酶联免疫吸附试验ELISA操作注意事项课件
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ELISA检测技术ppt课件
优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。
——需制备各种酶标抗原或抗体。
.
11
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分
为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液
和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检
样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形
成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗
原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色
.
2
ELISA的发展概况
自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免 疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检 测方法之一。
.
5
酶标板
.
6
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
酶联免疫吸附分析PPT课件
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶 联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 根据颜色反应的程度进行
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保 留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶 联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性， 当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶的 相应底物， 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈 颜色。
ELISA原理
其所生成的颜色深浅与欲测 的抗原（抗体）含量成正比。
酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色反 测定波 应
橘红色 492 黄色 460 棕色 449 兰色 425 蓝绿色 642
黄色 红色 黄色 深蓝色
荧光
黄色
400 500 405 420 360,450
420
ELISA的种类和变化 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。
该抗原的定性或定量测定 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。 因此，加入底物后显色反应较弱。 4、加样
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检测 抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标 记的抗抗体以检测 已与固相抗原结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保 留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶 联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性， 当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶的 相应底物， 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈 颜色。
ELISA原理
其所生成的颜色深浅与欲测 的抗原（抗体）含量成正比。
酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色反 测定波 应
橘红色 492 黄色 460 棕色 449 兰色 425 蓝绿色 642
黄色 红色 黄色 深蓝色
荧光
黄色
400 500 405 420 360,450
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ELISA的种类和变化 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。
该抗原的定性或定量测定 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。 因此，加入底物后显色反应较弱。 4、加样
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检测 抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标 记的抗抗体以检测 已与固相抗原结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
elisa检测技术 ppt课件 共25页
优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果判定 (空孔调零)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准)
加板 (阴、阳、标准、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物：
1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为
谢谢！
xiexie!
ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果判定 (空孔调零)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准)
加板 (阴、阳、标准、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物：
1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为
谢谢！
xiexie!
ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。
酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)
（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
ELISA技术要点及质量管理PPT课件
原理
ELISA技术利用抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体结合，再加入酶标记的 抗原或抗体，通过酶催化底物显色反应，实现对目标分子的检测。
ELISA技术的分类和应用
01 间接ELISA
02 夹心ELISA
03 竞争ELISA
04 重组ELISA
05 应用
用于检测抗体，将抗原吸 附在固相载体上，然后加 入待测血清，最后加入酶 标记的二抗，通过底物显 色反应检测抗体。
1 2
自动化与智能化
随着技术的发展，ELISA技术将进一步实现自动 化和智能化，提高检测效率和准确性。
多指标并行检测
未来ELISA技术将朝着多指标并行检测的方向发 展，能够同时检测多种指标，提高检测效率。
3
纳米技术与ELISA的结合
纳米技术将为ELISA技术带来新的突破，如纳米 探针、纳米酶等，提高检测灵敏度和特异性。
ELISA技术在食品安全检测中的应用实例
农药残留检测
ELISA技术可用于检测食品 中的农药残留，确保食品 的安全性。
兽药残留检测
ELISA技术可用于检测肉类、 禽蛋等食品中的兽药残留， 保障消费者的健康。
生物毒素检测
ELISA技术可用于检测食品 中的生物毒素，如细菌毒 素、真菌毒素等。
ELISA技术的发展前景和展望
选择适当的读数仪器和方法，确保实验结果的准确性和可靠性。
操作步骤
按照实验要求，进行加样、孵育、洗涤、显色等操作，确保实验过程的规范性和 准确性。
03
ELISA技术的质量控制
实验前的准备和要求
试剂准备
确保所有试剂都符合质 量标准，没有过期，且
在有效期内使用。
设备校准
确保所有的实验设备， 如酶标仪、洗板机等， 都经过校准，以确保结
ELISA技术利用抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体结合，再加入酶标记的 抗原或抗体，通过酶催化底物显色反应，实现对目标分子的检测。
ELISA技术的分类和应用
01 间接ELISA
02 夹心ELISA
03 竞争ELISA
04 重组ELISA
05 应用
用于检测抗体，将抗原吸 附在固相载体上，然后加 入待测血清，最后加入酶 标记的二抗，通过底物显 色反应检测抗体。
1 2
自动化与智能化
随着技术的发展，ELISA技术将进一步实现自动 化和智能化，提高检测效率和准确性。
多指标并行检测
未来ELISA技术将朝着多指标并行检测的方向发 展，能够同时检测多种指标，提高检测效率。
3
纳米技术与ELISA的结合
纳米技术将为ELISA技术带来新的突破，如纳米 探针、纳米酶等，提高检测灵敏度和特异性。
ELISA技术在食品安全检测中的应用实例
