植物组织培养 第十章 原生质体培养
植物组织培养
1.植物组织培养（离体培养）：是指在无菌条件下，将植物体的任何一部分，培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件，使之发育形成完整植物体的过程。
2、植物组织培养的类型（1）根据培养基的类型分为:固体培养液体培养半液半固体培养（2）根据培养材料（外植体类型）分为：植株培养器官培养组织培养原生质体培养胚胎培养细胞培养（3）按培养过程分：初代培养继代培养生根培养3、植物组织培养的一般工作流程1.准备阶段：（1）查阅资料，制定培养方案；（2）清洗组培用器皿、工具；（3）配制所需试剂和培养基；（4）试剂、培养基及器皿、工具的灭菌。
2.外植体的选择与消毒；3.初代培养；4.继代培养；5.生根培养；6.炼苗移栽4、植物细胞的全能性概念：指植物体的每个活细胞都携带有该物种的全套遗传信息，在适宜条件下，离体细胞都具有发育为一个完整植株的潜在能力。
注意：（1）活细胞（2）离体细胞（3）细胞全能性表达的难易程度取决于细胞的分化程度5、细胞全能性的强弱表现：（1）植物细胞全能性根据细胞的性质不同由强到弱：营养生长中心＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化细胞）＞特化细胞（导管等）（2）植物细胞全能性根据所处的组织不同由强到弱：顶端分生组织＞侧生分生组织＞居间分生组织＞薄壁组织＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织6、植物组织培养中全能性表达的条件：1.无菌条件；2.离体条件；3.一定的营养物质；4.植物生长调节物质；5.适宜的外界条件。
7、胚性细胞的特点：未分化状态；细胞具有旺盛分裂能力；具有两极性8、脱分化：指在一定条件下，已分化成熟的细胞、组织或器官恢复到未分化的分生状态，并进行细胞分裂形成未分化的细胞团，如愈伤组织的形成过程。
9、愈伤组织形成的三个时期：（1）诱导期又称启动期（最难）。
（2）分裂期（3）分化期10、优良愈伤组织的特征：（1）具有旺盛的增殖能力；（2）容易散碎；（3）具有高度的胚性或再分化能力，便于植株再生；（4）经过长期的继代保存而不丧失胚性。
植物原生质体组织培养
影响原生质体培养的因素
❖ 原生质体的活力
❖ 原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生质 体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂 一、二次，密度在104个／ml以上，植板率常显著 提高。
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是 以B5培养基为基础；N6培养基则以MS培 养基为基础 改进的。
❖ 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。
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渗透压稳定剂
❖ 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破 碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整 渗透压，维持细胞内外渗透压平衡，防止细胞涨破或过 分收缩而破坏内部结构。
❖ 常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖 等，浓度约在0.40M~0.80M。渗透压稳定剂还可促进分 离的原生质体再生细胞壁并继续分裂 。
纤维 素酶
枸杞愈伤组织 0.5
半纤 崩溃 果胶酶 维素 酶 酶
0.2
离 研究者 析 酶
0.2 孙勇如等
檀香幼叶 2.0 0.5 0.5 0.5
Lakshmi
檀香愈伤组织 Biblioteka .00.5Lakshmi
榆幼叶
0.1~0.2
山毛榉幼叶 1.0 胡杨悬浮细胞 0.5 0.5
0.05 0.01~0.03
Dorin
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影响原生质体培养的因素
❖ 培养条件
温度，光照
❖ 植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
❖ 供体细胞的生长同步性
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原生质体再生过程
❖ 原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。
植物组织培养复习资料
植物组织培养复习资料一、名词解释。
（每个3分，共24分）１、植物组织培养：在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或发育成完整植株的技术。
又称植物离体培养。
２、细胞的全能性：指植物体的任何一个有完整细胞核的活细胞都具有该植物的全套遗传基因和产生完整植株的潜在能力。
3、脱分化：离体培养条件下生长的器官、组织、细胞，经过细胞分裂或不分裂而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞过程。
4、外植体：从活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。
5、单细胞培养：对分离的到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。
6、胚状体：亦称体细胞胚。
指在组培过程中，由植物体细胞所形成的类似于合子胚的结构。
它具有根、茎结构，能够一次性形成再生植株。
7、平板培养：是将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中，使其与培养基充分配合，再倒入培养皿中进行培养的方法。
8、人工种子：指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒状。
9、次生代谢产物：指植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。
10、再分化：细胞经过脱分化形成的愈伤组织再次分化，进行器官形成，产丛生芽或胚状体，形成完整植株的过程。
11、无病毒苗:指不含该种植物主要危害病毒的苗木。
二、不定项选择1、培养室里的湿度一般保持在____C_____.A 30~40%；B 50~60%；C 70~80%；D 80~90%2. 下列不属于生长素类的植物激素是____A D____。
A Kt；B IAA；C NAA；D ZT3. 影响培养基凝固程度因素有_______A B C D__.A 琼脂的质量好坏；B 高压灭菌的时间；C 高压灭菌的温度；D 培养基的PH4. 活性炭在组织培养中的作用有_______ABC_。
植物组织培养
矮牵牛茎尖离体培养培养
大蒜根尖培养及植株 再生
微型月季茎段离体培养
叶诱导愈伤组织
台湾百合离体培养
菊花体细胞胚胎发生及植株再生
矮牵牛茎尖离体培养培养
牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖
