三种方法冻存间充质干细胞存活率比较
保护干细胞质量的储存条件与方法介绍
保护干细胞质量的储存条件与方法介绍干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，其在组织再生、疾病治疗和药物研发等领域具有重要的应用前景。
而为了确保干细胞的质量和功能，正确的储存条件和方法是至关重要的。
本文将介绍保护干细胞质量的储存条件与方法。
一、干细胞的储存条件1.温度控制：干细胞的存储温度是至关重要的。
一般来说，干细胞的存储温度应在-80°C至-196°C的液氮温度范围内。
在这种低温下，细胞的新陈代谢会减慢，细胞的活力得以保持，从而延长干细胞的存活时间。
2.冷冻保护剂：在存储过程中，添加适当的冷冻保护剂可以保护细胞膜的完整性，减少细胞冻结时所受到的损伤。
常用的冷冻保护剂包括甘油、DMSO等。
3.无菌条件：在干细胞的储存和处理过程中，必须保持无菌条件，避免细胞受到细菌、真菌等微生物的污染，影响细胞的质量和功能。
4.低温运输：如果需要将干细胞从一个地方运输到另一个地方进行储存，必须采取低温运输措施，确保细胞在运输过程中的质量和活力。
二、干细胞的储存方法1.液氮冻存：液氮冻存是目前最常用的干细胞储存方法之一、在这种方法中，将细胞悬液加入到含有冷冻保护剂的冻存液中，然后迅速降温至-80°C以上，最后转移至液氮罐中进行长期保存。
2.低温冻存：除了液氮冻存外，还可以选择低温冻存的方法。
在这种方法中，将细胞悬液加入到含有冷冻保护剂的试管或冻存盒中，然后放置在-80°C或-196°C的冷冻箱中进行保存。
3.液氮气相冻存：这是一种较为高级的干细胞储存方法。
在这种方法中，将细胞悬液加入到装有液氮的气相罐中，细胞将在气相液氮中快速冻结，保持细胞的完整性。
4.冷冻干燥：冷冻干燥是一种将细胞在低温下冻结干燥的方法，能够有效保护细胞并延长其保存时间。
这种方法适用于需要长期保存的干细胞。
总的来说，保护干细胞质量的储存条件与方法对于干细胞的质量和功能至关重要。
正确选择合适的储存条件和方法可以保证干细胞的长期保存，并为后续的应用提供可靠的基础。
干细胞的保存与储存技术指南
干细胞的保存与储存技术指南干细胞作为一种具有自我更新和分化能力的细胞，被认为具有巨大的潜力在医学研究和治疗上发挥作用。
然而，干细胞的保存与储存也面临一些挑战，包括细胞损伤、冷冻过程引起的细胞死亡和质量变化等问题。
为了克服这些困难，科学家们开发了一些高效的保存与储存技术。
本文将为您介绍干细胞的保存与储存技术指南。
一、选择合适的保存和储存方法1. 冷冻保存：冷冻保存是最常用的干细胞保存方法之一。
在冷冻过程中，干细胞会处于低温状态，以减缓其新陈代谢并保持其活力。
选择合适的冷冻介质非常重要，例如细胞活存剂和冷冻保护剂等对保护细胞免受冷冻损伤非常关键。
此外，冷冻容器也需要是一次性使用，以避免细菌和污染物的引入。
2. 低温液氮冻存：低温液氮冻存是最常用的长期储存方法之一。
该方法能够将细胞保存在-196℃下，以延缓其老化和死亡。
但是，需要注意的是，在液氮中长期储存干细胞可能会使细胞产生野生变异。
因此，在储存前需要对细胞进行表型及基因突变的评估。
二、注意事项1. 规范操作：在保存和储存过程中，严格遵循标准操作程序和生物安全规范非常重要。
通过准确记录每个操作的细节，有助于日后的跟踪和管理。
2. 样品标识和记录：对每个保存和储存样品进行标识和记录，包括样品来源、保存日期、细胞类型和细胞状态等信息。
这些信息对于后续实验和使用非常关键。
3. 定期检测：定期检测储存的干细胞样品，以确保其品质和活力。
对于每个样品，可以进行细胞存活率、增殖能力和多能性等方面的检测。
三、其他保存与储存技术1. 非血清培养基：使用非血清培养基可以更好地保护干细胞的活力和增殖能力。
与传统的血清培养基相比，非血清培养基不仅能减少细胞突变的风险，还有助于减少细胞死亡和不适当的分化。
2. 超低温冷冻：超低温冷冻是一种保护细胞的高效方法，常用于保存干细胞时，就是通过降低环境温度至零下80摄氏度以下，以达到保护细胞并减缓其新陈代谢的目的。
这种方法不仅可以延长细胞的保存时间，还能降低冷冻对细胞活力的影响。
程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响
程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响章毅;陈侃俊;李萍;李冉;陈亮;陆薇;伍婷;金魏名【摘要】目的观察对比程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞深低温冻存效果的影响.方法分别采用程控降温法和二步法对3个批次的pMSCs进行液氮冻存,3个月后进行复苏,测定细胞存活率、活细胞数,观察体外培养1~4 d时的细胞形态,CCK8法进行细胞增殖检测,同时用流式细胞术鉴定细胞表面标记抗原,用油红O 染色、茜素红S染色和Masson染色进行细胞三向分化能力鉴定.结果程控降温法对比二步法冻存的细胞活率在冻存前、复苏后均无显著差异(P>0.05).倒置显微镜观察细胞形态,均在24 h时贴壁,呈短梭形,96 h时细胞密度达到95%左右,均匀铺满视野.