农药残留检测
ELISA技术可用于检测食品 中的农药残留，确保食品 的安全性。
兽药残留检测
ELISA技术可用于检测肉类、 禽蛋等食品中的兽药残留， 保障消费者的健康。
生物毒素检测
ELISA技术可用于检测食品 中的生物毒素，如细菌毒 素、真菌毒素等。
ELISA技术的发展前景和展望
选择适当的读数仪器和方法，确保实验结果的准确性和可靠性。
操作步骤
按照实验要求，进行加样、孵育、洗涤、显色等操作，确保实验过程的规范性和 准确性。
03
ELISA技术的质量控制
实验前的准备和要求
试剂准备
确保所有试剂都符合质 量标准，没有过期，且
在有效期内使用。
设备校准
确保所有的实验设备， 如酶标仪、洗板机等， 都经过校准，以确保结
培训课件：酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
培训课件：酶联免疫吸附 试验(ELISA)操作注意事项
了解酶联免疫吸附试验（ELISA）操作的关键要点，掌握实验室技术流程和操 LISA是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗原或抗体在样品中的存在量。ELISA包括直接ELISA、间接ELISA、 竞争ELISA等不同变体。
分析过程中的注意事项
在ELISA分析过程中，严格控制实验条件是保证结果准确性的关键。应注意洗 涤步骤、底物添加时间、反应终止方法等操作细节。
ELISA结果判定及分析
ELISA实验结果的判定和分析要准确可靠。根据阴阳性对照的光密度值，判断 样品中抗原或抗体的含量。
仪器保养与日常维护
ELISA实验仪器的保养和维护是确保实验结果可靠性和设备寿命的重要环节。 定期清洗、校准仪器，及时更换损坏部件。
试剂预备与保存
ELISA试剂的正确预备和储存至关重要，确保试剂的纯度和活性。应注意避光、避热、避湿等条件，按照说明 书的要求进行操作。
微孔板的选择与处理
选择合适的微孔板对实验结果至关重要。应注意微孔板的材质、孔径、表面 处理等因素，并进行适当的洗涤和阻断步骤。
样品的处理与加载
样品的处理与加载是ELISA实验中的关键步骤。应注意样品的稀释倍数、孵育 时间和温度等因素，确保准确的测量结果。
了解酶联免疫吸附试验（ELISA）操作的关键要点，掌握实验室技术流程和操 LISA是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗原或抗体在样品中的存在量。ELISA包括直接ELISA、间接ELISA、 竞争ELISA等不同变体。
分析过程中的注意事项
在ELISA分析过程中，严格控制实验条件是保证结果准确性的关键。应注意洗 涤步骤、底物添加时间、反应终止方法等操作细节。
ELISA结果判定及分析
ELISA实验结果的判定和分析要准确可靠。根据阴阳性对照的光密度值，判断 样品中抗原或抗体的含量。
仪器保养与日常维护
ELISA实验仪器的保养和维护是确保实验结果可靠性和设备寿命的重要环节。 定期清洗、校准仪器，及时更换损坏部件。
试剂预备与保存
ELISA试剂的正确预备和储存至关重要，确保试剂的纯度和活性。应注意避光、避热、避湿等条件，按照说明 书的要求进行操作。
微孔板的选择与处理
选择合适的微孔板对实验结果至关重要。应注意微孔板的材质、孔径、表面 处理等因素，并进行适当的洗涤和阻断步骤。
样品的处理与加载
样品的处理与加载是ELISA实验中的关键步骤。应注意样品的稀释倍数、孵育 时间和温度等因素，确保准确的测量结果。
培训课件：酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
2 核对仪器
确保酶标仪正常运行， 并进行校准和调试。
3 设定样品量
根据实验要求和预期结 果，设定合适的样品量。
ELISA操作流程
取样品
使用移液管准确地取出待测样品，并转移至反 应孔板中。
混合试剂
根据实验要求，将不同试剂混合，并加入反应 孔板中。
洗涤反应孔板
使用洗涤缓冲液彻底洗涤反应孔板，去除非特 异性结合物。
3
反应孔板处理
处理反应孔板，包括洗涤、封闭非特异性结合位点等步骤。
4
标准曲线绘制
通过稀释标准品制备标准曲线，用于分析待测样品的浓度。
材料清单
反应孔板
96孔黑胶板
用于测定光学密度
洗涤缓冲液
用于洗涤反应孔板
实验前准备工作
1 检查试剂
确认试剂溶液的保存状 态和有效期限，避免使 用过期或变质的试剂。
添加底物溶液
加入致色底物溶液，观察反应孔板颜色的变化。
实验注意事项
避光操作
在取样、反应和测量过程中， 避免试剂暴露在强光下，以 保证测量结果的准确性。
注意交叉污染
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，避免不同试剂之间的交 叉污染。
标准曲线绘制
密切按照标准曲线绘制的要 求进行操作，以获得准确的 样品浓度。
结果分析
如何避免交叉污染？
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，并避免将试剂污染到外 部容器或工作台。
应该如何解读ELISA 实验结果？
根据标准曲线将光学密度值 转化为样品浓度，并根据浓 度结果判断样品中目标物质 的含量。
1 测量光学密度
使用酶标仪测量各反应孔板的光学密度，并记录数据。
2 标准品对照
根据标准曲线将测得的光学密度值转化为待测样品的浓度。
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
《ELISA使用方法》课件
结果：酶催化 底物发生显色 反应，颜色深 浅与抗原抗体 复合物的量成
正比
结果判定
阳性结果：出现两条色带，一 条在检测线，一条在质控线
阴性结果：只出现一条色带， 在质控线
无效结果：无色带出现，或出 现多条色带
结果解释：根据色带的出现情 况，判断样本中是否存在待测 物质
03
ELISA实验步骤
样品采集与处理
检测细菌抗体
实验原理：利用抗 原抗体特异性结合 的原理，检测样品 中是否存在特定细 菌抗体
实验步骤：样品处 理、抗原抗体孵育、 洗涤、显色、结果 分析
应用领域：医学、 生物学、食品科学 等领域
注意事项：避免交 叉污染，确保实验 结果的准确性
检测寄生虫抗体
抗体检测：通过ELISA实验 检测寄生虫抗体
样品处理：对样本进行预处 理，如离心、过滤、稀释等
样品采集：选择合适的样本， 如血液、尿液、组织等
样品保存：将处理后的样本 保存在适当的条件下，如低
温、避光等
样品检测：使用ELISA试剂 盒进行检测，按照说明书进
行操作
加样
加样步骤：将待测样品和标准品分别加入相应的孔中 加样量：根据实验要求，一般每个孔加入100μL 加样顺序：先加标准品，再加待测样品 加样注意事项：避免气泡产生，避免交叉污染
寄生虫种类：包括但不限于 蛔虫、钩虫、鞭虫等
实验步骤：样本处理、抗体 孵育、洗涤、显色、结果分
析等
结果解读：根据实验结果判 断是否感染寄生虫，以及寄
生虫种类和数量
检测肿瘤标志物
ELISA实验原理： 利用抗原抗体特 异性结合的原理， 检测肿瘤标志物
肿瘤标志物种类： 包括CEA、 CA125、CA199 等
elisa检测技术 ppt课件
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
微生物与免疫学 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISA(共34张PPT)
一 、ELISA法间接法检测血清中HBsAb 1．熟悉ELISA的原理。
洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) （2）加样过快，孔间发生污染；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H O ） Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2*
• （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物；
（8）酶标仪滤光片不正确；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔 内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出 现假阳性反应等。
• 3．白板
（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干 净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。
HBs Ag（ 本实 验测
）
+
HBe Ag
-
抗HBs（ 本实验 测）
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
抗HBe
-
+
+ -
抗HBc
结果分析
- HBV感染或无症状携带者
- 急慢性乙肝或携带者
+ “大三阳”急慢性乙肝患者（传染 性强）
+ “小三阳”急慢性乙肝感染，趋向 于恢复
+ 既往感染恢复期
+ 既往感染或“窗口期”
实验步骤
• 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的 反应条各一条, 每条含6个反应孔。
洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) （2）加样过快，孔间发生污染；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H O ） Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2*
• （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物；