非洲紫罗兰叶片培 养
优化培养基
无蔗糖
1%蔗糖
5%蔗糖
无BAP
BAP 0.1mg/l
BAP 5.0mg/l
无NAA
种质资源的离体保存
体细胞无性系变异筛选
花粉、花药培养产生单倍体植株
幼胚拯救克服远缘杂交障碍
用于基因工程技术创造植物新种质。
3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次 生代谢物质；
根培养:正常根培养， 毛状根培养
4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、 病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。
1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。
1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和 Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主 要成分是Ti质粒。 1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。
五、植物组织培养技术的应用
1、优质种苗的快速无性繁殖： （1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖
园艺植物种苗工厂化生产
兰科植物生产
A
B
C
E
F
G
花烛属植物
厥类植物
盆栽及切花植物的繁殖
珍贵树种
无菌苗快速繁殖
无菌苗驯化
组培苗驯化移栽
茎、芽和小植株的规模培养
经济植物快速繁殖
（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、
植物原生质体培养
3 提取方法
①机械分离法（Machanical isolation） ②酶法分离（Enzymatic isolation）
①机械法
早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机 械法分离原生质体。 方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织， 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁，从而释放出完整的原生质体。 缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
f cell colonies derived from protoplast,
g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,
h green shoot formation,
i fertile green plant
Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.
优点：可获得大量的原生质体，几乎适用 于所有植物的器官、组织和细胞。
缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、 酚类等物质，影响原生质体的活力。
注意事项： ⑴酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围450～800mmol/L
⑵酶处理： 酶浓度 酶解时间
界面法
①离心沉淀法
• 原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质 体沉于底部。
• 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。 第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心 沉淀。如此2～3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养
方法：
1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使 叶片漂浮在酶溶液中； 2.把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，可与真 空渗入相结合。
3、酶处理
分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素 酶和果胶酶，后者的作用主要是细胞间的果胶质 降解，前者是消化细胞壁纤维素。
对于某些组织来说,除了纤维素酶和果胶酶外可能
Hemicellulase 63178,USA
酶处理效果
酶解时间
酶浓度
酶解温度
酶浓度
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离 原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而 悬浮细胞则用酶量较大。
酶解时间\酶解温度
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶 尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离 原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶 解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游 离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以 一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活 性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在 40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一 般都在25℃左右进行酶解。
1沉降法镍丝网滤出液置于离心管离心23分钟原生质体沉于离心管底部残液碎屑悬浮于上清液弃去上清液再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中反复3次常用的清洗培养基cpw盐溶液成mgl转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中为准一般500800rm的转速下离心35min
1、Protoplast A cell from which the entire cell wall has been removed Isolated protoplasts have been described as "naked" cells because the cell wall has been removed by either a mechanical or an enzymatic process. In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed.
