自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钻，严禁吸入和食入

反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。

需要自己配置的其他物品：

除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览:

产品概述:

特异性：TUNE反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的

primary DNA 链断裂

实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或

不完全。空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA

断裂处。两种情况均能产生假阴性。

假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段

DNA 链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出

现。两种情况均能产生假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真

进行每种细胞的形态学检查

凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于

可以结果进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数

样本：细胞离心涂片和细胞涂片

在chamber slides 上培养的黏附细胞

冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本

分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透

检测次数：一个试剂盒50T

试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15〜-25 C可稳定至标签

上标明的效期

步骤和所需材料：1流程图：2样品准备

2.1黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片需准备的其他试剂：Washing buffer :磷酸盐缓冲液（PBS

Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3%H2O2

Fixation solution 固定溶液：PBS配制的4%多

聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制

Permeabilisation solution 渗透液：

0.1%Triton 1 X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，

新鲜配制

步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程

注意：固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照

2.2组织部分

221福尔马林-包埋组织

福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。如用蛋白

酶K,不含核酸酶，浓度、孵育时间和温度应按组

织类型优化

注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K，因其经检

测不含核酸酶，核酸酶可导致假阳性。

另外3中替代方法在下表中描述（step

2）

需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95% 90% 80% 70%溶于双蒸水中）

Washing buffer : PBS

蛋白酶K,不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml ,

溶于10mM Tris/HCL 中，ph7.4-8]

替代处理方案

1）

※渗透溶液：0.1%Triton 1 X-100，溶于0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制

※胃蛋白酶* （0.25%-0.5%,溶于盐酸中，ph2）

或胰蛋白酶*, 0.01N HCL,不含核酸酶

探0.1M柠檬酸缓冲液，ph6,微波照射

步骤：下表描述了用蛋白酶K （不含核酸酶）和3中替代方法预处理

福尔马林-包埋组织的方法

注意：加入额外的组织用于阴性和阳性对照

222 冰冻组织处理（略）

3标记草案

3.1开始之前

准备TUNE反应混合液：每一对管子（小瓶1:酶溶液，小瓶2:标记溶液）足以用于

50ul反应体系的10张片子，和2个50ul标记溶液的阴

性对照。注意：TUNEL反应混合液应于用前临时配

制，不能储存。TUNEL反应混合液用前置于冰上

需准备的其他试剂：微球菌核酸酶或

DNase I，重组，级别1*

对照：每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应

3.2黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案

需准备的其他设备和试剂：Washing buffer : PBS

湿盒

Parafilm 石蜡封口膜或盖片步骤：参考下表

3.3困难组织标记草案（略）

3.4信号转换

需要准备的其他设备和试剂：Washing buffer : PBS

湿盒

Parafilm 石蜡封口膜或盖片

DABA底物或POD替代底物

光镜镜检封固剂

步骤：按照下表操作

4.附件：