电子克隆的原理和应用

5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍 5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍
常用的基因组分析软件：
FGENESH: http://www.softberry.com 最好的分析软件，可以预测多种生物的基因组结构， 最好的分析软件，可以预测多种生物的基因组结构，包括 转录起始位点，编码区以及转录终子位点。 转录起始位点，编码区以及转录终子位点。 GenScan: http://genes.mit.edu/genscan.html 只能进行人、 只能进行人、拟南芥和玉米的分析 RiceGAAS:http://ricegaas.dna.affrc.go.jp RiceGAAS:http://ricegaas.dna.affrc.go.jp RiceHMM: http://rgp.dna.affrc.go.jp/ricehmm SplicePredictor: http://bioinformatics.iastate.edu.cn Web Gene: http://125.itba.mi.cnr.it/~webgene/
4.电子克隆中最常见的问题及解决办法 4.电子克隆中最常见的问题及解决办法
有时难以确定5 端完整性： 有时难以确定5’端完整性： •序列比较 • Kozak规则[A/GNNAUGG] Kozak规则 规则[A/GNNAUGG] • 起始密码子上游的同阅读框序列中是否存在终止密码子 • Northern杂交 Northern杂交 • RACE技术 RACE技术
5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍 5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍
常用的序列数据库-- GenBank
GenBank 包括了所有已公布的基因组、EST数据。 包括了所有已公布的基因组、EST数据 数据。 无冗余数据库（包括mRNA,DNA... mRNA,DNA...） Nr 无冗余数据库（包括mRNA,DNA...） dbEST 数据库 GenBank提供的检索工具 GenBank提供的检索工具——BLAST 提供的检索工具——BLAST Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] Standard protein-protein BLAST [blastp] Nucleotide query - Protein db [blastx] Protein query - Translated db [tblastn] Nucleotide query - Translated db [tblastx]
RT-PCR RT-
克隆
测序
生物信息学分析
3 OsG6PDH 的克隆
Fra Baidu bibliotek
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
3 OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
生物信息学 Bioinformatics
编号 第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章
名称 生物信息学引论 生物信息学的生物学基础 生物信息学数据库资源 DNA和蛋白质序列分析 DNA和蛋白质序列分析 系统发生分析 基因表达数据分析 其他常用生物信息学工具 电子克隆的原理和应用 基本生物信息学工具的开发与应用
4. Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
EST contig
与玉米6PGDH （AF061837）匹配的部分水稻ESTs AF061837）匹配的部分水稻ESTs
3. OsZFP 基因家族的克隆： 基因家族的克隆：
水稻锌指蛋白氨基酸序列
?
水稻各种组织 分别提取总RNA 分别提取总RNA 合成cDNA第一链 合成cDNA第一链 搜索水稻基因组库 水稻锌指蛋白基因序列 设计PCR引物 设计PCR引物 EST拼接 拼接
2.电子克隆的条件和特点 2.电子克隆的条件和特点：
电子克隆的特点： 电子克隆的特点： 投入低； 投入低； 速度快； 速度快； 技术要求不高； 技术要求不高； 针对性强等。 针对性强等。
3.电子克隆的基本思路及具体实例： 3.电子克隆的基本思路及具体实例： 电子克隆的基本思路及具体实例
种子氨基酸序列 tBLASTn 水稻基因组contig 水稻基因组contig或BAC/PAC contig或 人工 外显子预测 RT-PCR，克隆， RT-PCR，克隆，测序 计算机 EST拼接 拼接
人 家鸡
小鼠
大鼠
线虫
果蝇
拟南芥
水稻
家蚕…… 家蚕……
陆地棉 烟草 番茄 拟南芥 水稻 玉米 大豆 大麦 小麦 鸡 大鼠 小鼠 人
0
100
200
300
400
500
600 万
各种生物的EST数目 各种生物的EST数目
人类基因的电子克隆：
2002年 2002年4月16日的第七届国际人类基因组学大会上， 16日的第七届国际人类基因组学大会上 日的第七届国际人类基因组学大会上， 我国唯一的获Poster奖论文是 奖论文是《 我国唯一的获Poster奖论文是《人类新基因的电子克隆 和实验确认》 他们发现电子克隆的4个人类基因中， 和实验确认》。他们发现电子克隆的4个人类基因中， 个与相应的GenBank基因组注解不同 基因组注解不同， 有3个与相应的GenBank基因组注解不同，经过实验确 认确定为GenBank中的注解错误 中的注解错误。 认确定为GenBank中的注解错误。 证明了基因组注解中存在着很多问题，需要进行实 证明了基因组注解中存在着很多问题， 验确认。 验确认。 目前发表的有关人类基因克隆的绝大部分都利用了 人类的基因组或EST数据 数据。 人类的基因组或EST数据。 人类2/3的基因需要实验确认 人类2/3的基因需要实验确认！ 的基因需要实验确认！
5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍 5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍
4 OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
3 OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
PCR扩增 PCR扩增 克隆
OsZFP基因家族的 基因家族的 电子克隆流程图
3. OsZFP 基因家族的克隆： 基因家族的克隆：
OsZFP 家 族
3. OsZFP 基因家族的克隆： 基因家族的克隆：
• 逐个对每个 逐个对每个ZFP基因进行完整性分析 基因进行完整性分析 • 基因表达特性分析 基因表达特性分析. • 设计引物 PCR扩增 设计引物, 扩增. 扩增
1.什么是电子克隆？ 1.什么是电子克隆？ 什么是电子克隆
?????
