电子克隆的原理和应用

生物信息学 Bioinformatics
编号 第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章
名称 生物信息学引论 生物信息学的生物学基础 生物信息学数据库资源 DNA和蛋白质序列分析 DNA和蛋白质序列分析 系统发生分析 基因表达数据分析 其他常用生物信息学工具 电子克隆的原理和应用 基本生物信息学工具的开发与应用
4.电子克隆中最常见的问题及解决办法 4.电子克隆中最常见的问题及解决办法
有时难以确定5 端完整性： 有时难以确定5’端完整性： •序列比较 • Kozak规则[A/GNNAUGG] Kozak规则 规则[A/GNNAUGG] • 起始密码子上游的同阅读框序列中是否存在终止密码子 • Northern杂交 Northern杂交 • RACE技术 RACE技术
5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍 5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍
2.电子克隆的条件和特点 2.电子克隆的条件和特点：
电子克隆的特点： 电子克隆的特点： 投入低； 投入低； 速度快； 速度快； 技术要求不高； 技术要求不高； 针对性强等。 针对性强等。
3.电子克隆的基本思路及具体实例： 3.电子克隆的基本思路及具体实例： 电子克隆的基本思路及具体实例
种子氨基酸序列 tBLASTn 水稻基因组contig 水稻基因组contig或BAC/PAC contig或 人工 外显子预测 RT-PCR，克隆， RT-PCR，克隆，测序 计算机 EST拼接 拼接
种子氨基酸序列 tBLASTn 水稻基因组contig 水稻基因组contig或BAC contig或 人工 水稻幼苗 提取总RNA 提取总RNA 合成cDNA第一链 合成cDNA第一链 外显子预测 RT-PCR，克隆， RT-PCR，克隆，测序 设计PCR引物 设计PCR引物 计算机 EST拼接 拼接
2.电子克隆的条件和特点 2.电子克隆的条件和特点：
前提条件；研究物种:丰富的核酸序列信息； 研究物种:丰富的核酸序列信息；
比较物种:较多的基因研究； 比较物种:较多的基因研究； 强大的计算机分析软硬件的支持。 强大的计算机分析软硬件的支持。
2.电子克隆的条件和特点 2.电子克隆的条件和特点：
目前已经基本完成基因组测序的常见生物：
4. Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
种子核苷酸序列 BLASTn 水稻EST 水稻EST数据库 EST数据库 人工 序列拼接 计算机
直到无法继续延伸或已经具备 完整的ORF 完整的ORF RT-PCR，克隆， RT-PCR，克隆，测序
4. Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
4. O息学软件和网站介绍 5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍
常用的基因组分析软件：
FGENESH: 最好的分析软件，可以预测多种生物的基因组结构， 最好的分析软件，可以预测多种生物的基因组结构，包括 转录起始位点，编码区以及转录终子位点。 转录起始位点，编码区以及转录终子位点。 GenScan: /genscan.html 只能进行人、 只能进行人、拟南芥和玉米的分析 RiceGAAS:http://ricegaas.dna.affrc.go.jp RiceGAAS:http://ricegaas.dna.affrc.go.jp RiceHMM: http://rgp.dna.affrc.go.jp/ricehmm SplicePredictor: Web Gene: r.it/~webgene/
第八章
电子克隆 in silico cloning
内容提要： 内容提要：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 什么是电子克隆？ 什么是电子克隆？ 电子克隆的条件和特点； 电子克隆的条件和特点； 电子克隆的思路和具体例子； 电子克隆的思路和具体例子； 电子克隆中最常见的问题及解决办法； 电子克隆中最常见的问题及解决办法； 电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍； 电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍； 电子克隆的应用前景; 电子克隆的应用前景;
3. OsG6PDH 的克隆
水稻OsG6PDH 的基因组结构
OsG6PDH基因组序列约 kb，包括15个外显子 14个内含子 OsG6PDH基因组序列约5 kb，包括15个外显子，14个内含子,内含 基因组序列约5 个外显子， 个内含子, 子序列完全符合5’GU…AG3’的特征 的特征。 子序列完全符合5’GU…AG3’的特征。
5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍 5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍
常用的序列数据库-- GenBank
GenBank 包括了所有已公布的基因组、EST数据。 包括了所有已公布的基因组、EST数据 数据。 无冗余数据库（包括mRNA,DNA... mRNA,DNA...） Nr 无冗余数据库（包括mRNA,DNA...） dbEST 数据库 GenBank提供的检索工具 GenBank提供的检索工具——BLAST 提供的检索工具——BLAST Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] Standard protein-protein BLAST [blastp] Nucleotide query - Protein db [blastx] Protein query - Translated db [tblastn] Nucleotide query - Translated db [tblastx]
更多的有关电子克隆: 更多的有关电子克隆: 水稻功能基因的电子克隆策略,中国水稻科学, 1. 水稻功能基因的电子克隆策略,中国水稻科学, 2002,16:2952002,16:295-298 水稻葡萄糖- 磷酸脱氢酶基因的电子克隆,遗传学报, 2. 水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的电子克隆,遗传学报, 2002,29:10122002,29:1012-1016
1.什么是电子克隆？ 1.什么是电子克隆？ 什么是电子克隆
?????
