免疫实验结果分析

表中1～5结果无效，6、7结果可靠
染色失败原因：
均为阴性
均为弱阳性（除阴性对照）
背景染色过深
阳性对照好，待检标本弱阳性 阳性对照无背景，待检标本背景深
判断原则：
实验设计 抗体选择 抗原定位性
抗原分布不均一性
假阴性常见原因：抗原丢失或减弱
抗体失效或稀释度不当 操作失误 假阳性常见原因：抗原弥散 抗原异位表达 瘤细胞吞噬 病变中正常组织残留 抗体交叉反应 内源性物质着色
四、阳性标记强度特征
依照细胞阳性
着色程度（抗原含量），可分为弱阳性 （ + ）┅ 1 分；中等阳性（ ++ ）┅ 2 分；
强阳性（+++）┅3分。依照阳性细胞数
量，可分为：弱阳性（+ ，指阳性细胞 数在25%以下）┅1分；
中等阳性（ ++, 指阳性细胞数在 25%—
49%) ┅2分；强阳性（+++ ，指阳性细 胞数在50%以上) ┅ 3分。目前多采用积 分综合计量。计算公式：两者相乘（或 相加）。大多主张 <3者为阴性，>4者为
绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；
免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）则 表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐
黄色粗颗粒，后者耀眼易见。图像摄影 ，原则上多取强阳性区域。
二 、 阳 性 标 记 细 胞 学 特 征 （ 以 HRPDAB/H2O2为例） 可分为①胞膜型；②胞核 型；③胞质(浆)型；④微绒毛型和⑤复合型 （胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒 毛 - 胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与 抗原所在部位相关联，但应注意排除因组 织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是 复合型图像。
对照结果判断：
阳性对照 1 2 3 4 5 6 7 （－） （＋） （＋） （－） （＋） （＋） （＋） 阴性对照 （－） （＋） （＋） （－） （－） （－） （－） 替代对照 （－） （＋） （－） （－） （＋） （－） （－） 检测结果 （－） （＋） (＋)(－) （＋） （＋） （－） （＋） 结果判断 抗体失活，操作有误 非特异性染色 阴性对照内含定位抗原 阳性对照不含定位抗原 非特异染色 检测标本不含抗体结合可靠 检测标本含抗体，结果可靠
⒌对免疫组化标记结果的意义不能
绝对化，应结合临床资料、 X 线等影像 学及实验结果综合分析。
* 第二节
对照染色设计
(一）对照染色的目的
设对照的目的是为了排除假阴性和 假阳性。假阴性的原因主要有三：①组织 处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗 体失活、效价过低或稀释度不合适（主要 指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗
假阳性是指实验切片呈阳性，阴性 组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结
果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰 ，试剂不纯，交叉反应等有关。
假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组
织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果
，谓之假阴性。其原因与组织处理不当， 组织细胞抗原丢失或试剂错误 ( 如漏加、 错加、失效、变质等),操作失误等有关。
漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的 pH
和离子强度不当等。
假阳性均系由多种因素造成的非特异
着色所致，原因主要有：①自发荧光或内
源酶等干扰；②抗体试剂不纯(特别是一 抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或 显色剂操作不当等；④Fc受体的干扰，等 等。
（二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为：阳性组织
指以缓冲液（PBS、TBS
等）取代第一抗体（主要的，必要时还
可做第二抗体及桥联抗体的空白取代） ，其他各步不变的试剂对照染色，结果 应为阴性。
⑵取代对照 指以所用方法第一抗体同源动
物的正常血清，或与本实验无关的抗体 ( 靶
生物缺如的 ) 取代第一抗体，其他步骤不变
的试剂对照染色，结果应为阴性。
⑶吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的
干扰等)；
③组织处理不当(组织固定不及时或固定 不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充 分所导致的游离试剂残留等)。
纠正的方法视原因而异，可在预实 验基础上，采用有针对性的纠正对策，
即对症下药(具体纠正方法不展开讲了，
同学们可以自己阅读讲义p123-126) 。
**第四节 阳性标记的形态特征和判断
免疫组化标记具有一定形态特点， 若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记
边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域
不作为判断依据，应用“正反法”原则。
免疫组化标准化：
抗原特异性 抗体交叉反应和标记谱系 方法规范化 结果综合分析和判断
第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤 不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性 或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。
⑷抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗
体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗
体）两者的混合物作试剂，其他步骤不 变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳 性着色应成比例的减弱（等量或 1 ： 9 ） 。此试剂对照多用于直接法。
阳性， >6 者为强阳性，至少随机观察 510个HPF,取其均值。
第五节
染色失败的可能原因
免疫组化染色的基本要求有二：①
实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜 明，背景着色浅或无，二者的比值应大 于 1 （阳性 / 背景）；②对照染色的结果 应附合要求。否则，所得实验结果都是 错误的，或为假阳性或为假阴性。
这类阴性试剂对照的选用原则是：
①空白对照不能省，其他对照在预实验
中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂 ；②对照必需与实验片同步进行染色； ③对照的结果应附合要求。
⒋自身对照
是指在同一标记切片上的自
身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原 阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构 的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与 阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除
结果的正确判断。内容包括定性、定位
和定量三方面。
免疫显色强度和阳性细胞密度是定
性定量指标，实际工作中常采用强度和
密度结合的方法综合计量，与抗原含量 有关；阳性细胞的着色形态及组织分布
特点主要是定位指标，与功能有关。
一、阳性标记免疫特征：分 " 弱 (+) 、中(++)、强(+++)"三级。免疫荧光法（ FITC为例） 则表现为浅绿色荧光、明显
定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部
位的阳性着色，一概不能视为阳性。
⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由 于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因
染源自文库方法灵敏度不够，而导致阴性反应， 判断时应注意。
⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕 和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶
免疫标记。因为这类阳性着色多系内源
干扰，或系人为因素所致。
性，目的是除外假阳性。
⒊阴性试剂对照
是指用于证实在免疫
组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗
体试剂的有效性和可靠性而所设立的同
步免疫染色对照，包括有：空白对照；
替代对照；吸收试验和抑制试验等。目
的在于除外假阳性和证实所用免疫组化 试剂及其技术方法的有效性和待检实验 切片免疫标记阳性结果的可靠性。
⑴空白对照
内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移
位造成的错误结果。
* 第三节 非特异染色
非特异染色是指免疫组化染色过程
中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳
性，又称背景着色，能严重干扰免疫组 化染色结果的正确判断，应竭力避免或 减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的 各个环节，可来自：
①内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源 性生物素等)； ②试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体
三 、 阳 性 标 记 组 织 学 特 征 （ 以 HRPDAB/H2O2为例） 免疫组化染色阳性细胞在 组织中的分布排列形式可以有如下 7 种：① 局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型； ⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主
要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和
阳性细胞在组织内的群体分布特点。
对照、阴性组织对照及阴性试剂对照
和自身对照四大类：
⒈阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原
的同源及不同源组织切片或细胞涂片与
待检实验切片同时作同样处理和免疫染 色的组织对照。正确的结果应呈现阳性 ，目的是为了证实所用免疫组化染色流 程的有效性，排除假阴性的可能。
⒉阴性组织对照
指用已证实不
含靶抗原的同步处理和免疫标记染 色的组织对照。正确的结果应为阴
免疫组化结果的分析和判断
第一节 免疫组化结果的判断原则
免疫组化结果的判断原则概括起来有 以下几点：
⒈必须同时设对照染色。没有对照染 色的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应 定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内； PCNA 及 p53 蛋白应定位在细胞核内； EMA 应