组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程
HE染色 方法步骤
“HE 染色过程”
试验前准备: 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片
试剂名称:无水乙醇,氨水,冰乙酸,盐酸,二甲苯,中性树胶，HE 染液
配制试剂:
1%盐酸乙醇分化液配制：
36%—38%盐酸：1ml
75%乙醇：99ml
1、0.2%氨水配制:
25%—28%氨水：0.2ml
自来水：100ml
pH 值在7.5—8之间
试验过程：记录试验的具体步骤，
1，烤片：2小时，温度60℃（目的：使组织切片与载玻片贴合的更加紧密）
2.切片脱蜡至水：
①二甲苯Ⅰ：10min
②二甲苯Ⅱ：10min
③无水乙醇Ⅰ：5min
④无水乙醇Ⅱ：5min
⑤95%乙醇：2min
⑥90%乙醇：2min
⑦80%乙醇：2min
⑧70%乙醇：2min
⑨自来水洗：2min
3.染色：
①苏木精染色：10min
②自来水洗：1min
③1%盐酸乙醇分化：数秒
④自来水洗：1min
⑤0.2%氨水返蓝：30s±
⑥自来水洗：1min
⑦伊红染色：5min
⑧自来水洗：速洗
4. 37℃烘干0.5h以上，中性树胶封固。
石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色详细步骤石蜡切片和HE染色方法与步骤1(取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。
取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。
注意事项:(1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2(固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。
注意事项:(1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
(3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
(4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3. 脱水50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。
每级0.5h。
注意事项:(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
(2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
(4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
(5)如需过夜，应停留在70%酒精中。
(6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象4. 透明1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。
石蜡包埋和HE染色的制作过程
步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
步骤一：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。
切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
步骤四：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。
苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。
伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。
染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
酒精用了2次先有低到高，再有高到低，这是为什么？步骤五：染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
————又要脱水！⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。
步骤六：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
又要用一次无水酒精，这是为什么？步骤七：封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。
组织块石蜡包埋
组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。
固定时间以12-24h为宜。
（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,无水乙醇Ⅱ30min。
可将组织放于70%酒精中过夜。
5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。
6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。
先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。
（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。
7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。
（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。
一般切片厚度为4-6μm。
贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。
做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。
HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。
蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术
蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术【实验目的】了解蜡块包埋切片、冰冻切片及HE染色的应用范围，了解染色的原理，掌握其操作方法。
【实验原理】切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。
