ABI SNP分型研究
SNP检测原理和应用
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同 的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。 电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小 有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变 性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降 低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时，DNA片 段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱 基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶 上形成不同的条带。
特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自 动 化 的 优 点 ， 对 未 知 SNPs 的 准 确 率 可 达 95% 以 上 。 但 DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高，容易产生误差， 不能检测出纯合突变。
阅微基因提供的SNP检测方法
基于荧光定量PCR平台的TaqMan探针法； 基于ABI遗传分析仪平台的SnapShot法； 基于Sequenom质谱仪平台的MassArray法
它包括单碱基的转换，颠换、 插入及缺失等形式。
SNP在基因组内的形式:
一是遍布于基因组的大量单碱基变异； 二是分布在基因编码区(coding region) ，称其 为cSNP，属功能性突变。
SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1）非转录序列要多于转录序列； （2）在转录区非同义突变的频率，比其他方式突变的频率
SnapShot法
该技术由美国应用生物公司(ABI)开发，基于荧光标记 单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等 通量的SNP分型项目。
在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多 态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体 系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪电泳后， 根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基 因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位 点。
SNP分型技术简介
SNP概念
SNP（single nucleotide polymorphisms ）单核苷酸多态性
是指在基因组水平上由单个核苷酸的改变所引起的DNA 序列多态性。
单 个 ？ 核苷酸 ？ 多态性 ？
突变 与 多态性
1. 多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以 上。否则就叫突变（小于1%）。 2. SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。 3. SNP一般来说，是全部体细胞一样的基因型。 4. 突变一般不是一个个体全部体细胞的变化。 5. 如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突 变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系；达到 了1%就是多态性了。
编码区snp有同义和非同义2种非同义突变由于会导致氨基酸的变化从而影响蛋白质的功能特别是发生在结构功能区域的snp尤其重要非同义突变虽然没有明显的功能的分子机制但是在遗传学上可能因为与附近的其它致病基因的表达或者snp连锁因此在流行病学上形成阳性结果一般以此解释
SNP分型简介
单核苷酸多态性分型 SNP技术交流QQ群：107750067
SNP研究的优势 1. SNP在基因组中每500-1000个碱基就有一个标记。无论是比 较于RFLP还是SSR（6000一个标记），都要广泛得多； 2. SNP在人群中是等位基因性的，在任何人群中其等位基因 频率都可估计出来； 3. 与微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码 区的SNP，而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出 现困难； 4. 部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构 或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制 的候选位点； 5. 易于自动化、规模化分析，缩短了研究时间。
公开的SNP 数据库：
MYH9和ABI2基因SNP在2型糖尿病人群中与血糖、胰岛素抵抗和血压的相关性
２１ ０ ２年 ３月
天 津 医科 大 学 学 报
Ｊｕｎ ｌ ｆ ｉｎｉ Ｍ ｄｃ ｌ ｎｖ ｒｉ ｏ ｒａ ｏ ａ ｊ ｅ ｉ ｉ ｓ ｙ Ｔ ｎ ａＵ ｅ ｔ
Ｖｏ ห้องสมุดไป่ตู้１ ．Ｎｏ １ ８ ．１
Ｍａ． ０ ２ ｒ２ １
１ ７
文章 编 号 １０ — １７ ２ １ ） １０ １— ４ ０ ６ ８ ４ （０ ２０ — ０ ７ ０
ａ ｐ ｒ ｅ ｉ ｎ ｅ ａ ｅ ｐ ｎｏ ｙ ｓｉ ｙ ｅ ２ ｄ ａ ｔ ｓｐａ ｉｎｔ ｎｄ ｈｙ ｅ ｔ ｎ ｏ ｒ ｌ ｔ ｄ ｈｅ ｔ ｐｅ ｎ ｔ ｐ ｉ ｂｅ ｅ ｔｅ ｓ ｓ
Ｙ ｉ Ｃ Ｉ ｈ ｎ ｙｕ， Ｉ ｅｇｊ ｎ ＬＮ ｈｏ， Ｈ ｎ ｔ ＬＮＪｎ－ ａ， ＨＥ ｉｍｉ Ｌ ｉｄｎ ’ ＵＰｎ ， Ａ ｕ — ｏ ＷＥ ｎ－ｉ ｇ， Ｉ ＧＣ ａ Ｓ Ｉ ｇ Ｃ Ｆ ａ Ｗｅ－ａ ， Ｉ ｇ ｎ Ｃ ＮＬ－ ｎ ， Ｉ － ｏ ｇ ｏ ｉ ｇ Ｗｅ （ ．ｅｅｒ ｅｔ ａｉ Ｍ ｄｃｌ ｃ ｎｅ， ｉ ｊ ｄｃｌ ｎｖｒｔ Ｔａｊ ００ ０ Ｃ ｉ ； ．ｅ ａ ｍ ｎ ｏＥ ｄ ｃ ｎｌ ｙＴａｊ １ ｓａｃ Ｃ ｎ ｒ ｆ ｓ ｅ ｉ ｉ ｃｓＴａ ｉＭｅ ｉ ｉｅ ｉ， ｉ ｉ ３０ ７ ， ｈｎ ２ ｐｒ ｅｔ ｆ ｎ ｏｒ ｏ ｇ， ｉ ｉ Ｒ ｈ ｅｏＢ ｃ ａＳ ｅ ｎｎ ａＵ ｓｙ ｎｎ ａ Ｄ ｔ ｉ ｏ ｎｎ
摘要 目的 ： 究 ＭＹ ９和 Ａ Ｉ 因的单核苷酸 多态性（ Ｎ ） ２型糖尿病人群 中与血糖 、 岛素抵抗及 高血压 的关系。方 研 Ｈ Ｂ２基 ＳＰ在 胰 法： 用基质辅助激 光解吸电 离飞行时 间质谱技术 ，对 ７ ３例 天津地区的 ２型糖尿病 患者 的 Ｍ Ｈ 应 ７ Ｙ ９基 因的 ８个 Ｓ Ｐ位 点和 Ｎ Ａ Ｉ 因的 ４个 Ｓ Ｐ位点进行基 因分型 ，以 Ｐ Ｉ Ｋ软件进行数量性状 的关联分析及基 因型交互作 用分析。结果 ： Ｈ Ｂ２基 Ｎ ＬＮ ＭＹ ９和
snp基因分型原理
snp基因分型原理SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是人类基因组中最常见的遗传变异形式之一。
它指的是单个核苷酸在DNA 链中的突变，通常体现为碱基的替换。
SNP的存在可以导致个体之间基因序列的差异，进而影响个体对疾病的易感性、药物反应以及其他生理特征。
SNP基因分型原理是通过检测SNP位点上的碱基发生变异来确定个体的基因型。