增殖测定结果显示,培养第3~5天为两组细胞的对数生长期,第5天时增殖倍数达到最高,分别为第1天的6.44倍和6.29倍,经过短暂的平台期后进入衰亡期,增殖趋势一致;但分别在第4天(P<0.01)、第6天(P<0.05)和第7天(P<0.05)时,程控降温法冻存的细胞存活率极显著或显著高于二步法冻存的细胞.两种方法冻存细胞的表面标志性抗原CD73、CD90、CD105阳性细胞数百分比分别为99.85%、99.87%、96.45%和99.73%、99.73%、96.17%.诱导14 d后两组pMSCs均出现明显的成脂、成软骨、成骨细胞特性.结论采用程控降温法或二步法冻存pMSCs均能很好地维持细胞活力及生物特性,在条件允许情况下宜采用程控降温法,以获得增殖能力更好的种子细胞.%Objective To evaluate the effects of programmed or stepwise freezing on human placental mesenchymal stem cells (pMSCs). Methods Programmed or stepwise freezing was applied to three batches of pMSCs cryopreservation at -196℃ for three months. Cell viability and proliferation were measured through Trypan blue staining and CCK8 assay after being thawed and seeded, respectively. We furtherdetermined the characteristic antigenic markers of mesenchymal stem cells by flow cytometry. The adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of pMSCs were also tested by Oil red O, Alizarin red S and Masson staining, respectively. Results There was no significant difference with respect to the cell viability between programmed and stepwise freezing of pMSCs before or after being thawed (P> 0.05). Both groups of pMSCs adhered after 24 h culture, and reached about 95% density after 96 h. The pMSCs proliferation was in a logarithmic phase between 3 to 5 d cell culture and then reached to a declined phase. Cell viability of pMSCs cryopreserved by programmed freezing was significant higher than that by stepwise freezing at 4 d (P< 0.01), 6 d (P< 0.05) and 7 d (P< 0.05) culture. Moreover, both methods preserved the expression of antigenic markers and differentiating capacity of pMSCs. Conclusion The cell viability and biological characteristics of pMSCs can be maintained well by programmed method or stepwise cryopreservation. It is worth mentioning that the programmed cryopreservation method should be used to obtain the seed cells with better proliferation ability under permissible conditions.【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2017(012)006【总页数】7页(P513-519)【关键词】低温保存;胎盘间充质干细胞;程控降温法;二步法【作者】章毅;陈侃俊;李萍;李冉;陈亮;陆薇;伍婷;金魏名【作者单位】200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院;200051 上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司/中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团附属干细胞医院【正文语种】中文方法分别采用程控降温法和二步法对 3 个批次的pMSCs 进行液氮冻存，3 个月后进行复苏，测定细胞存活率、活细胞数，观察体外培养1 ～4 d 时的细胞形态，CCK8法进行细胞增殖检测，同时用流式细胞术鉴定细胞表面标记抗原，用油红 O 染色、茜素红 S 染色和 Masson 染色进行细胞三向分化能力鉴定。