植物原生质体培养
原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
植物细胞组织培养(PPT)
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主要有:
➢ 原生质体（Protoplast）培养 ➢ 悬浮细胞培养 ➢ 组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培
养 ➢ 器官（胚，花药，子房，根和茎）培养
其中最常见的是愈伤组织培养。
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植物细胞组织培养范畴：
（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出 符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等， 通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值 的其他产品的技术。
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三、植物组织培养的生理依据
植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具 有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、 赤霉素、脱落酸、乙烯等
生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管 苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强 弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。
细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老， 促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。
赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。 常用的为GA3。
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四、植物组织培养的原理
★植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成
种子培养
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3. 组织或愈伤组织培养(tissue， callus culture) ：是对植物体的各部分
组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、 木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄 壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈 伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形 成植株.
植物组织培养的过程是什么？
植物组织培养的过程是什么？根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术——植物的组织培养技术植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。
植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。
不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。
再适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。
植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科植物组织的培养方法：1、非试管微组织快繁非试管微组织快繁技术是将外植体（一般要求带一叶一芽）放置在室内外普通沙子培养基上进行培养，利用植物腋芽自然倍增达到快速繁殖的目的。
一般植物7～15天可以生长出根系。
此技术投资低，操作环节少。
2、试管组织培养试管组织培养是将外植体（即离体组织、器官或细胞）放置在试管等器皿中在无菌的条件下进行组织培养获得试管苗。
植物组织培养的优点：1、占用空间小，不受地区、季节限制。
2、不携带病毒3、培养周期短4、可用组培中的愈伤组织支取特殊的生化制品5、可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物6、可诱导之分化成需要的器官，如根和芽7、解决有些植物产种子少或无的难题，8、不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征9、投资少，经济效益高10、繁殖方式多，试用品种多植物组织培养一般分为以下几种：1、胚胎培养指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。
植物生理学-第十章 植物的生长生理
细胞分化的理论基础是：细胞全能性
（一）细胞分化的内部调控机理 1、通过极性控制分化 极性是分化产生的第一步，极性的存
在使形态学上端分化出芽，下端分化出根。 极性产生的原因： 受精卵的第一次不均等分裂 IAA在茎中的极性传导
2、通过激素控制分化 IAA促进愈伤组织分化出根，CTK促 进分化出芽。 3、通过基因调控分化 如开花基因活化，可导致成花。 （二）外界条件对细胞分化的调节 1、糖浓度
4、种子寿命
种子寿命（seed longevity）：从种子 成熟到失去发芽力的时间。
顽拗性种子：不耐脱水和低温，寿 命很短，如：热带的 可可、芒果种子
正常性种子：耐脱水和低温，寿命 较长，如：水稻、花生
种子寿命与种子含水量和贮藏温度 有关。
二、影响种子萌发的外界条件 1、足够的水分 吸水是种子萌发的第一步：
不同作物种子萌发时需要温度高 低不同，与其原产地密切相关。
4、光 — 有的种子萌发需光
需光种子：光下才能萌发的种子， 如莴苣、烟草、杂草种子
需暗种子：光抑制种子萌发，如 茄子、番茄、瓜类种子
对光不敏感种子：有光无光都可
三、种子萌发时的生理生化变化 （一）种子吸水
种子的吸水分为三个阶段：
急剧吸水阶段 — 吸胀性吸水 吸水停顿阶段 胚根出现 大量吸水阶段 — 渗透性吸水
2、种子生活力 种子生活力（seed viability）：指种子 能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。
鉴定种子生活力的方法：
（1）利用组织还原能力（TTC染色法）
TTC
2H 脱氢E
氧化态 无色
三苯甲瓒
还原态 红色2、利用原生质来自着色能力 —（染料染 色法）活种子的原生质膜有选择透性，不选 择吸收染料，原生质（胚）不着色。
4.原生质体培养与细胞融合(植物组织培养)
原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
植物组织培养 第十章 原生质体培养
第十章原生质体培养✧教学目的与要求：✧深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。
第一节、原生质体研究概况一、原生质体的概念✧原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。