人类基因组中共有数百万个SNP位点，每个位点可能有两种或更多的碱基替代选择。
基于现代高通量测序技术的快速发展，我们能够对大规模的SNP位点进行检测和分型。
SNP基因分型的方法有多种，其中最常用的方式是通过PCR扩增和测序来检测SNP位点上的碱基。
通过与参考基因组序列比对，我们可以确定个体在该位点上拥有的是哪种碱基，并据此判断其基因型。
另外，还可以利用芯片技术进行SNP分析，该技术能够同时检测数万个SNP位点，大大提高了分型的效率。
SNP基因分型的应用非常广泛。
首先，SNP在疾病易感性研究中具有重要意义。
通过分析大规模的人群样本，可以发现某些SNP位点与特定疾病之间存在相关性。
这些位点常被称为疾病相关SNP（disease-associated SNP），通过进一步的研究我们可以了解这些位点对疾病的发生机制和进展起到的作用。
其次，SNP基因分型对药物反应的个体差异研究也具有重要意义。
不同个体对药物的代谢和吸收能力存在差异，这些差异通常与SNP位点上的碱基变异有关。
基于SNP基因分型结果，我们可以确定个体对某种药物的敏感性、代谢速度等因素，从而为个体化治疗和药物剂量的选择提供依据。
此外，SNP基因分型还在人类进化研究、亲子鉴定、种群遗传学研究等领域发挥着积极作用。
通过对多个SNP位点的分型结果进行比对和分析，可以推断个体之间的亲缘关系、种群之间的遗传关系，帮助我们更好地了解人类进化和种群形成的过程。
总之，SNP基因分型技术的发展为人类遗传学和生物医学研究提供了无限可能。
全基因组snp分型
全基因组snp分型
全基因组SNP分型是指对一个个体的全基因组进行SNP（单核苷酸多态性）分型，即确定个体在所有SNP位点的基因型。
SNP是指基因组中的单个核苷酸发生变异的位置，这种变异可能导致个体间的遗传差异。
全基因组SNP分型的目的是通过对大量SNP 位点进行分析，了解个体在基因组上的遗传变异情况，从而研究基因与个体表型之间的关系，以及个体之间的遗传相似性等。
全基因组SNP分型的方法主要包括SNP芯片技术和基因测序技术。
SNP芯片技术通过将已知的SNP位点固定在芯片上，通过杂交等方式检测个体的基因型。
基因测序技术可以对个体的全基因组进行测序，从而直接获得个体在所有SNP位点的基因型。
全基因组SNP分型可以应用于各种研究领域，如人类遗传学、疾病研究、个体化医学等。
通过分析个体在不同SNP位点的基因型，可以揭示基因与疾病之间的关系，以及个体对药物的反应等信息，为个体化医学提供基础数据。
ABI-StepOne-StepOnePlus实时荧光定量PCR系统
ABI StepOne/StepOnePlus实时荧光定量PCR系统美国应用生物系统公司是全球生命科学实验解决方案的业界领导者，现在推出了最新采用创新性技术的实时PCR扩增仪——StepOneTM（48孔）和StepOnePlusTM（96孔）实时PCR扩增仪。
这种实时PCR仪操作极其简单，它专门设计了易于使用、但功能强大的用户界面，非常适合不同经验的研究人员使用。
•性价比极高的三色/48孔（StepOne）或四色/96孔（StepOnePlus）系统，可以提供高精度的实时定量PCR结果•基于使用寿命长的LED的光学系统，可以检测多种荧光染料，用于基因表达分析、病原体定量检测、SNP（单核苷酸多态性）基因分型、以及阴性/阳性分析等多种实验•可以进行标准模式和快速模式PCR反应，快速模式可以在40分钟内完成PCR反应•极其紧凑的仪器设计，适合任何大小的实验室环境•LCD触摸屏和支持USB存储，使得系统配置更灵活，并且可以实现无PC操作•便捷的远程监控和电子邮件通知功能，可以节省宝贵的时间•具有独特的VeriFlexTM加热块，它具有六个可独立控制的Peltier加热块，极大地提高了系统的功能和温控的精度•StepOne系统可以升级到StepOnePlus系统，以满足不断提升的研究需要StepOne Software v2.0操作简便、但功能强大的定量PCR分析工具•实验设计向导，帮助您设计和设置实验•提供移液方案和配方，便于快速设置实验•高级设置，适用于需要更多灵活性以便进行更多复杂应用（如多重反应）的专家级的用户•快速启动设定，可以立即启动实验，并在稍后的时间再输入反应板信息•实时监控扩增曲线的增长，便于即时查看实验进程（可通过远程计算机进行监控）•自动基线和自动阈值选定功能，可以简化分析步骤•多图谱视图，可以同时观察四个视图评估数据•自动SNP（单核苷酸多态性）基因分型，具有直观的图表输出和质量评估•故障排除标记，帮助您诊断并解决实验中出现的问题•工具提示功能，当查看扩增曲线或是SNP分型的时候，方便识别不同样本孔•电子邮件通知功能，在实验开始或是结束的时候提醒您•便捷的剪切和粘贴功能•方便地导出为PowerPoint?、Excel?或.jpeg格式的文件7300型实时荧光定量PCR系统。
在ABI 7500仪器上进行KASP基因分型说明书
ManualRunning KASP genotyping on the ABI 7500 instrumentFor Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.Contents1. Introduction (3)2. Tips and suggestions before you start (3)3. Overview of the procedure (3)4. KASP thermal cycling conditions (4)4.1 KASP thermal cycling conditions (4)4.2 KASP recycling conditions (4)5. Step-by-step user guide (5)5.1 Define the experimental properties (5)5.2 Programme the plate setup (6)5.3 Program the run method (8)5.4 Run the thermal cycle including pre- and post-PCR reads (9)5.5 Analysis of results (10)5.6 Recycle the plate if necessary (11)5.7 Running the KASP trial kit on the ABI 7500 (11)6. Further support (11)1. IntroductionThis document is intended as a guide to running KASP TM genotyping reactions on the ABI 7500 instrument.KASP chemistry for allelic discrimination performs well on an ABI 7500 machine and this step-by-step protocol will enable users to successfully set-up, run and read plates on the 7500.2. Tips and suggestions before you start1. Optimal cycling conditions for KASP require a touchdown 2-step PCR protocol. The cyclingconditions for most SNP assays will be as described in this manual (section 4), although you must check the cycling conditions included in your SNP assay information pack to ensure that your assay does not have any