实验项目三猪骨髓间充质干细胞的冻存
猪MSCs的冻存【1】来自:用猪骨髓间充质干细胞为供体生产猪的转基因胚胎细胞冻存液;L-DMEM+20%FBS+10%DMSO.【2】来自：版纳猪骨髓间充质干细胞体外培养最佳条件探索当细胞长满80%时用0.25%胰蛋白酶(trypsin,TN)消化（吸弃培养液，加入0.1MPBS洗，然后加入TN,加培养基）后，离心得到细胞沉淀，加冻存液（培养基：小牛血清：DMSO=7:2:1）。
冻存步骤-70℃过夜（用胶布或封口膜封冻存管口，纱布包若干层，软泡沫包裹，硬泡沫盒装，包布包），-152℃永久冻存（冻存管盒中置裸露冻存管）。
【3】来自：山羊骨髓间充质干细胞体外分离与培养细胞冻存液最佳选择：细胞冻存液分别为DMEM加5%、10%、15%的FBS和5%、10%、15%的DMSO.取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以1000r/min离心5min浓缩细胞，用冰浴的冻存液调整细胞浓度为1x107个/ml左右，充分混匀，分装冻存管，每管装0.8-1.0ml，用封口胶带封口，做上标记。
在4℃30min, -20℃60min，-40℃30min, -80℃过夜，最后放入液氮中。
细胞解冻时，取出一管细胞，在空气中停留5s再放入39℃的水中迅速搅动，待细胞冻存液全部溶化后，立即转到培养液中，离心三次去掉冻存液。
用培养液调整细胞密度为1-2x104个/ml.接种到底壁有方格的培养皿中，置于5%CO2，饱和湿度，37℃条件下培养。
培养24h后，在每个培养皿中随机选取10个方格，对每个方格中贴壁与未贴壁细胞进行计数，取平均值，计算细胞贴壁率，从而选择出最佳冻存液。
从表中得到最佳的冻存液为DMEM+10%FBS+10%DMSO或DMEM+15%FBS+10%DMSO. 【4】来自：胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离细胞冻存液：70%а-MEM+10%DMSO+20%NBS.取第1代开始进行细胞冻存。
人脐带间充质干细胞不同冻存方法探讨
殖 后 ，设 立 ４个 因素 和 ３个 水 平 ，分 为 ９个 实验 组 ，分 另ｑ观 察 不 同冻 存 条 件 下 对各 组 ＨＵＣ－ＭＳＣ 的 存 活 率 、回收 率 、免 疫 抗 原 ＣＤ３４
和 ＣＤ４４的影 响 。结 果 第 ９组 ＨＵＣ－ＭＳＣ 解 冻 复 苏后 ，其 存 活率 、回 收 率 以 及 免 疫 抗 原 ＣＤ４４积 分 值 均 高 于其 他 组 （Ｐ＜ Ｏ．Ｏ１），
关 键 词 ：间质 干 细胞 ； 连 续 传 代 ； 细 胞 培 养 技 术 ； 低 温保 存 ； 正 交试 验
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１２．１２．００３
文 献标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７３—４１３０（２０１２）１２—１４１４—０３
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｈｕｍ ａｎ ｕｍ ｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍ ｅｓｅｎｃｈｙｍ ａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ Ｌｉ Ｚｈｅｎｇｍ ｉｎ ，Ｇｏｎｇ Ｃｕｉｃｕｉ
国际检验医学杂志２０１２年 ６月第 墅鲞箜 塑 』 生 ！』 堡 ！ ：塑！ · 基 础 实 验 研 究 论 Nhomakorabea著 ·
人 脐 带 间充 质 干细胞 不 同冻存 方 法探 讨
李正 民 ，宫璀璀 （中 国人 民解放 军第一五 三 中心 医院检 验科 ，郑 州 ４５００４２）
摘 要 ：目 的 观 察 不 同 冻存 条 件 对 人 脐 带 间 充 质 干 细 胞 （ＨＵＣ—ＭＳＣ）冻 存 效 果 的影 响 。方 法 将 ＨＵＣ－ＭＳＣ 传 代 培 养 增
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｏ．１５３ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈ ｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｅｏｐｌｅ ｓ
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。
通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。
建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。
