酶联免疫吸附试验ELISA操作注意事项课件

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5. 放液
（1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。 （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟二档，
排出剩余液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档 后，再多等一两秒钟二档。 （3） 压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁 擦过。 （4） 松开按钮。 （5） 按弹射器除去移液嘴。 （6） 使用完毕。
坏移液枪。 移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢
复原形，保持松弛状态，延长移液枪的使用寿命。 应定期对移液枪进行校准。
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二、ELISA具体操作
1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断
可保证最佳的精确度
严格的精确调节方法
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3. 装枪头
将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可
上下敲击会引起 内部的零部件因 瞬间强烈撞击而 松散， 甚至会导致调节 刻度的旋钮卡住
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2 试剂的准备
（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出， 在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试 剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要 是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度能较快 地达到所要求的高度，以满足测定要求。
4. 吸液
（1） 垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以 下。
（2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸 附达到饱和，再吸入样液，最后打出液体的体积会很 精确。
一般液体，正向吸液（一档二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。
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反
正
向
向
吸
吸
液
液
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酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为 酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。
常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷 酶和脲酶等。
洗液：非离子型洗涤剂 酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和
ABTS，为供氢体。 终止液为硫酸。
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液体温度 > 吸头温度的 移取的液体体积会 偏大 液体温度 < 吸头温度的 移取的液体体积会 偏小
（2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸 取。
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2. 体积设定
大体积 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调
（3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度 太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确和腐蚀 枪体。
（4） 吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察 是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象 （原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气 密性不好）。
（5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。
（2）冰冻保存的样品须注意避免因停电等造成的 反复冻融。
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2 试剂的准备
试剂盒成分：
常用的固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、聚氯 乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底 ，各板之间、同一板各孔之间性能相近。包被抗原或抗 体与聚苯乙烯固相载体通过疏水基团作用物理吸附结合
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一、移液枪的使用
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1. 样品准备
（1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相同 温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温放置 ，使温度平衡后再吸样。
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移液枪的养护及注意事项
吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松 开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。
移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒 置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。
不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强酸、强碱等。 如有液体进入枪体，应及时擦干。 千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损
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1 标本的收集和保存
样品必须置冰箱中冷冻保存。 待检测时取出解冻待测。
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1 标本的收集和保存
（1）细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体 等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对 以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 样品在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状 物时，应离心沉淀后取上清检测。
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ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例）
•ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶 催化底物显色来判断结果。
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影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集 保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控 制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等 一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确 性和可靠性。