specific cycling conditions.2. KASP is an endpoint chemistry and will require a final read once the PCR amplification steps havebeen completed. Completed KASP reactions must be read below 40 °C.3. In the 7500 software, a pre-read (before the thermal cycle) and a post-read (after the thermal cycle)should be included in the thermal cycle program.4. Data capture should not be performed during the thermal cycle program – no useful data will becaptured as KASP chemistry cannot be read at these temperatures. Reading the plate throughout the thermal cycle will unnecessarily reduce the lifespan of your instrument.5. The KASP recycling program will often will improve results, especially for assays that are slowto group.6. KASP is supplied with the HEX TM fluorophore but this has the same excitation and emissionspectra as VIC; they are therefore interchangeable. The ABI 7500 software only has an option for programing with VIC so ensure that you use this for the HEX allele.3. Overview of the procedure1. Define the experimental properties – see section 5.1.2. Program the plate set up including assay information and sample names – see section 5.2.3. Program the run method for KASP (including pre- andpost-read steps) – see section 5.3.4. Run the thermal cycle for your sample plate – see section5.4.5. Analyse the data – see section 5.5.6. Recycle the plate if necessary – see section 5.6.4. KASP thermal cycling conditions4.1 KASP thermal cycling conditions1. 94 °C 15 minutes2. 94 °C 20 seconds3. 61 °C 60 seconds (drop by - 0.6 °C/per cycle)Repeat steps 2-3 9 times (a total of 10 cycles) achieving a final annealing temperature of 55 °C4. 94 °C 20 seconds5. 55 °C 60 secondsRepeat steps 4-5 for 25 times (a total of 26 cycles)6. Read plate at less than 40 °C.4.2 KASP recycling conditions1. 94 °C 20 seconds2. 57 °C 60 secondsRepeat steps 1-2 twice (a total of 3 cycles)3. Read plate at less than 40 °C.* KASP cannot be read at temperatures above 40 °C. Turn off data capture for each of the cycling steps as this is not necessary.5. Step-by-step user guide5.1 Define the experimental properties• Open the ABI 7500 software• On the front screen, click on the‘Design Wizard’ button. This willopen up a new experiment. Thewizard will guide you through allstages of experimental setup.• In the Setup menu, the first stageis to define the ‘ExperimentalProperties’.• Step 1: Give your experimenta nameOptional – add in plate barcodeinformation, your user name andany comments relevant tothe experiment.• Step 2: Select the instrument that you are using (i.e. Standard or Fast)• Step 3: Select the experiment type – for KASP, this will be ‘Genotyping’• Step 4: Select ‘Other’ for the reagents type• Step 5: Select ‘Standard’ for the ramp speed• S tep 6: Tick the boxes to include a ‘Pre-PCR Read’ and an ‘Amplification’ stage inthe experimental run (Please note: Post-PCR Read is selected by default forgenotyping experiments).5.2 Programme the plate setup• Once the experimental properties are defined, click on the ‘Plate Setup’ menu.• Click on the ‘Create New SNP Assay’ button to open up the ‘New SNPAssay’ dialogue box. Fill in all the fields including a name for your assay.One allele should have FAM as the reporter and the other should haveVIC as the reporter. (HEX is the second fluorophore used in KASP, but thisis not an option in the 7500 software. VIC and HEX can be read at thesame wavelength).