标签：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。
同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。
1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌處理。
1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank’s液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。
将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
3~5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。
1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
1.4 流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1×106个细胞，分别加入10μl单克隆抗体CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及阴性对照lgG1-PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次，室温300g，5min。
间充质干细胞储存标准
间充质干细胞储存标准
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）的储存标准通常涉及细胞采集、处理、冻存和贮存等多个方面。
以下是一些常见的MSCs储存标准的要点：
1.采集和处理：
•MSCs的采集应符合相关的伦理规范和法规。
•采集过程应该是无损伤的，以确保细胞的完整性。
•细胞的处理过程需要在无菌条件下进行，以防止污染。
2.冻存：
•MSCs在冻存前通常需要被处理成单细胞悬浮液。
•使用适当的冻存液，通常包括含有细胞保存剂（cryoprotectant）的冻存液，以防细胞在冷冻和解冻过程
中受到伤害。
•冷冻和解冻的速率也是关键因素，应根据具体细胞类型和冻存液进行优化。
3.储存条件：
•MSCs应该存储在液氮或超低温冰箱等极低温度的环境中。
•储存容器要求防止细胞污染和避免温度波动。
4.标签和追踪：
•对于每个储存样本，都应有唯一的标识符，以便进行追踪和管理。
•记录详细的储存信息，包括采集日期、处理过程、冻存日期等。
5.质量控制和监测：
•定期对储存的MSCs进行质量控制，包括细胞的形态、活性、纯度等指标。
•定期进行冻存样本的解冻和培养，以评估细胞的功能性和稳定性。
6.法规遵从：
•遵守相关的生物医学伦理规范和法规。
•确保储存过程符合当地和国际的标准，如Good Manufacturing Practice（GMP）。
这些标准和要点可能会因国家、地区和具体研究机构的不同而有所变化。
在进行MSCs的储存时，建议遵循最新的相关标准和指南，并根据具体实验室的条件进行适当的优化。
间充质干细胞运输要求
间充质干细胞运输要求
间充质干细胞是一种多能干细胞，具有广泛的应用前景。
然而，其在运输过程中可能会受到外界因素的影响而失去其活性和功能。
因此，在间充质干细胞的运输过程中，需要遵循以下要求：
1. 温度控制：间充质干细胞在运输过程中应保持在适宜的温度范围内，通常为2℃-8℃或-196℃（液氮保存）。
如果温度过高或过低，会导致细胞死亡或功能受损。
2. 包装保护：在运输过程中，间充质干细胞应该被妥善包装，以避免外界震动或碰撞等对细胞的损害。
3. 运输时间：间充质干细胞的运输时间应尽量缩短，通常不超过48小时。
4. 运输方式：间充质干细胞的运输方式包括陆运、海运和航空运输。
不同的运输方式对细胞的影响不同，应该根据实际情况选择最合适的运输方式。
5. 运输文档：在运输过程中，需要携带详细的运输文档，包括细胞种类、数量、质量检测结果等信息，以确保细胞在运输过程中得到充分保护。
遵循以上要求，可以有效保护间充质干细胞在运输过程中的完整性和活性，为其应用提供坚实的基础。
- 1 -。
冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响分析
冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响分析冷冻保存技术（Cryopreservation）对细胞存活率和功能恢复具有重要的影响。
在很多领域，包括医学研究，生物技术和生殖医学中，需要长期保存细胞样本或组织。
冷冻保存技术可以延长细胞的保存时间，但同时会对细胞造成一定程度的损伤。
本文将对冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响进行分析。
首先，冷冻保存技术对细胞存活率的影响是关键的。
当细胞被冷冻保存时，细胞内的水分会在冷冻过程中形成冰晶，这可能导致细胞脱水和细胞器的破坏。
为了尽量减少这些损伤，科学家们已经开发了各种冷冻保护剂，如甘油和二甲亚砜（DMSO），用于保护细胞免受冻结所引起的细胞脱水和冰晶形成。