首先：什么是基因克隆？ 首先：什么是基因克隆？ 传统的基因克隆指什么？ 传统的基因克隆指什么？
1.什么是电子克隆？ 1.什么是电子克隆？ 什么是电子克隆
电子克隆（in silico cloning）是近年来伴随着基因组 cloning） 电子克隆（ 和EST计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用 EST计划发展起来的基因克隆新方法， 计划发展起来的基因克隆新方法 日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能 日益发展的生物信息学技术， 力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR的方法 通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT PCR的方法 EST或基因组的序列组装和拼接 RT快速获得功能基因。 快速获得功能基因。 基于原理：物种同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性） 基于原理：物种同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性）
有时也可以： 有时也可以：
3 OsG6PDH 的克隆
3 OsG6PDH 的克隆
3 OsG6PDH 的克隆
3. OsG6PDH 的克隆
以获得的包含OsG6PDH的水稻基因组序列为对象， 的水稻基因组序列为对象， 以获得的包含 的水稻基因组序列为对象 进行基因结构预测: 进行基因结构预测 通过Softberry网站进行基因结构的预测 网站进行基因结构的预测 通过 http://www.softberry.com 拼接获得的预测序列可以搜索水稻EST数据库，加以 数据库， 拼接获得的预测序列可以搜索水稻 数据库 验证
第八章
电子克隆 in silico cloning
内容提要： 内容提要：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 什么是电子克隆？ 什么是电子克隆？ 电子克隆的条件和特点； 电子克隆的条件和特点； 电子克隆的思路和具体例子； 电子克隆的思路和具体例子； 电子克隆中最常见的问题及解决办法； 电子克隆中最常见的问题及解决办法； 电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍； 电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍； 电子克隆的应用前景; 电子克隆的应用前景;
种子氨基酸序列 tBLASTn 水稻基因组contig 水稻基因组contig或BAC contig或 人工 水稻幼苗 提取总RNA 提取总RNA 合成cDNA第一链 合成cDNA第一链 外显子预测 RT-PCR，克隆， RT-PCR，克隆，测序 设计PCR引物 设计PCR引物 计算机 EST拼接 拼接
3. OsG6PDH 的克隆
根据水稻OsG6PDH 的基因组结构预测的结果,得到预测的 的基因组结构预测的结果, cDNA序列 包含ORF) 序列( cDNA序列(包含ORF) 设计PCR引物. 设计PCR引物. PCR引物
但是选择什么来源的cDNA模板呢? 如何确定? 但是选择什么来源的cDNA模板呢? 如何确定? cDNA模板呢 最后通过RT PCR的方法分离该基因 并进行序列测定. 最后通过RT-PCR的方法分离该基因,并进行序列测定. RT的方法分离该基因,
2.电子克隆的条件和特点 2.电子克隆的条件和特点：
前提条件；研究物种:丰富的核酸序列信息； 研究物种:丰富的核酸序列信息；
比较物种:较多的基因研究； 比较物种:较多的基因研究； 强大的计算机分析软硬件的支持。 强大的计算机分析软硬件的支持。
2.电子克隆的条件和特点 2.电子克隆的条件和特点：
目前已经基本完成基因组测序的常见生物：
3. OsG6PDH 的克隆
水稻OsG6PDH 的基因组结构
OsG6PDH基因组序列约 kb，包括15个外显子 14个内含子 OsG6PDH基因组序列约5 kb，包括15个外显子，14个内含子,内含 基因组序列约5 个外显子， 个内含子, 子序列完全符合5’GU…AG3’的特征 的特征。 子序列完全符合5’GU…AG3’的特征。
4. Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
种子核苷酸序列 BLASTn 水稻EST 水稻EST数据库 EST数据库 人工 序列拼接 计算机
直到无法继续延伸或已经具备 完整的ORF 完整的ORF RT-PCR，克隆， RT-PCR，克隆，测序
4. Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
4. Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
4.电子克隆中最常见的问题及解决办法 4.电子克隆中最常见的问题及解决办法
有时候难以确定其表达的时期和条件： 有时候难以确定其表达的时期和条件： • • • • EST的表达时期(Unigene数据库 EST的表达时期(Unigene数据库、EST profile) 的表达时期(Unigene数据库、 其他类似基因的表达时期 从多组织进行扩增（尤其是基因家族的分离） 从多组织进行扩增（尤其是基因家族的分离） 查询GEO 查询GEO数据库 GEO数据库
更多的有关电子克隆: 更多的有关电子克隆: 水稻功能基因的电子克隆策略,中国水稻科学, 1. 水稻功能基因的电子克隆策略,中国水稻科学, 2002,16:2952002,16:295-298 水稻葡萄糖- 磷酸脱氢酶基因的电子克隆,遗传学报, 2. 水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的电子克隆,遗传学报, 2002,29:10122002,29:1012-1016