• Once you have created all the assays that you need for your experiment, assign these to the relevant wells of the plate. This is done by highlighting the wells, and then adding a tick to the ‘Assign’ column in the assay table.• Edit the sample names for the experiment. You can add new samples and display samples that have been defined in previous experiments.• Assign the sample names to the relevant wells of the plate. This is done by highlighting the wells, and then adding a tick to the ‘Assign’ column in the sample table.• Once the SNP assays and sample names havebeen assigned to the wells, ensure that the taskfor each well is correct. Highlight the relevantwell(s) and edit the task in the drop down menu inthe assay box. Unknown DNA samples should bedefined as ‘Unknown’ and No Template Controls should be defined as ‘Negative Control’.• Ensure that ROX TM is selected as the passive reference dye for the experiment.• The completed plate setup can be viewed from the ‘View Plate Layout’ tab.5.3 Program the run method• Once the plate layout has been defined, move to the ‘Run Method’ menu.• The “Run Method” menu is where you can edit the thermal cycling conditions.• Edit the default thermal cycle to the conditions required for KASP genotyping.• Ensure that the data capture symbol is on (i.e. in colour) for the first stage (30 °Cfor 1 min) so that the pre-read is performed, and for the last stage (30 °C for 1 min)so that the post-read is performed.• To programme the touchdown stage, you need to click in the ‘Enable AutoDelta’ box of the relevant cycling stage. Then click on the grey triangle next to the temperature (61 °C). This will open upCycling conditionsStage 11. 94 °C 15 minutesStage 21. 94 °C 20 seconds2. 61 °C 60 seconds. **Decrement -0.6 °C/per cycle**Set the decrement cycle using the ‘Auto Increment‘ tab.Repeat Stage 2 × 9 times (a total of 10 cycles) achieving a final annealing temperature of 55 °C.Stage 31. 94 °C 20 seconds2. 55 °C 60 secondsRepeat Stage 3 × 25 times (a total of 26 cycles)Stage 41. 37 °C for 1 minute. This will bring the reaction plate to the correct temperature for reading thefluorescence.10 cycles26 cycles• Select the minus sign (for a decrement) and 0.6 for thetemperature. This will ensure that the temperaturedecreases by 0.6 °C each cycle in this cycling stage(10 cycles). Click ‘Save Setting’ to return to the runmethod window. The triangle will now be green toindicate that AutoDelta settings have been programmed.• The remaining two setup menus are not required forKASP (‘Reaction Setup’ and ‘Materials List’).5.4 Run the thermal cycle including pre- and post-PCR reads• Once the experimental properties, plate setup and run method have all been programmed, you can begin the run.• Click on the ‘Run’ section of the experiment menu.• Ensure that the software is connected to the instrument, and then press the green ‘Start Run’ button.• The ‘Run Status’ will then change to ‘Running’ and the thermal cycle will begin.• Fluorescent data will be collected during the pre-read and post-read stages.5.5 Analysis of results• Once the run has completed, click on the ‘Analysis’ section of theexperiment menu.• Your genotyping data can be viewed by clicking on ‘AllelicDiscrimination Plot’.• If there are any anomalous wells (e.g. due to pipetting error), these can be omitted from the analysis. Right click on the well in the plate layout view, and select ‘Omit’.115.6 Recycle the plate if necessary• If your data has not formed tight clusters after the initial thermal cycling protocol, you canrecycle the plate in the ABI 7500 (or on a Peltier block) and perform a second post-read.