这些保护剂可以在冷冻过程中起到稳定细胞膜和细胞内结构的作用，从而提高细胞的存活率。
此外，科学家们还不断改进冷冻的速度和方法，例如快速冷冻（快速冷却）和慢速冷冻，以进一步提高细胞存活率。
其次，冷冻保存技术对细胞的功能恢复也有影响。
在冷冻过程中，细胞内部的生物化学反应速度大大降低，细胞代谢活动几乎停止。
这可能导致细胞内重要蛋白质、酶和其他生物分子的结构和功能发生改变，使细胞在解冻后难以正常运作。
此外，冷冻保存过程中的细胞脱水和冰晶形成也可能导致细胞器的破坏，进一步影响细胞的功能。
然而，通过合适的解冻过程和适当的培养条件，可以促进冷冻保存后细胞的功能恢复。
例如，逐渐将细胞从低温解冻到正常温度，并提供适当的培养基和营养物质，有助于细胞逐渐恢复其正常的代谢活动和功能。
此外，不同类型的细胞对冷冻保存技术的影响可能有所不同。
某些类型的细胞，如干细胞和胚胎细胞，对冷冻保存更为敏感。
冷冻保存过程中可能导致干细胞或胚胎细胞的分化能力下降，细胞的干细胞特性丧失。
因此，在冷冻保存这些类型的细胞时，需要更加精细的处理和保护措施，以确保其存活率和功能的恢复。
另外，冷冻保存技术在不同研究领域和应用中也有一些局限性。
有些细胞或组织不适合冷冻保存，因为其细胞膜不耐受冷冻过程所引起的损伤。
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
治疗用脐带间充质干细胞冷藏保存时间对细胞活性的影响
治疗用脐带间充质干细胞冷藏保存时间对细胞活性的影响闫姗姗;李一佳;陈曦;刘丽君【摘要】背景:随着对间充质干细胞基础研究和临床研究的不断深入,其应用范围越来越广.但在间充质干细胞的临床应用中,缺乏暂时储存条件及回输时间的相关研究报道.目的:探索脐带间充质干细胞制备完成后暂存时间对于细胞质量和细胞活性的影响.方法:取冷冻复苏的脐带间充质干细胞和未冷冻的脐带间充质干细胞,放置0-4 ℃储存0,6,12,24 h后分别检测活细胞率、细胞倍增时间、细胞克隆形成率.结果与结论:①未经过冻存的脐带间充质干细胞能在0-4 ℃条件下储存时间较长,储存12 h后细胞开始死亡,细胞活力开始下降;②冷冻复苏的脐带间充质干细胞在0-4 ℃储存时间较短,储存6 h后细胞即开始死亡,细胞活力减弱;③结果表明,脐带间充质干细胞制备完成后应保证在6 h或12 h之内回输,以确保最佳的治疗效果.如果运输距离较长,应优先选用未冻存的间充质干细胞.%BACKGROUND: With the in-depth basic research and clinical research on mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cells have wide clinical prospects. However, little is reported on the temporary storage conditions and refusion time of mesenchymal stem cells. OBJECTIVE: To explore the effect of cold storage time on the cell mass and viability of umbilical cord mesenchymal stem cells.METHODS: Frozen-thawed and unfrozen umbilical cord mesenchymal stem cells were prepared and stored at 0-4 ℃. The cell viable cell rate, cell doubling time and colony forming efficiency were detected after 0, 6, 12, and 24 hours. RESULTS AND CONCLUSION: Unfrozen cells could maintain the cell biological activity at 0-4 ℃until dead cells appeared with the presence of decreased cell viability at 12 hours after storage. Frozen-thawed cells were unable to be stored at 0-4 ℃ for a long time, and cells began to die and the cell viability was weakened at 6 hours after storage. These findings indicate that umbilical cord mesenchymal stem cells should be injected into patients within 6 or 12 hours after preparation, to ensure the best therapeutic effects. If there is a longer transport distance, it is preferred to use unfrozen mesenchymal stem cells.