗体偶联比（DAR）

对于赖氨酸链接的抗体偶联药物，采用C4 色谱柱及联用的质谱对去糖基化

样品进行分析，根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目[9]。对于

半胱氨酸链接的抗体偶联药物，利用反相色谱( RP-HPLC) 串联质谱，测定药物抗

体偶联比(DAR) [10]。对于质谱测定的结果，不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值，更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况，及反应过程副产物空链接头

的分布情况。[11]该方法可以得到更为准确的小分子分布信息，和UV-DAR方法相比更为准确。

图1：抗体偶联物去卷积化前后图谱[9]

3.3肽指纹图谱

蛋白被特异酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗

体药物具有不同的氨基酸序列，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段也各不相同，

肽混合物的质量数医具有指纹特征[12]。可以通过LC-ESI-MS进行肽片段的一级质

量数的鉴定，也可以通过LC-ESI-MS/MS对于每个肽片段进行进一步确证，提高肽

指纹图谱的准确性。对于抗体药物，可以对于利用质谱对于特征的氨基酸序列进

行表征，定位在液相中的出峰时间，作为特征峰可以对于抗体药物进行有效的鉴别。该方法适用于终产品的放行鉴定，虽然检测时间比较长，但是对于样品的鉴

别比较全面而准确。

3.4翻译后修饰研究

蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于抗体药物的生物学功能十分重要。常见的

翻译后修饰有：磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N 端焦谷氨酸环化，C 端赖氨酸[13]切除等。一般特定的氨基酸的翻译后修饰，会给该氨基酸残基质量数的增加或者减少。如磷酸化会增加80Da；脱酰胺会减少1 Da等。因此，

只用质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差，可以实现高灵敏、高通量和高

精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。[14]利用质谱同时可以对每个位点的修