• You will need to create an experiment file with the thermal cycling conditions for KASP recyclingconditions (see section 4.2).• The KASP recycling conditions are:1. 94 °C for 20 seconds2. 57 °C for 60 secondsRepeat steps 1-2 twice (a total of 3 cycles).Add a second stage (Post-PCR Read) at 30 °Cfor 1 minute to bring the plate to the correcttemperature for reading, and ensure that thedata collection symbol is on.• The data can then be viewed from the ‘Analysis’section of the experiment menu, using the‘Allelic Discrimination Plot’.5.7 Running the KASP trial kit on the ABI 7500• If you have requested a KASP trial kit to run on your ABI 7500 instrument, please follow theprotocol included with the kit to set up your reaction plate. This ABI 7500 manual can be used to help you to programme the instrument to run the trial kit reaction plate.• After running the KASP thermal cycle, the trial kit reaction plate should produce data similar tothe figure below.Results from the KASP trial kit reaction plate when run on the ABI 7500 instrument using the standard KASP thermal cycle and one recycle program.6. Further supportFor any queries about this manual, please contact ************************.Manual Running KASP genotyping on the ABI 7500 instrumentAll trademarks and registered trademarks mentioned herein are the property of their respective owners. All other trademarks and registered trademarks are the property of LGC and its subsidiaries. Specifications, terms and pricing are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your local sales representative for details. 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SNP分型
1、测序方法这个是最原始的，也是最简单的（操作简单，工作量不小啊！）一种方法，估计各位都明白，就不再累述了！2、Taqman探针法Taqman探针法可是一种无敌的方法，可用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等等，差不多只要能用到的分子检测技术都有Taqman的身影。
Taqman探针法SNP分型技术的核心就是特异性的MGB探针技术，已证实的Taqman探针，3·段结合MGB技术，能更好的进行等位基因的区分。
MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。
这种超强的稳定性可使短至13个碱基的探针提高错配的辨别力，并为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。
所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团（NFQ），它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。
Taqman探针法还有个好处据说AB公司能提供数以万计的现成探针，只要你付得起钱就可以了，什么可将illumina SNP芯片上的所有SNP位点都检测一遍。
Taqman探针法的缺点就是探针购买太贵，一般他们的试剂盒是1500人份的，价格可以咨询AB公司在国内的总代！1000份左右标本，几个位点用Taqman还是蛮核算的。
3、Beckman SNP genomestream技术Beckman技术的特点就是单碱基延伸法，设计时每个位点共设计3条引物，2条是扩增引物，1条为单碱基延伸引物（这个引物也可理解为探针）。
现在Beckman探针法可做到48重（也就是一次检测48个SNP 位点），引物及探针的设计可以直接提交给Beckman（这点同Taqman，不赚你，赚谁啊！），他们帮你有偿设计啊！Beckman的技术比较适合恰好有12个位点，48个位点检测，假如你的只有几个位点，或者恰巧不是12或48的倍数时，这个就有些不合算了！另外标本量不能太低，Beckman检测采用384板，一两百个样本那就算了吧！4、SNPshotSnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测SNP 设计的分析软件和试剂盒可对多个SNP 位点同时进行基因分型,也被称为minisequencing 。
美国应用生物系统公司实时荧光定量PCR技术
Calibrator Sample（基准样品）
目标基因 比如 内对照基因
IL-2 18S
得出相对于某一个样品的基因表达量, 1X sample. Treated vs. Untreated, 0 hr vs. 6 hr, Normal vs. Diseased…. Sample Calibrator 比如 处理后 处理前
荧光定量PCR原理
•TaqMan 探针法 •SYBR Green I 染料法
TaqMan 探针法
Polymerization
TaqMan® R Probe Q
5’ 3’ 5’
5’ 3’ 5’
Forward Primer
Reverse Primer
TaqMan 探针法
Displacement
R
5’ 3’ 5’
New Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents 高灵敏度SYBR Green PCR 混合试剂和逆转录PCR试剂
除模板和引物外, 该产品 已包含所有PCR反应所 需的全部试剂. 高灵敏度 , 高保真, 低背景. 可进行 实时PCR而不须用荧光 标记核苷酸探针.