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)005【总页数】6页(P748-753)【关键词】干细胞;细胞治疗;间充质干细胞;脐带;存储时间;细胞活性【作者】闫姗姗;李一佳;陈曦;刘丽君【作者单位】云南舜喜再生医学工程有限公司,云南省昆明市 650106;云南舜喜再生医学工程有限公司,云南省昆明市 650106;云南舜喜再生医学工程有限公司,云南省昆明市 650106;云南舜喜再生医学工程有限公司,云南省昆明市 650106【正文语种】中文【中图分类】R349.20 引言 Introduction干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在适宜的体外培养条件下能够稳定增殖并保持干性[1-2]，且便于体外操作，是用于细胞替代治疗的理想种子细胞[3-4]。
不同人羊膜间充质干细胞冻存液冻存细胞效果比较
Preli m inary study on cryop reservation of human amniotic mesenchymal stem cells
YAN G D ongbin, SON G L a ijun, YAN G B o, L I X iangsheng D epa rtm en t of N eu rosu rgery, the F irst A ffilia ted Hospita l, Z hengzhou U n iversity, Z hengzhou 450052
郑州大学学报 (医学版 ) 2009年 5月 第 44卷 第 3期
化等 。 综上所述 ,胰岛素预处理能够上调神经元 GAP2
43、BDNF蛋白的表达 ,并通过抑制细胞凋亡 ,改善 OGD /R对神经细胞的损伤 。随着进一步的深入研 究 ,胰岛素有望成为治疗缺血性脑卒中经济有效的 药物 。
参考文献
[ 1 ] Zhu CZ, Auer RN. Op timal blood glucose levels while u2 sing insulin to m inim ize the size of infarction in focal cere2 bral ischem ia [ J ]. J Neurosury, 2004, 101 (4) : 664
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冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较
导师 ，新疆 医科大学第一
背景 ：低温冻存脐带间充质干细胞已成为研究热点，但关于冻存后其造血支持能力变化的报道甚少。 目的 ：比较冷 冻 前后 脐带 间充 质 干细 胞体 外支 持成 人骨髓 单 个核 细胞 造血 集 落生 成 的能力 。 方法 ：分 别将 冷冻 前后 的人 脐 带 间充质 干细 胞和 人骨 髓来 源 的间 充质 干细 胞培 养至 第 ３代 ，经 ２ ． ５ ｇ ／ Ｌ丝裂 霉
摘 要
篓 实 墓 验 磊 的 篙 特 点 嚣 在 于 薹 进 行 了 骨 髓 单 个 核 细 胞 和 蓠 冷 冻 前 后 的 人 脐 带 间 充 质 干 细 胞 长 期 共 培 养 ， 对 造 血 干 ， 祖 细誊 细 芋 吐 … 莲 爹 三 ： 至
要从事造血干细胞移植、
Ｈｕ ｍａ ｎ ｕ ｍｂ ｉ ｌ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｏ ｒ ｄ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ： Ｃｏ ｍｐ ａ ｒ ｉ ｓ ｏｎ ｏ ｆ ｈ ｅ ｍａ ｔ ｏｐ ｏｉ ｅ ｓ ｉ ｓ ｓｕｐｐｏｒ ｔ ｉ ｎｇ ｃａ ｐａｃｉ ｔ ｙ ｂｅ ｆ ｏｒ ｅ ａｎｄ ａ ｆ ｔ ｅｒ ｃｒ ｙｏｐｒ ｅｓ ｅｒ ｖ ａｔ ｉ ｏｎ
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常指萍 马艳 ， 毕晓娟。 宋丽婿・ 段显琳， 江萌． 冷冻前后脐 繁溺充质 干细胞造盘支持能力的 跣较【 ｊ １ ． 中国组织Ｉ程 碍究． ２ ０ １ ３ ． １ ７ （ ３ ２ ） ： ５ ７ ６ ５ － ５ ７ ７ １
脐带间充质干细胞制备存储标准
脐带间充质干细胞制备存储标准脐带间充质干细胞（Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells，WJ-MSCs）是一种来源于脐带的多潜能干细胞，具有广泛的临床应用前景。
为了确保脐带间充质干细胞的制备和存储质量，制定脐带间充质干细胞制备存储标准非常重要。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准应包括以下几个方面：1.取材标准：脐带是脐带间充质干细胞的主要来源，因此在制备和存储过程中需要确保脐带的质量。
取材时，应确保脐带来自经过筛选和检测的健康母亲，脐带的无菌处理应符合相关规定。
2.分离和培养标准：脐带间充质干细胞的分离和培养是制备过程中的关键步骤。