（8）酶标仪滤光片不正确；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔 内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出 现假阳性反应等。
• 3．白板
（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干 净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。
HBs Ag（ 本实 验测
）
+
HBe Ag
-
抗HBs（ 本实验 测）
-
+
+
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+
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抗HBe
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+
+ -
抗HBc
结果分析
- HBV感染或无症状携带者
- 急慢性乙肝或携带者
+ “大三阳”急慢性乙肝患者（传染 性强）
+ “小三阳”急慢性乙肝感染，趋向 于恢复
+ 既往感染恢复期
+ 既往感染或“窗口期”
实验步骤
• 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的 反应条各一条, 每条含6个反应孔。
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2 试剂的准备
（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出， 在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试 剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要 是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度能较快 地达到所要求的高度，以满足测定要求。
液体温度 > 吸头温度的 移取的液体体积会 偏大 液体温度 < 吸头温度的 移取的液体体积会 偏小
（2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸 取。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2. 体积设定
大体积 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调
4. 吸液
（1） 垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以 下。
（2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸 附达到饱和，再吸入样液，最后打出液体的体积会很 精确。
一般液体，正向吸液（一档二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。
反
正
向
向
吸
吸
液
液
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移液枪的养护及注意事项
吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松 开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。
移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒 置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。
不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强酸、强碱等。 如有液体进入枪体，应及时擦干。 千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损
文ห้องสมุดไป่ตู้仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
一、移液枪的使用
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 样品准备
（1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相同 温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温放置 ，使温度平衡后再吸样。
（2）冰冻保存的样品须注意避免因停电等造成的 反复冻融。
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2 试剂的准备
试剂盒成分：
常用的固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、聚氯 乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底 ，各板之间、同一板各孔之间性能相近。包被抗原或抗 体与聚苯乙烯固相载体通过疏水基团作用物理吸附结合
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1 标本的收集和保存
样品必须置冰箱中冷冻保存。 待检测时取出解冻待测。
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1 标本的收集和保存
（1）细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体 等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对 以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 样品在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状 物时，应离心沉淀后取上清检测。
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5. 放液
（1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。 （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟二档，
排出剩余液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档 后，再多等一两秒钟二档。 （3） 压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁 擦过。 （4） 松开按钮。 （5） 按弹射器除去移液嘴。 （6） 使用完毕。
（3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度 太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确和腐蚀 枪体。
（4） 吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察 是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象 （原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气 密性不好）。
（5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。
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酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为 酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。
坏移液枪。 移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢
复原形，保持松弛状态，延长移液枪的使用寿命。 应定期对移液枪进行校准。
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二、ELISA具体操作
1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断
可保证最佳的精确度
严格的精确调节方法
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3. 装枪头
将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可
上下敲击会引起 内部的零部件因 瞬间强烈撞击而 松散， 甚至会导致调节 刻度的旋钮卡住
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常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷 酶和脲酶等。
洗液：非离子型洗涤剂 酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和
ABTS，为供氢体。 终止液为硫酸。
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ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例）
•ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶 催化底物显色来判断结果。
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影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集 保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控 制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等 一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确 性和可靠性。
（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出， 在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试 剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要 是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度能较快 地达到所要求的高度，以满足测定要求。
液体温度 > 吸头温度的 移取的液体体积会 偏大 液体温度 < 吸头温度的 移取的液体体积会 偏小
（2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸 取。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2. 体积设定
大体积 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调
4. 吸液
（1） 垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以 下。
（2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸 附达到饱和，再吸入样液，最后打出液体的体积会很 精确。
一般液体，正向吸液（一档二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。
反
正
向
向
吸
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液
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文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
移液枪的养护及注意事项
吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松 开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。
移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒 置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。
不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强酸、强碱等。 如有液体进入枪体，应及时擦干。 千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损
文ห้องสมุดไป่ตู้仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
一、移液枪的使用
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 样品准备
（1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相同 温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温放置 ，使温度平衡后再吸样。
（2）冰冻保存的样品须注意避免因停电等造成的 反复冻融。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2 试剂的准备
试剂盒成分：
常用的固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、聚氯 乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底 ，各板之间、同一板各孔之间性能相近。包被抗原或抗 体与聚苯乙烯固相载体通过疏水基团作用物理吸附结合
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1 标本的收集和保存
样品必须置冰箱中冷冻保存。 待检测时取出解冻待测。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1 标本的收集和保存
（1）细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体 等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对 以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 样品在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状 物时，应离心沉淀后取上清检测。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
5. 放液
（1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。 （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟二档，
排出剩余液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档 后，再多等一两秒钟二档。 （3） 压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁 擦过。 （4） 松开按钮。 （5） 按弹射器除去移液嘴。 （6） 使用完毕。
（3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度 太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确和腐蚀 枪体。
（4） 吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察 是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象 （原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气 密性不好）。
（5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。
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酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为 酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。
坏移液枪。 移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢
复原形，保持松弛状态，延长移液枪的使用寿命。 应定期对移液枪进行校准。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
二、ELISA具体操作
1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断
可保证最佳的精确度
严格的精确调节方法
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3. 装枪头
将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可
上下敲击会引起 内部的零部件因 瞬间强烈撞击而 松散， 甚至会导致调节 刻度的旋钮卡住
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常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷 酶和脲酶等。
洗液：非离子型洗涤剂 酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和
ABTS，为供氢体。 终止液为硫酸。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例）
•ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶 催化底物显色来判断结果。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集 保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控 制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等 一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确 性和可靠性。