在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。
切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。
【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片（二）材料：洋葱根或小鼠肝（三）试剂：福尔马林溶液（甲醛含量为35%至40%(一般是37%)的水溶液，也加入10%—15%的甲醇防止聚合）、苏木精、伊红、无水乙醇、1%盐酸-酒精（70%酒精99ml+浓HCl 1ml）、二甲苯、石蜡、加拿大树胶A：0.5~1% 的伊红酒精溶液：称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。
以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列减少) 苏木精 6 g无水乙醇 100 ml硫酸铝钾 150 g蒸馏水 2000 ml碘酸钠 1.2 g冰醋酸 120 ml甘油 900 ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
【方法与步骤】光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。
这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。
石蜡 包埋 H-E染色
石蜡包埋H-E 染色法一、固定（12-24小时）免疫组化实验要求固定不超过24h，4℃保存可延长时间。
1、磷酸缓冲中性甲醛（10%）免疫组化。
甲醛原液100ml蒸馏水900mlNaH2PO4·H2O 4gNa2HPO4 6.5g固定24-72小时，流水冲洗（过夜），酒精脱水的起始浓度为30%。
2、4%多聚甲醛多聚甲醛4g蒸馏水100ml加温至60ºC左右，不时搅拌，成为乳白色液体。
再一滴滴地加2N NaOH, 并不时搅动，直到液体清明。
此时pHO高，需用1N HCL 使成中性（pH7.0-7.4）滴加时避免过酸或过碱，反复滴加影响甲醛液浓度。
3、4%多聚甲醛/0.1M磷酸缓冲液多聚甲醛4g0.1M磷酸缓冲液pH 7.2 100ml配法同上。
4、2.5%戊二醛/0.1M磷酸缓冲液25%戊二醛1ml0.1M磷酸缓冲液pH7.2-7.4 9ml二、脱水、透明1、由50%（1h）酒精开始，经70%(1h)、80%(1h)、90%(40min)、95%(40min)、100%(40min)×3，组织块要求2.5-3mm厚，3×3大小。
在3-5mm时，各级3-6小时，或稍大的在5-12小时，至一天。
70%内可长期保存。
在95%和100%酒精中时间不宜过长。
2、纯二甲苯透明20mi n×2.二甲苯透明，先经过无水酒精—二甲苯混合液（20min）在经过二甲苯（30min）混合液：1、无水酒精：二甲苯=2：1；（精细切片经过1、2、3，一般为2）2、无水酒精：二甲苯=1：1；3、无水酒精：二甲苯=1：2；三、浸蜡、包埋2.5mm厚动物组织石蜡20mi n×3缸 .58-60℃石蜡人组织30min×3缸.均在恒温箱内进行, 浸蜡温度是石蜡刚融化的温度，65℃。
包埋温度在70-72℃。
一般厚约5mm的实质器官，总的浸蜡时间为2-3小时二甲苯：溶蜡=1：1 30min (稍长也可)第一杯溶蜡60min第二杯溶蜡60min第三杯溶蜡30min , 然后用此杯溶蜡包埋四、切片与贴片甩干水后放入烤箱60-62℃， HE烤30min,免疫片子烤2h.烘烤至蜡片呈半透明状蜡块修整，切片5-10um.可用蛋白甘油混合液贴片，将已切离的蜡片担个的放在已涂蛋白甘油并已加有数滴蒸馏水的载波片上，然后在酒精灯上摇晃烘烤，此时注意控制水的温度勿过高，待蜡片平整后倾去片上的水。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。
本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。
IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。
可以选择使用高温或酶解等方法。
3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。
4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。
5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。
6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。
7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。
8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。
HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。
3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。
4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。
5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。
6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。
7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。
8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。
以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。
通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。
免疫组化、HE染色步骤
骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。
2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2 次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。
4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。
5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I 1小时，石蜡II 1小时。