应采用符合相关规定的分离和培养方法，确保脐带间充质干细胞能够获得最佳生长和增殖环境。
3.鉴定标准：在制备过程中，需要对脐带间充质干细胞进行鉴定。
鉴定标准可以包括表面标记物的检测、多向分化潜能的检测等指标，以确保制备的细胞具有干细胞的特性。
4.冻存标准：为了确保脐带间充质干细胞的长期保存，应采用合适的冻存方法和条件。
冻存标准可以包括冷冻液的选择、冷冻速率的控制、冷冻样品的保存温度等指标。
5.质量控制标准：脐带间充质干细胞的制备和存储过程中应进行严格的质量控制。
质量控制标准可以包括细胞数目的检测、细胞活力的检测、无菌检测等项目，以确保制备的细胞符合质量要求。
在制定脐带间充质干细胞制备存储标准时，需要参考国内外相关的法规和标准。
同时，制定标准时需要考虑到国内的实际情况和相关研究的最新进展。
制定标准应充分结合实际情况和科学研究，确保标准的可行性和科学性。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准对于保证脐带间充质干细胞的质量和应用的安全性具有重要意义。
符合标准的脐带间充质干细胞可以应用于临床医学领域，对于治疗一些疾病和促进组织再生具有重要的作用。
因此，制定脐带间充质干细胞制备存储标准是当务之急，对于推动相关领域的研究和应用具有重要的意义。
体外培养、冻存及复苏对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
１ １ 实验动物与试剂 ．
原体级 Ｗｉ ｒ 鼠， ｓ 大 ｍ 雌雄 不拘 ， １０～１０ｇ 由广 重 ２ ５ ，
东省 实验动 物 中心提供 。二 甲基亚砜 （ ＭＳ ， 蛋 Ｄ Ｏ）胰 白酶 ，ｅｃｌ淋 巴细 胞 分 离 液 ， Ｍ Ｍ Ｆ２培 养基 ， Ｐｒｏ ｌ Ｄ Ｅ ／１
骨髓间充质干细胞 （ Ｓ ｓ 具有 自我增殖、 向 ＭＣ） 多 分化的潜能。Ｍ Ｃ 在体外长期培养易发生 自发 分 Ｓｓ
１３ Ｍ Ｃ 的冻存及复苏 ． Ｓ ｓ
取第 ３ Ｍ Ｃ 用于冻 代 Ｓｓ
存， 冻存前 ２ 细胞换液。冻存时， ４ｈ 将细胞消化后计 数， 用适量的已预冷至 ４℃的冻存液（ ２ ％胎牛血 含 ０
１４ Ｍ Ｃ 增殖能力的检测 ． Ｓ ｓ
对未冻存及冻存复苏
传至第 ５ 的 Ｍ Ｃ ， １ １ ｍ 接种 于 ９ 孔板 代 Ｓ ｓ 以 × ０／ ｌ ６
中 ， 孔 １０ １置 ５ Ｃ ２３ Ｃ、 和湿 度 的细胞 每 ０ ， ％ Ｏ 、７ ｏ 饱 孵 箱 中培养 。每组 ３ 细胞 ， 天 相 同时 间每 组 各 ５孔 每
维普资讯
山东 医药 ２ ０ 第 ４ 第 ６期 ０ ８年 ８卷
体 外 培养 、 存 及 复 苏对 大 鼠骨髓 间充 质 冻 干 细 胞 生物 学特 性 的影 响
付霞霏， 何援 利
（ 南方 医科 大 学珠 江 医院 ， 东广 州 ５０ ８ ） 广 １２ ０
表达及 细胞周期特性。结果 ： 原代 Ｍ Ｃ ２ｈ Ｓｓ 贴壁 ， ７ 呈梭形 ， 呈集落样生长 ； 传代后 ， 细胞变 为形 态均一
排列有序
的成纤 维细胞样 。冻存 ＭＳ ｓ Ｃ 复苏后存活率为 ８ ．％ 。冻存 ＭＳ ｓ ６５ Ｃ 与未冻存 ＭＳ ｓ比较 ， Ｃ 增殖能力 、 细胞表面标记 及 细胞周期无 明显变化。认为密度梯 度离心法结合贴壁法可以获得 比较 纯的 Ｍ Ｃ ， Ｓ ｓ采用液氮冻存 大鼠 ＭＳ ｓ Ｃ 不改 变其增殖能力及生物学特性。 ［ 关键词 ］ 干细胞 ； 细胞培养 ； 冻保存 冷 ［ 中图分类号］ Ｒ １ ．２ ３ ８５ ［ 文献标识码 ］ Ｂ ［ 文章编号 ］ １０ －６ Ｘ（０ ８ ０ －０ ８ ３ ０ ２２ ６ ２０ ）６０ ３ － ０
干细胞存储知识点总结
干细胞存储知识点总结干细胞是一种具有自我更新和分化能力的特殊细胞，它们可以分化成不同类型的细胞，在组织修复和再生过程中发挥着重要的作用。
干细胞的存储就是将干细胞保存起来，以备将来可能的医疗应用。
干细胞存储的基本原理是通过冷冻和保存技术将干细胞保存在液氮中，以确保它们在未来可以使用时仍能保持其自我更新和分化能力。
干细胞存储主要有两种方式，一种是将干细胞保存在胚胎中，称为胚胎干细胞存储；另一种是将成人体内的干细胞采集出来并保存起来，称为成体干细胞存储。
胚胎干细胞存储是通过在体外受精过程中获得胚胎，然后从胚胎中提取干细胞并进行保存。
这种方式可以获得具有较强分化能力的干细胞，但由于涉及到胚胎的使用，存在着伦理道德等问题。
另外，由于存储胚胎干细胞需要符合一定的法律法规和伦理标准，因此胚胎干细胞存储在一些国家和地区并不合法。
成体干细胞存储是通过采集成人体内的干细胞，并将其保存在液氮中。
这种方式不涉及胚胎的使用，因此不会引起伦理道德问题，也更加符合法律法规和伦理标准。
成体干细胞存储主要包括脐带血干细胞存储和体细胞干细胞存储两种方式。
脐带血干细胞存储是通过在新生儿出生后采集其脐带血，并从中提取干细胞进行保存。
脐带血干细胞具有较强的自我更新和分化能力，可以应用于治疗多种疾病，如血液系统疾病、免疫系统疾病和遗传性疾病等。
目前，脐带血干细胞存储已经成为了一种越来越受欢迎的干细胞存储方式。
体细胞干细胞存储是通过采集成人体内的干细胞，并进行保存。
这种方式可以采集到多种类型的干细胞，如脂肪干细胞、骨髓干细胞、间充质干细胞等。