二、原生质体研究进展✧据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。
其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。
三、原生质体研究的意义✧1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。
2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。
3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
第二节、原生质体的制备1、用于分离原生质体的材料准备✧无菌试管苗叶片✧上胚轴和子叶✧培养细胞2、酶处理✧原生质体分离常用的商品酶✧纤维素酶类✧果胶酶类✧半纤维素酶酶溶剂及其渗透压✧酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。
✧渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。
✧酶浓度及酶解时间✧酶解时间✧酶浓度酶解温度3、原生质体的收集和纯化✧飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。
✧P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。
渗透压很低(<20m o s m／k g H2O),粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。
由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。
此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
植物组织培养(山东联盟)智慧树知到答案章节测试2023年山东农业工程学院
第一章测试1.有利于启动植物细胞分化和形成胚性细胞团。
A:2，4-DB:细胞分裂素C:赤霉素D: 脱落酸答案:A2.下列关于在组织培养的发展史上事件描述不正确的是（）。
A:1960年Cooking报道了诱导鸡红细胞与酵母细胞融合培养。
B:1958年Steward报道了胡萝卜细胞悬浮培养C:1978年Melchers报道了马铃薯和番茄的融合培养D:1962年Murashinge和Skoog在烟草的培养中筛选出N6培养基。
答案:D3.植物细胞怎样才能表现出全能性（）。
A:导入其他植物细胞的基因B:将成熟筛管细胞核移植到去核的卵细胞内C:脱离母体后给予适宜营养和外界条件D:给予适宜的营养和外界条件答案:C4.优良的愈伤组织具备以下哪几个特点（）。
A:高度的胚性或再分化能力B:旺盛的自我增殖能力C:经过长期继代保存而不丧失胚性D:不容易散碎答案:ABC5.植物激素中的生长素和细胞分裂素，是启动细胞脱分化、分裂和再分化的关键性激素。
A:对B:错答案:A6.一般单子叶植物比双子叶植物及裸子植物容易脱分化。
A:错B:对答案:A7.胚胎培养的目的是克服败育和三倍体育种。
A:错B:对答案:B8.实现细胞全能性的条件是组织或器官解离和给予所需的营养物质。
A:错B:对答案:B9.支撑植物组织培养作为一门技术的两个重要模式是培养基模式和激素调控模式。
A:对B:错答案:A10.将植物体的任何部分都可以进行离体培养，使之发育形成完整植物体。
A:错B:对答案:B第二章测试1.调整培养基pH所用到的仪器是（）。
A:离心机B:酸度计C:显微镜D:电子天平答案:B2.电线着火时，下列措施正确的是（）。
A:可用泡沫灭火器灭火B:先灭火再切断电源C:用沙或二氧化碳灭火器灭火D:可用水灭火答案:C3.下列哪个不是培养室的设备（）。
A:培养箱B:紫外光源C:高压灭菌锅D:培养架答案:C4.清洗玻璃器皿用的洗涤剂主要有（）。
A:肥皂B:铬酸洗涤液C:洗衣粉D:洗洁精答案:ABCD5.下列关于培养室的说法正确的是（）。
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第十章原生质体培养
✧教学目的与要求：
✧深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以
及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。
第一节、原生质体研究概况
一、原生质体的概念
✧原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露
细胞。
二、原生质体研究进展
✧据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再
生植株（1993）。
其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。
三、原生质体研究的意义
✧1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟
了道路。
2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。
3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
第二节、原生质体的制备
1、用于分离原生质体的材料准备
✧无菌试管苗叶片
✧上胚轴和子叶
✧培养细胞
2、酶处理
✧原生质体分离常用的商品酶
✧纤维素酶类
✧果胶酶类
✧半纤维素酶
酶溶剂及其渗透压
✧酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。
✧渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。
✧酶浓度及酶解时间
✧酶解时间
✧酶浓度酶解温度
3、原生质体的收集和纯化
✧飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。
✧P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。
渗透压很低(<20m o s m／k g H2O),
粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。
由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。
此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
✧F i c o l l
✧F i c o l l是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／m l仍
未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
✧以火炬松胚性细胞悬浮培养系为试材，原生质体纯化采用漂浮法，上层为6%的
F i c o l l溶液，下层为9%的F i c o l l溶液，1000r/m i n离心5m i n后，原生质体悬浮于
上层。
✧普通马铃薯四倍体栽培种"甘农薯2号"、"F a v o r i t a"、"R u s s e t B u r b a n k"试管苗叶
片为材料来源,游离培养马铃薯原生质体.结果表明,游离前材料的低温预处理,酶解前对组织和酶液进行真空渗透处理,均能显著提高原生质体产量.用F i c o l l密度梯度离心法收集原生质体进行培养,结果表明第三、四层界面的原生质体有较好的培养效果.