ABI公司基因研究新技术报告会
9:00-9:50 9:50-10:40 11:00-12:00 实时荧光定量PCR技术的原理及应用进展 ABI公司分子生物学产品市场部经理 刘雪燕 基因突变和SNP分型技术进展 ABI公司分子生物学产品业务发展部部经理 杨林森 基因分析仪的应用 ABI公司分子生物学产品专家 陈云地 工作午餐 AB公司高内涵基因组分析试剂及其在肿瘤研究中的应用 ABI公司分子生物学产品业务发展部部经理 杨林森 基因和miRNA表达分析及其在干细胞研究中的应用 ABI公司分子生物学产品市场部经理 刘雪燕 定量PCR技术的应用 ABI公司分子生物学产品专家 陈云地 抽奖活动
片段分析软件GeneMapper+v3.0中文操作手册
美国应用生物系统公司片段分析和基因分型软件GeneMapper v3.0 中文操作手册（仅供参考。
请阅读英文原版手册。
）技术服务部x 2004年目录概述 (3)ABI PRISM GENEMAPPER V3.0中文手册 . LMS (4)一. 开机 (4)二. 输入P ANEL (4)三. 生成B IN (4)四. 定义A NALYSIS M ETHOD (5)五. 设置默认值 (5)六. 分析数据 (6)七. 编辑结果 (6)八. 创建自己的K IT、P ANE和M ARKER (6)ABI PRISM GENEMAPPER ID V3.1中文手册 . HID (7)一. 安装及登录 (7)二. 设置参数 (7)三. 分析数据 (8)四. 输出结果 (9)ABI PRISM GENEMAPPER V3.0中文手册 . SNP (10)一. 开机 (10)二. 分析片段大小 (10)三. 定义K IT、B IN S ET和P ANEL (10)四. 定义B IN和M ARKER (10)五. 定义S IZE S TANDARD和P REFERENCE (11)六. 分析数据 (11)七. 编辑结果 (17)八. 自动生成P ANEL (17)概述GeneMapper是高通量、全自动的DNA片段分析和基因分型软件，功能上相当于GeneScan、Genotyper和Template软件的整合，在应用上分为3类：以微卫星(STR) 连锁分析为基础的人和小鼠全基因组扫描，以单碱基延伸（微测序）为基础的SNP分析，和以STR遗传分析为基础的人、马、牛、羊亲子鉴定及身份认定。
其中GeneMapper ID v3.1是亲子鉴定的专用软件。
GeneMapper以Project为数据管理单位，Project之下又划分4个层次，从上到下依次为Kit、Panel (=Bin Set)、Marker 和Allele (=Bin)。
SNP查找及SNP的几种研究方法
SNP位点的选择1，如果是检测基因的所有已知的SNP，那么首先要去了解并查询到这些SNP位点，SNP 位点可以通过查询dbSNP数据库（/SNP/）和TSC（The SNP Consortium）数据库（/），可以获知基因及上下游邻近序列的SNP位点。
2，至于挑选的原则，可以介绍一下Hap Map的正规化标准：SNP Selection CriteriaCategory 1 "verified"This contains all SNPs for which we have allele frequency or genotyping data. This includes SNPs from the TSC allele frequency project, as well as SNPs characterized by JSNP. These SNPs were generated from those rs clusters in which at least one of the SNPs in the cluster contains genotype or allele frequency data and the minor allele must have been seen in at least two individuals.Category 2 "two-hit"These are true double-hit SNPs, produced in collaboration with Jim Mullikin and Sarah Hunt. A double-hit SNP must be seen twice, in two different DNA samples which must have produced two alleles. TSC trace data was only allowed to contribute one hit per allele because the individual source DNA for a trace could not be identified.Category 3 "jsnp-verified/perlegen-verified"This category contains two groups: SNPs that JSNP certifies are likely to be real based on manual inspection of their data (but have not been genotyped)，and SNPs that Perlegen verified independently.Category 4 "bac-overlap"These are SNPs from BAC overlaps that do not fall into category 1 or 2 above.我的经验：也可以从文献中查找，找好几个SNP位点，如果你样本量很大，那么很容易出有意义的结果。
snp分型解析
冯 静 2012.06.19
主要内容
• SNP相关知识 • SNP检测方法
什么是SNP？
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) ，单核苷酸多态性。
• 是基因组核苷酸水平上由单个核苷酸 变异引起的DNA序列的多态性。 • 包括单碱基的转换、颠换、插入、缺 失，其中最少一种形式在群体中的频 率不小于1％。
测序、质谱、TaqMan、SNaPshot、 HRM、Illumina芯片、……
1 直接测序法
primerL
• 客户指定检测SNP位点 • 每个位点均需经过PCR扩增然后测序 • 能发现已知和未知SNP位点 • 操作简单，但工作量大，成本较高 • 适用于少数几个位点及样本的检测
A
G
primerR
2 Taqman 探针法
5 质谱检测（Sequenom）
• 质谱仪通过对物质分子量（质荷比）进行检测，达到区分、 鉴别物质的目的。 • SNP位点两个等位基因之间存在分子量差异，通过实验将 差异放大，然后以质谱仪进行检测即可。
Allele 1
Unlabeled Primer (23-mer)
Allele 2
Unlabeled Primer (23-mer)
同一位点不同等位基因的区分根据峰的颜色可知掺入的碱基种类不同位点之间的区分根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的snp位abi3730测序仪检测单重位点检测gggaaaaa不同位点的引物带不同长度的尾巴颜色代表不同基因型大小代表不同位点不同大小扩增产物技术特点多位点同时检测每个反应可检测812个位点适宜检测的位点数为850个适用于多位点同时检测样本数不受限制可以是几十到几千在一定温度范围内将pcr扩增产物进行变性并实时检测荧光信号荧光值随温度变化即熔解曲线