6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。
7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。
免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min 二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。
2.水化：100%酒精1（2min） 100%酒精（2min） 95%酒精（2min） 80%酒精（2min） 70%酒精(2min) 。
3.PBS冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min ,自然冷却至室温。
5.PBS冲洗3次，每次5min。
6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。
7.PBS冲洗3次，每次5min。
8.滴加1抗（GFP 1：100稀释, 4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。
10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min, PBS冲洗3次，每次5min。
11. 滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min, PBS冲洗3次，每次5min。
12.DAB显色5min。
13.自来水冲洗10min。
14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。
15.自来水冲洗10min。
he染色步骤HE实验步骤
he染色步骤 HE实验步骤动物病理切片小结[样本处理]动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min)[固定]4%多聚甲醛固定。
[石蜡切片]取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗处理Mice:脱水50%乙醇 2-3h170%乙醇 1-2h80%乙醇 1h95%乙醇 2h(1h+1h)100%乙醇 2h(1h+1h)透明二甲苯 35min+35min浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡)[HE染色]脱蜡二甲苯? 15min二甲苯? 15min二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min无水乙醇? 2min无水乙醇? 2min95%乙醇 2min85%乙醇 2min70%乙醇 2min50%乙醇 2min蒸馏水 5min(如果是DAB染色要抗原修复)HE染色苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min)冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱片)2含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快氨水反蓝 >10min伊红 10s冲洗固定脱水95%乙醇 2min100%乙醇? 2min100%乙醇? 2min二甲苯? 2min二甲苯? 2min 树胶封片组织浸蜡-常规石蜡切片制作组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。
组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。
组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。
当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里3面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。
石蜡包埋与HE染色
组织的石蜡包埋与切片一、石蜡包埋（1）取材。
将需要石蜡包埋的组织取下，并放入1×PBS 中清洗。
（2）组织固定。
将组织放入4%多聚甲醛（或4%甲醛）中固定24 小时至48 小时。
（3）逐级酒精脱水。
75%酒精→ 85%酒精→ 95%酒精I→ 95%酒精II→ 100%酒精I→ 100%酒精II，将组织块在各级酒精中浸泡1 小时，脱去组织中的水分。
（4）二甲苯透明。
二甲苯I → 二甲苯II 各15 分钟，或适当延长二甲苯浸泡时间，直至组织透明为止。
（5）浸蜡。
将淋巴结组织及其标签按顺序依次放入液体石蜡中（60℃孵育箱），依次浸润石蜡I → 石蜡II → 石蜡III，分别浸润20 至30 分钟（可依据组织的大小调整浸蜡时间）。
（6）包埋。
将已经充分浸润液体石蜡的组织进行包埋，包有组织的石蜡块自然冷却并凝固后存放于4℃冰箱。
二、组织切片（7）使用leica 切片机进行组织切片，每张切片的厚度约为4 至5 μm。
（8）将含有组织的石蜡切片放于39~40℃水浴锅，使组织切片充分展开。
（9）使组织切片贴于载玻片上，避免气泡产生。
（10）烤片。
把已贴有组织的载玻片放在60ºC 烤箱中过夜，可观察到玻片上的石蜡溶化成泪滴状，准备进行HE 或免疫组织化学染色。
苏木精&伊红染色（Hematoxylin and eosin stain, H&E stain）（1）切片脱蜡至水。
二甲苯I →二甲苯II →二甲苯III 各10 分钟；100%酒精I →100%酒精II → 95%酒精I → 95%酒精II→ 85%酒精→ 75%酒精→蒸馏水各5分钟。
（2）苏木精染细胞核。
苏木精溶液染2~3 分钟后，置于清水中漂洗。
（3）盐酸酒精分色。
显微镜下观察，如果染色过深，用1%的盐酸酒精（75% 酒精配制）脱色数秒，可将胞浆非特异性染色脱去。
（4）返蓝。
将玻片置于蒸馏水中5 分钟，使苏木精着色逐渐变蓝。
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）②脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡Ⅰ1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡Ⅱ中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
③包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡Ⅱ倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
组织切片染色步骤
组织切片染色步骤
组织切片染色的步骤通常包括以下几个阶段：