✧沉淀法
✧常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用P e r c o l l飘浮一次。
4、原生质体活力检测
✧目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
✧F D A法：F D A（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，
在活细胞内，F D A被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。
✧伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，
因而可以通过细胞被染色与否确定活性。
5、影响原生质体活力的因素
✧分离材料的生理状态
✧酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压
✧分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间
✧环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
第三节、原生质体培养
一、培养基
1．渗透压
✧常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。
✧原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。
2．无机盐
✧大量元素浓度；
✧N O3－和N H4+的比例；
✧C a2+浓度
3．有机成分
✧维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。
4．激素
✧常用的激素：N A A、I A A、B A与2,4-D
四、原生质体培养方法
✧液体浅层培养
✧固体培养
✧液体－固体双层培养
✧琼脂糖珠培养
✧用适温的琼脂糖液与提纯的原生质体液混合均匀，然后以0.5m l左右的液滴滴入
培养液中，待形成琼脂糖珠后，震荡培养的一种方法。
五、愈伤组织形成和植株再生
✧细胞分裂与细胞壁再生
✧愈伤组织形成
✧愈伤组织分化
✧植株再生
第四节、影响原生质体培养的主要因素
一、基因型
✧较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所
控制的。
✧D u d i t s等（1991）用苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a)不同基因型做了较深入的研究，
认为有某个基因型在离体培养时难以形成细胞胚。
二、原生质体的来源
✧供体材料体类型
✧供体细胞的分化程度
✧供体细胞的生长同步性
三、起始培养密度与培养基
✧基本起始密度
✧培养基激素水平
✧密度与培养基营养成分完全性
四、原生质体培养中的一些生理问题
✧细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径（例如苯基丙烷途径
p h e n y l-p r o p a n o i d r o u t e）的酶系统，结果形成了植物抗毒素(p h y t o-a l e x i n s)和如木质素一类的结构多聚物。
✧有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的，例如在甜菜原生质体制备时由
于某些酶的活性增强使得形成类脂过氧化物(l i p i d p e r o x i d e s)，结果引起原生质膜的氧化损伤。
而对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致(P e r l
A e t a l.,1991)。
✧许多次生化谢产物被认为是植物在抵御物理、化学和生物侵袭等不良环境中起
重要作用，因此胁迫因子不可诱导其合成。
✧D i c o s m o证明真菌诱发因子对于刺激或诱导一些培养物产生植物毒素最有效。
例
罂粟中的血根碱、茜草科中的蒽醌，长春花中的吲哚生物碱。
诱发因子包括高压灭菌的菌丝悬浮液。
✧R o k e m试验中发现添加真菌丝体对三角叶薯芋悬浮培养物中薯芋皂苷含量影响
✧产量日对照约134m g/L增至230m g/L。
2．修复机理
✧原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。
使原生质体中细胞骨架的组分、
结构、方向发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变(S i m m o n d D H.,1991)，同时也会干扰质膜的蛋白质系统。
✧原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力，细胞壁再生的能力及细胞骨
架的修复修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。
3．细胞脱分化与细胞分裂
✧分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行。
✧细胞在培养初期的一些变化，如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓，核蛋
白体增加等，与此同时D N A开始复制，随后染色质变浓，原生质体脱分化成为类似分生组织状态的细胞。
✧原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子：细胞壁的再生、细胞
骨架的修复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期（G2期细胞具有较高的分裂频率）。
✧另外，细胞壁的再生与D N A的合成协调与否也会影响细胞分裂。
五、原生质体研究的趋势
✧低密度和单个原生质体培养；
✧原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用；
✧单倍配子体如花粉原生质体培养；
✧计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。
思考题
✧1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。
✧2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？
✧3．影响原生质体培养的主要因素。
✧4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点。
✧5．性细胞原生质体的种类、分化途径及应用领域。
✧6．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？。