生化实验一 总糖和还原糖含量的测定

实验一总糖和还原糖含量的测定

（3,5－二硝基水杨酸法）

一、目的要求：

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:

在NaOH存在的条件下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色

三、试剂和器材

1、试剂

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即葡萄糖浓度为1.0mg/ml。

6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。

碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂。

2、材料

山芋淀粉

四、器材

723型分光光度计，分析天平，水浴锅，研钵，烧瓶，试管若干等。

五、操作

1、葡萄糖标准曲线制作

取干净试管6支，按表1进行操作。以吸光值为纵坐标，各标准溶液的浓度（mg∕ml）为横坐标作图得标准曲线。

管号

0 1 2 3 4 5

试剂

标准葡萄糖溶液∕ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水∕ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

DNS试剂∕ml 2 2 2 2 2 2

沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水∕ml 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 葡萄糖含量∕mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

A540nm0 0.051 0.110 0.150 0.205 0.253

2、样品中还原糖的提取与测定

准确称取0.5g山芋淀粉，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液转入三角烧瓶中。于50℃恒温水浴中保温0.5h，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到100ml离心管中，于4000r∕min下离心5min，沉淀用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100ml，混匀，作为还原糖待测液。取1ml进行还原糖含量测定。

3、样品总糖的水解及提取

准确称取0.5g山芋淀粉，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液转入三角烧瓶中。再向烧瓶中加入6mol/L HCl 10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解完毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液10ml 于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液。取1ml 总糖水解液，测定其还原糖含量。

六、结果处理

1、各浓度标准葡萄糖溶液按表1进行反应后，溶液吸光值见表1。以吸光值为纵坐标，各标准溶液的浓度（mg∕ml）为横坐标作图得标准曲线。如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

经分析得标准曲线回归方程为：y=0.2524x+0.0020，相关系数R2=0.9984。

2、还原糖溶液按照表1进行反应后，测定得到溶液于540nm处的吸光值为：A1=

将A1代入回归方程得c1=

还原糖（mg∕g）= （c1×100）∕m

=

3、总糖溶液按照表1进行反应后，测定得到溶液于540nm处的吸光值为：A2=

将A2代入回归方程得c2=

总糖（mg∕g）= （c2×1000×0.9）∕m

=

式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；

V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；

m──样品重量，g；

0.9──乘以0.9是为了从测定的总糖水解成单糖量中扣除水解时所消耗的水量。

注意事项

标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。

七、思考题

1. 简述3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的原理？

2. 本实验中盐酸、氢氧化钠和碘-碘化钾溶液的作用是什么？