SNP检测方法
SNP检测方法—SNapShot SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)，即单核苷酸多态性，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类中可遗传的变异最常见的一种，并作为第三代遗传标志。
人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因研究。
目前，SNP检测技术已经很成熟，主要有以下几种检测方法：TaqMan 探针法、HRM法、SNapShot法、dHPLC、illumina BeadXpress法等，本文主要针对SNapShot法进行阐述。
SNapShot法是一种新兴的SNP检测技术，该技术有美国应用生物公司（ABI）开发的，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，其原理是先根据基因序列，设计特异性的扩增引物及延伸引物，在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧邻多态位点5’端的不同长度的延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经过测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知渗入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。
SNapShot法操作简单、经济，可以在多种遗传分析仪上进行快速、准确地基因分型，实现了SNP分析的自动化，可以方便高效地用于高通量的SNP 验证及中通量的SNP筛选。
目前SNapShot技术广受科研人员的认可，国内耳聋基因SNP筛查、结合易感基因SNP位点筛查等用到的检测技术均为SNapShot技术，此外在nature、SCI等多个顶级杂志中也发表了多篇SNapShot技术相关的文献。
由此说明SNapShot技术在SNP研究领域中的地位在不断的提升，已成为SNP 研究中不可或缺的一部分。
北京阅微基因技术有限公司现拥有成熟的SNapShot技术平台，配备ABI3730xl测序仪及国内的杰出人才，实验结果准确、质量高，实验数据符合发表顶级杂志的要求，并提供相应的技术指导及疑难问题解答。
全基因组snp分型步骤
全基因组snp分型步骤1.引言1.1 概述全基因组SNP分型是一种用于分析人类基因组中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的方法。
SNP是指基因组中单个核苷酸的变异，这种变异可能与遗传疾病、药物反应等多种生物学特征相关。
全基因组SNP分型通过对整个基因组中的SNP进行分析，可以帮助我们了解人类基因组的个体差异，从而更好地理解遗传病理学、个体化医疗以及演化等方面的问题。
全基因组SNP分型的研究步骤包括样本准备、DNA提取和测序、数据处理和质量控制以及SNP分型算法。
首先，我们需要准备研究所需的样本，并对样本进行处理以获取所需的DNA。
接着，通过测序技术对DNA 进行测序，得到原始的测序数据。
在数据处理和质量控制阶段，我们需要对原始数据进行处理和过滤，以确保数据的准确性和可靠性。
最后，我们使用各种SNP分型算法对处理后的数据进行分析和解读，以获取SNP位点的基因型信息。
全基因组SNP分型具有广泛的应用前景。
在科学研究领域，它可以帮助我们研究遗传病理学、复杂疾病的致病机制以及人类演化历史等重要问题。
在临床医学中，全基因组SNP分型可以帮助医生进行个体化医疗决策，根据患者的基因信息选择最适合的治疗方案，提高治疗效果。
此外，全基因组SNP分型还可以应用于人口遗传学研究、药物研发与评价等方面，为我们提供更多关于人类基因组的信息。
本文将详细介绍全基因组SNP分型的步骤，希望能够为读者提供一个清晰的了解和入门指南，并展示全基因组SNP分型在生命科学领域的重要性和应用前景。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：本文将按照以下顺序介绍全基因组SNP分型的步骤。
首先，我们将在引言部分进行概述，介绍全基因组SNP分型的定义、背景知识和研究目的。
接下来，在正文部分，我们将详细介绍全基因组SNP分型的步骤。
其中，包括样本准备、DNA提取和测序、数据处理和质量控制以及SNP 分型算法的介绍。
AppliedBiosystems美国应用生物系统公司
A
Threshold Cycle (CT)
B
70M copies
7 copies
Slope = -3.4 R2 = 0.9991
No. PCR cycles
No. copies
Stem-loop RT-PCR miRNA assays 高度的重现性
美国应用生物系统公司为您的研究提供全套解决方案
Targeted Workflows 研究方向
Applications 应用领域
Gene Discovery 基因发现 Target Validation 靶物验证 Functional Analysis 功能分析
Resequencing 基因从新测序
Genotyping 基因分型
克隆法Cloning 杂交法Northern Blot Ribonuclease Protection-based PAGE电泳法 基因芯片法Microarray-based miRNA profiling 上列各种方法均未被证实是有效，准确并且是高度重 现的：不少小RNA间只有一个碱基的不同
TaqMan® MicroRNA 分析方法 发夹状引物的反转录荧光定量PCR
3. 巨大的信息量，最完 整的分类，与NCBI 数据库联动。
200万个SNP试剂盒每一个都经过严格挑 使用方便，成本低，基因组研究的成果
4,172,036 SNPs from all sources (selected w/ evidence of public + Celera Validation on >90 DNAs
*Mature miRNAs are the biologically active form miRNA
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实验分两步
PCR试剂 + 引物探针 + 2 ng样品 实时循环
终点读板
ABI 7300 7500 7900 StepOne定量 PCR仪
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TaqMan® Sample-to-SNP™
One hour. One kit. Any sample
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野生型 (wt)
突变型 (mut)
等位基因鉴定机理
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After each cycle . . .