这些干细胞具有一定的自我更新和分化能力，可以用于治疗多种疾病，如心脏病、神经系统疾病、骨科疾病等。
体细胞干细胞存储的方法相对胚胎干细胞存储是最早期被广泛研究和应用的干细胞存储方式，因为胚胎干细胞具有较高的自我更新和分化能力，可以分化成多种细胞类型。
然而，由于胚胎的使用存在伦理道德问题，使得这种方式并不适用于所有人。
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三种方法冻存间充质干细胞存活率的比较【中图分类号】r394.2【文献标识码】b【文章编号】1008-6455（2011）04-0373-02
近年来，掀起干细胞研究和应用的热潮，尤其是msc已经广泛应用于临床各种疾病的治疗。
因而，msc的冷冻保存及其复苏后的存活对干细胞的临床应用尤为重要。
本文对三种冻存方法进行了对比，以寻求msc较佳的冻存方法。
1 材料与试剂
1.1 材料：健康供者胎儿脐带，肝炎病毒标志物、梅毒、hiv检测均阴性。
经医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂与仪器:α-mem培养基（hyclone 公司）胰蛋白酶（gibco公司）优等胎牛血清（fbs） hyclone，细胞培养瓶（美国corning）二氧化碳培养箱（美国thermo 371型）倒置显微镜（日本olympus）程序降温盒（美国 nalgene）dmso（sigma）, 冻存管（corning）。
2 方法
2.1 脐带源msc的分离培养:采用本实验建立的脐带源间充质干细胞分离培养方法[1]。
无菌取足月剖宫产健康胎儿脐带,采集后6h
内处理。
用加双抗的pbs洗涤至无血迹变白，去除血管后剪成小片并进一步剪碎成泥状后转入50ml离心管中，加pbs，1200rpm，10min，洗涤3遍。
洗涤完毕将沉淀用少量培养基浸润混匀后，种到培养皿
中于5% co2培养箱内培养。
48h首次换液，以后每隔2-3天换液，待细胞长满皿底，此时用pbs 冲掉组织块，胰酶消化贴壁细胞，进行传代，种到培养瓶内于5% co2培养箱继续培养并传代。
倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况，并适时照相。
2.2 冻存实验:收集生长良好的p5代细胞[2]（文献资料表明，临床试验用干细胞为p5左右），取少量细胞悬浮液（约 0.1 ml）计数细胞浓度及冻前存活率，其余细胞加入预先配置好预冷的冻存液中（含有 10% 二甲基亚砜（dmso）和 30% 胎牛血清的新鲜α-mem 培养基），分装入1.5ml 无菌塑料冷冻保存管, 以每冻存管5×106 个细胞为单位，冻存分三组。
每组21管：
组1 4℃ 10分钟 -20℃ 30分钟-80 ℃24小时后转液氮。
组2 4℃ 30分钟 -20℃ 1小时 -80 ℃24小时后转液氮。
组3 nalgene程序降温盒冷冻法将程序降温盒预先4℃预冷6小时以上，将冻存管放入盒中立即放入-80 ℃低温冰箱， 24小时后转液氮。
2.3 复苏细胞:分别于冻存3个月每组复苏7管，6个月每组复苏7管，12个月每组复苏7管，38℃水浴，1-2分钟内快速溶解细胞后用pbs洗涤两遍，用台盼蓝染色计数细胞复苏存活率并种到培养瓶中继续培养。
3 结果
3.1 脐带组织细胞贴壁生长，第10d已有较多细胞爬出并倍增，第
13d可爬满皿底，呈旋涡状，放射状均匀生长（见图1）。
传代细胞3-5天长满。
3.2 冻存后复苏存活率：从下图中数据可看出组3细胞存活率明显高于其他两组。
组内不同月份复苏细胞存活率无明显差别。
见表1 3.3 复苏后细胞接种培养瓶后，组1，组2平均四天长满，组3平均三天长满，形态与冻存前无明显差异。
表1
4 讨论
利用干细胞的再生和分泌多种细胞因子的能力治疗各种疾病已经被广泛应用，而且要求干细胞移植数量也逐渐增加。
从原代提取到培养出够一定移植数量的干细胞需一个月的时间，所以需要简便，稳定的方法冻存干细胞以便随时复苏足够量的干细胞供移植应用[3]。
细胞储存在-80℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
细胞冻存的关键是如何通过冰点而不受损伤，所以我们加入了冷冻保护剂dmso，可使溶液冰点降低，细胞内水分透出，减少了冰晶形成。
另外，冻存后细胞存活率还跟降温速度有很大关系[4]。
本实验数据表明，传统的冻存方法-4℃10分钟，-20℃30分钟或4℃30分钟，-20℃1小时再-80℃冻存细胞存活率在80%以下，而利用美国nalgene程序降温盒冻存脐带源间充质干细胞后再转入液氮，复苏存活率在90%以上，明显高于传统方法。
程控降温仪冻存细胞是国际上公认的高存
活率的稳定的方法，但仪器本身价格昂贵，操作技术要求高，不能普及应用。
程序降温盒夹层内装有异丙醇，降温速率1 ℃／min，由于细胞存活率高，复苏后接种培养能快速长满，操作简便。
本实验室自2009年末至今一直采用此种方法冻存间充质干细胞，冻存效果稳定。
参考文献
[1] 毕薇薇，郭立斌，李志刚.人脐带源间充质干细胞的培养及生物学性状。
中国现代医学杂志，2009，19（10）：1511-1513
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