取材：从生物体中取出需要研究的组织结构。
固定：使用适当的固定液将组织固定，以保持其结构稳定。
脱水：通过不同浓度的乙醇溶液对组织进行逐级脱水。
透明：将脱水后的组织依次浸泡于二甲苯中，使其变得透明。
浸蜡：将透明的组织依次浸泡于石蜡中。
包埋：将液态的石蜡倒入模具盒中，再将浸好蜡的组织块放入，待石蜡凝固后修整蜡块。
切片：使用微切机将包埋后的组织切成薄片。
脱蜡：将切片通过脱蜡过程，使其恢复到水合状态。
染色：常用的染色方法有HE染色（苏木素-伊红染色法），以及其他特殊染色如Masson染色、PAS染色等。
在实际操作中，每一步都需要精确控制时间和温度，以确保染色效果的准确性和可重复性。
此外，不同的染色方法适用于不同的组织结构和研究目的，因此在选择染色方法时应根据实际需要来决定。
石蜡包埋的组织切片或冰冻切片HE染色
抗原修复工作液：9ml A＋41ml B＋450ml 水，调Ph＝6.0＋－1PV9000 两步法免疫组织化学1．石蜡切片脱蜡至水（烤箱温度56度，30分钟）二甲苯5min × 3100％乙醇5min × 290％乙醇5min × 180％乙醇5min × 1双蒸水 5min × 2PBS 浸泡5min 。
或陈老师方法：二甲苯室温2次，20min/次；100％、90％、70％乙醇各5min；PBS 5min 2．抗原修复微波预热抗原修复液（工作液）至沸腾。
取预热预热抗原修复液浸泡切片于株型容器中，放入微波炉中，中火， 5～10min，有修复液损失后，补充预热抗原修复液，继续，持续到10min左右。
取出容器，于室温等到修复液自然冷却 20～30min。
3．3％过氧化氢室温孵育5～10min， PBS冲洗，2min ×3；3％过氧化氢室温孵育5～10min，PBS冲洗，2min ×3；血清封闭15～30min，PBS洗一次；4．滴加一抗工作液（1：100），37度2h，或4度过夜，PBS洗，2min ×3；5．滴加检测试剂，室温或37度孵育30～60min，PBS洗2MIN×3，接DAB显色约20min （室温，镜下观察），5．滴加试剂1，室温20min，PBS洗，2min ×36．滴加试剂2，室温20min，PBS洗，2min ×37．DAB显色5～20min，镜下观察，适时终止。
8．自来水洗，复染（苏木素，90s，自来水冲洗，15min），脱水，透明，封片。
复染；苏木素，室温 30s，自来水冲洗，15min（如需要可0.1%HCL分色，0.1%氨水/PBS返兰）脱水：70％乙醇，5min × 190％乙醇5min × 1100％乙醇5min × 2透明：二甲苯，10min× 2封片：中性树脂。
组织包埋、HE染色
组织包埋、HE染色石蜡切片的制作及HE染色1．取下的新鲜脾脏组织于10%甲醛固定液中固定，一般24h。
睾丸组织用Bouin固定液固定24h。
Bouin配方：苦味酸 75ml甲醛20ml冰醋酸5ml2．将相应的组织放入包埋框中，做好标记，进行脱水，包埋：70%酒精24h→80%酒精2h→ 90%酒精2h→100%酒（一）30min→100%酒精（二）30min → (脱水，将组织中的水溶于酒精中）酒精：二甲苯（1：1）25min → 二甲苯25min （酒精溶于二甲苯，将酒精置换出来）→ 石蜡（一）45min → 石蜡（二）45min （二甲苯石蜡互溶，让石蜡浸入组织）→ 包埋3．石蜡包埋后，将蜡块于4℃保存。
4．切片：切5μm厚度。
组织切片于65℃烤箱中过夜。
5．染色：37℃烤箱二甲苯（一）15min↓37℃烤箱二甲苯（二）15min（将组织中的蜡脱出）↓100%酒精（一）5min↓100%酒精（二）5min↓90%酒精5min↓80%酒精5min↓70%酒精5min（将二甲苯置换出）↓三蒸水5min ×2次↓苏木素5min（将细胞核染为蓝色）↓流水冲10min↓1%HCl中荡4下（分化，是胞核着色清楚，包浆脱色，利于之后用伊红染包浆）↓流水冲10min（洗后看片，若着色浅可复染）↓水溶性伊红5min（染包浆，不同成分红色深浅不一）↓70%酒精中荡4下↓80%酒精中荡4下↓90%酒精中荡4下↓100%酒精（一）1min↓100%酒精（二）1min↓二甲苯（一）15min↓二甲苯（二）15min（是片子中午水分便于切边长期保存）6．封片：用histomount封片，37℃烤箱中过夜。
7．显微镜下观察切片，拍照保存图像数据。
Live Scaling Measure着色情况与组织或细胞的种类有关0.5~1% 的伊红酒精溶液：取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。
组织病理切片以及HE染色
组织病理切片以及HE染色（一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。
（二）实验步骤：一、制作切片1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。
2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。
脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。
组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。
在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。
组织染色后也要进行透明。
最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。
组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。
用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入。
为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。
一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃。
组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。
这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。
石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。
用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。
但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。
3、切片、制片石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，以前者为多用。
切片厚度一般为3-5μm。