● Theoretically, amount of target in reaction tube doubles ● Reporter fluorescence increases by a proportional amount
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SNP 研究意义
● 作为遗传图谱用于致病基因的定位 ● 应用于进化和种群多样性的研究，农业品种鉴定 ● 在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用 ● 个体化医疗和基因身份证
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SNP 研究策略
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HapMap Project SNPs
• Validated SNP genotype data for > 3.2 million genome-wide SNPs in 44-60 individuals from:
• Yorubans - Ibadan, Nigeria, Africa (YRI) • Caucasian - North & West European ancestry; Utah, USA (CEU) • Japanese - Tokyo, Japan (JPT) • Chinese - Han Chinese; Beijing, China (CHB)
Note: TaqMan® Sample-to-SNP™ and the GTXpress™ Master Mix are in product line SDR and plan code FJD (same as Gene expression and Genotyping master mixes)
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TaqMan® Sample-to-SNP™——One hour. One kit. Any Sample
任何样本
Contact Information
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高通量TaqMan SNP 分型平台 ——TaqMan OpenArray
TaqMan® Sample-to-SNPTM Kit includes:
DNA Extract All Lysis Reagents
TaqMan® GTXpressTM Master Mix
Contains the Lysis Solution, an enhanced alkaline solution with the ability lyse virtually any type of sample , and the DNA Stabilizing Solution, which has been specifically formulated to preserve the DNA lysate and neutralize a wide range of inhibitors.
FAM™
VIC®
Homozygote for FAM™-specific allele
(G/G)
FAM™ VIC® Heterozygote (G/A)
VIC®
FAM™
Homozygote for VIC®-specific allele
(A/A)
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Universal Protocol for Any Sample
Buccal Swab
Mouse tail
Corn Leaf
FFPE
Sample types tested during development:
Blood, mouse liver, mouse ear clip, mouse tail, hair, nail, seeds, leaf tissue, FTA paper, blood cards, fin clips, fish scales, FFPE, buccal swabs.
– 1:2 in VIC + FAM cluster
– 2:2 in FAM cluster
NTC
Heterozygotes
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450万个SNP分型试剂盒
– 187.5ul of 20 x mix – CD containing:
» Protocol » Product Insert » Assay information » Data sheet
Taqman® Sample-to-SNP™ SNPShot OpenArray™
Illumina Affymetrix
SOLiD
384
768
3000
300000
GB
Increasing Throughput
Data points
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技术流程/应用
Markers
• 5uL 1500 rxns • 10uL 750 rxns
– 以基因组DNA 或PCR产物为模板 – 2条引物, 2条MGB探针 – FAM和VIC标记 – 终点读板实验
¾4,500,000 Pre-designed
¾160,000 Validated
¾70,000 cSNP
¾2,600 DME
100,000 10,000
SNPShot™
以实时PCR为基础的平台
1,000 100
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TaqMan® SNP Assays
TaqMan® OpenArray™
100
1,000
10,000
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Samples
100,000
TaqMan MGB探针法——SNP分型的金标准
500,000
100,000
发现
10,000 1,000 100
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验证
候选基因 / 临床研究
筛选
100
1,000
10,000
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Samples
100,000
AB公司基因分型产品技术平台
Markers
SOLiDTM 系统
500,000
以测序仪为基础的平台
R 报告荧光 NFQ 无荧光淬灭基团 MGB 小沟结合物
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∆Tm决定探针杂交特异性
TAMRA MGB
Tm=65 Tm=65
Tm=59 Tm=49
(∆Tm = 6°C) (∆Tm = 16°C)
70°C
65°C
60°C
55°C
50°C
∆Tm = Tm 配对 - Tm 不配对 要有效地区分等位基因，退火/延伸温度必须落在∆Tm 区间内
AmpliTaq® Fast DNA Polymerase, UP
Ultra Pure DNA polymerase for improved detection of bacterial targets. This instant hot-start enzyme is inactive at room temperature so reactions can be set up on the benchtop.
● Taqman MGB 探针 – TaqMan® Assays——低通量 – TaqMan® OpenArray™——超高通量
● 片断分析 – SNaPshot——中通量
● 测序 – 测序仪 – 下一代测序仪SOLID
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Genotyping Throughput Landscape: AB Has a Broad Range of Options
● 包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入／缺失等
ATGCATGCATGCATGCATGC ATGCATGCATACATGCATGC
This G/A is a SNP
● SNP在人基因组中的发生频率比较高（不低于1%，低于1%算点突变）， 大约平均每100个碱基中就有一个多态位点，是继微卫星之后的第三代遗 传标记。有些SNP位点影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病
or
or
or
or
+
Sample Prep: 5 minutes;
Multiple sample types
PCR About 60 minutes
Analysis
(Actual genotyping data from crude lysate from
whole blood)