首先：什么是基因克隆？ 首先：什么是基因克隆？ 传统的基因克隆指什么？ 传统的基因克隆指什么？
1.什么是电子克隆？ 1.什么是电子克隆？ 什么是电子克隆
电子克隆（in silico cloning）是近年来伴随着基因组 cloning） 电子克隆（ 和EST计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用 EST计划发展起来的基因克隆新方法， 计划发展起来的基因克隆新方法 日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能 日益发展的生物信息学技术， 力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR的方法 通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT PCR的方法 EST或基因组的序列组装和拼接 RT快速获得功能基因。 快速获得功能基因。 基于原理：物种同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性） 基于原理：物种同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性）
有时也可以： 有时也可以：
3 OsG6PDH 的克隆
3 OsG6PDH 的克隆
3 OsG6PDH 的克隆
3. OsG6PDH 的克隆
以获得的包含OsG6PDH的水稻基因组序列为对象， 的水稻基因组序列为对象， 以获得的包含 的水稻基因组序列为对象 进行基因结构预测: 进行基因结构预测 通过Softberry网站进行基因结构的预测 网站进行基因结构的预测 通过 拼接获得的预测序列可以搜索水稻EST数据库，加以 数据库， 拼接获得的预测序列可以搜索水稻 数据库 验证
4. Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
EST contig
与玉米6PGDH （AF061837）匹配的部分水稻ESTs AF061837）匹配的部分水稻ESTs
3. OsZFP 基因家族的克隆： 基因家族的克隆：
水稻锌指蛋白氨基酸序列
?
水稻各种组织 分别提取总RNA 分别提取总RNA 合成cDNA第一链 合成cDNA第一链 搜索水稻基因组库 水稻锌指蛋白基因序列 设计PCR引物 设计PCR引物 EST拼接 拼接
4 OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
3 OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
RT-PCR RT-
克隆
测序
生物信息学分析
3 OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
3 OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
PCR扩增 PCR扩增 克隆
OsZFP基因家族的 基因家族的 电子克隆流程图
3. OsZFP 基因家族的克隆： 基因家族的克隆：
OsZFP 家 族
3. OsZFP 基因家族的克隆： 基因家族的克隆：
• 逐个对每个 逐个对每个ZFP基因进行完整性分析 基因进行完整性分析 • 基因表达特性分析 基因表达特性分析. • 设计引物 PCR扩增 设计引物, 扩增. 扩增
4.电子克隆中最常见的问题及解决办法 4.电子克隆中最常见的问题及解决办法
有时候难以确定其表达的时期和条件： 有时候难以确定其表达的时期和条件： • • • • EST的表达时期(Unigene数据库 EST的表达时期(Unigene数据库、EST profile) 的表达时期(Unigene数据库、 其他类似基因的表达时期 从多组织进行扩增（尤其是基因家族的分离） 从多组织进行扩增（尤其是基因家族的分离） 查询GEO 查询GEO数据库 GEO数据库
3. OsG6PDH 的克隆