切片时先将组织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30％的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40℃恒温热水器中。
也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。
二、HE染色1. 二甲苯脱蜡2×10 min；2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min；3. 95％、80％乙醇各l0 min，自来水洗l min（不要让急水直接冲至载玻片上的组织），蒸馏水洗1min；4. 苏木素染色4 min，自来水洗2 min；5. 1％盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗2 min；6. 1％稀氨水返蓝30s（镜下控制），自来水洗2分钟，蒸馏水洗1min；7. 伊红染色90s；8. 80％乙醇脱水10s，95％酒精10s，无水乙醇5min；9. 无水乙醇10min；10.二甲苯2×10 min；11.中性树胶或加拿大树胶封片。
石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色详细步骤
一、石蜡切片制备
1、收集样品：根据样品的性质和形状，选择适当的采样工具和采样
容器，将样品采集到容品中并制冷处理，以防止样品发生腐败。
2、石蜡制备：在制作石蜡切片之前应先量出所需的石蜡，并将其放
入容器中，然后加入酒精等助剂加热溶解，当石蜡完全溶解熔融后，用桶
或温度控制的水浴加热，随着温度的升高，搅拌均匀，使石蜡液完全熔化，熔化后即可用于制作石蜡切片。
3、制备切片：将样品置于熔融石蜡中，用切片机将样品切成指定的
厚度，以便用于染色；将薄片分类清洗，用干净的棉棒涂上几滴石蜡，使
其连接牢固，然后放在凉爽的干燥地方。
二、HE染色
1、润湿：将样品片放入石蜡解决液，轻轻摩擦，使其充分润湿。
2、酒精消切：将石蜡解决液滴入被润湿的样品片，轻轻摇晃，完成
样品的酒精消切。
3、甲醛处理：将样品片放入含醛的苯乙酮溶液中，经摇晃后再放入95%乙醇中搅拌，使样品片可以完全吸收醛，促使样品受醛处理，使样品
片充分脱脂，加快染色效果和特殊部位的显示。
4、HE染色：将脱脂的样品片放入无菌玻璃容器内。
HE染色protocol
HE染⾊protocol常规HE染⾊⽯蜡包埋的组织切⽚必须经过脱蜡⽔洗处理才能染⾊，让⽔溶性染料渗⼊组织中，含蜡的组织切⽚⽆法进⾏任何染⾊。
所以，在染⾊前必须⽤⼆甲苯或替换剂进⾏彻底脱蜡，经过⼄醇洗后，再⽤⽔洗。
即⽯蜡组织切⽚→⼆甲苯→⼄醇（⽆⽔⼄醇，95%，80%）→⽔。
⼈们通常把这个过程叫做切⽚脱蜡⾄⽔。
脱蜡⾄⽔是染⾊前的必须完成的基本步骤。
⼀般脱蜡⾄⽔的时间和步骤如下：HE染⾊脱蜡⾄⽔步骤步骤顺序试剂时间1 ⼆甲苯Ⅰ脱蜡 5 min2 ⼆甲苯Ⅱ脱蜡 5 min3 ⼆甲苯Ⅲ脱蜡 5 min4 ⽆⽔⼄醇浸洗 1 min5 95%⼄醇Ⅰ浸洗 1 min6 95%⼄醇Ⅱ浸洗 1 min7 80%⼄醇浸洗 1 min8 ⾃来⽔冲洗3-5 min冰冻切⽚和细胞涂⽚样品的染⾊不需要经过脱蜡⾄⽔步骤，⽔洗后直接⽤苏⽊精和伊红染⾊。
染⾊是利⽤染料的不同作⽤，使组织与染料以不同⽅式进⾏结合。
常规染⾊是苏⽊精和伊红染⾊（H.E）。
特殊染⾊（special stains）和组织化学（免役组织化学）染⾊是根据诊断的需要对组织中的某些成分进⾏⾮常规的染⾊。
HE染⾊⽤的苏⽊精是⼀种树⽊苏⽊的⼀种氧化产品，因为这种树⾮常罕见，多数氧化苏⽊精是合成品。
苏⽊精必须氧化成熟后才能使⽤。
苏⽊精染液需要预先配制，放置⼏个⽉⾃然氧化成熟。
或购买成熟过的商品苏⽊精，也可在苏⽊精液中加⼀些成熟剂。
苏⽊精本⾝对组织没有染⾊作⽤，需要“媒染剂”与组织连接，媒染剂是铁，铝，钨等由这类正离⼦⾦属提供。
矾也是苏⽊精常⽤的媒染剂，如Harris苏⽊精的配制以硫酸铝钾（钾明矾）或铵明矾作为媒染剂。
不同媒染剂配制的苏⽊精染⾊强度不同。
苏⽊精作为⼀种基础染料对细胞核的核酸具有⼀定的亲和⼒。
苏⽊精不是“退⾏性”就是“进⾏性”染⾊，退⾏性染⾊是把切⽚在染液内留⼀段时间，然后从染液⾥出来⽤盐酸⼄醇分化，去除过染的⼀部分。
这种⽅法最适合⼤批量的染⾊。
进⾏性染⾊切⽚在染液中染到⾃⼰想要得染⾊强度。
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3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。
4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。
5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。
苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。
12、80%乙醇5min
13、伊红液（95%乙醇溶液）3~30seconds
14、95%乙醇Ⅰ1min
Ⅱ5min
15、无水乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5min
16、二甲苯+乙醇（1：1）5min
17、二甲苯Ⅰ5min
Ⅱ5min
Ⅲ5min
18、中性树胶封片。
HE染色注意事项：
1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
Ⅱ5min
3、95%乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5mn
4、80%乙醇5min
5、70%乙醇5min
6、D．W．3~5min
7、Harris苏木素液5min（冬天可适当延长，eg.20min）
8、水洗
9、0.5%盐酸酒精分色3~10seconds，镜下观察
10、水洗蓝化15~30min（注意换水）
11、70%乙醇5min
（注：脱水透明esp.透明时间可适当延长）Ⅱ10min
5、浸软蜡（50~52℃）（二道）Ⅰ30min
Ⅱ1h
6、浸硬蜡（58~60℃）（二道）Ⅰ30min
Ⅱ30min
7、包埋：注意温度、切面。
三切片
修、切、展、贴、烤（烤片55~60℃）3~10h
四HE染色
1、二甲苯脱蜡五道，每道5~10分钟
2、无水乙醇Ⅰ5min
组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程
一取材和固定
取材后经固定24小时（4%PA灌注取材的后固定6~8小时）以后，流水冲洗24小时，置于70%~80%乙醇中，可长期保存。
二脱水和包埋
1、95%ALC（二道）Ⅰ2~4h
Ⅱ2h
2、无水ALC（二道）Ⅰ1.5h
Ⅱ1h
3、二甲苯+无水乙醇（1：1）20min
4、二甲苯（二道）Ⅰ10min