免疫比浊检验技术原理与进展
免疫比浊法反应曲线
免疫比浊法反应曲线免疫比浊法是一种常见的生物化学分析技术，用于测定生物样品中的特定分子的含量。
该方法的原理是利用抗体与目标分子结合形成免疫复合物，进而使溶液的浊度发生变化。
通过测量溶液的光密度或浊度的变化，可以间接地确定目标分子的浓度。
本文将介绍免疫比浊法的基本原理、反应曲线的构成和解读，并对该方法的优缺点进行讨论。
免疫比浊法的基本原理是将待测样品与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
为了便于检测和测量，通常会在抗体上标记一种可以产生浊度变化的物质，例如胶体金或聚合物颗粒。
这种标记物的加入使得免疫复合物具有一定的粒径，在溶液中悬浮形成胶体溶液。
当抗原与抗体结合时，免疫复合物的粒径会发生变化，溶液的浊度发生变化。
免疫比浊法的反应曲线是通过测量不同抗原浓度下溶液的浊度变化来构建的。
一般来说，会选择一种特定的抗原浓度（通常为0），将其与抗体结合并测量浊度，作为实验的背景浊度。
接下来，将其他抗原浓度的样品与相同的抗体结合，并测量其浊度。
通过比较实验样品与背景浊度之间的差异，我们可以得到由于抗原-抗体反应引起的浊度变化。
通常，随着抗原浓度的增加，浊度的变化也会增加。
根据反应曲线的形状，我们可以推断出抗原浓度与浊度变化之间的关系。
在解读反应曲线时，一般会根据曲线的斜率、线性范围和最大响应值等因素进行分析。
斜率表示了抗原浓度与浊度变化之间的敏感性，斜率较大的曲线说明免疫比浊法对抗原的测量较为敏感。
线性范围则表示了抗原浓度与浊度变化之间的线性关系，线性范围较宽的曲线通常具有更高的测量范围。
最大响应值表示了溶液浊度的最大变化幅度，从而可以评估免疫比浊法的灵敏度。
免疫比浊法作为一种常用的生物化学分析技术具有多种优点。
首先，相比于其他分析方法，免疫比浊法操作简单、快速，采集样品的成本较低。
其次，免疫比浊法具有较高的专一性和选择性，可以准确识别目标分子并排除其他干扰物质的影响。
此外，免疫比浊法还可以进行高通量分析，适用于大规模样品测定。
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3、免疫学检测技术
凝集放射性核素标记 酶标记、荧光标记和胶 体金标记 化学发光物标记或偶联 化学发光反应
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标记免疫检测技术
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二、免疫沉淀
凝集：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质 参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应 （agglutination）是最经典的免疫学检测技术。
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半抗原 +
载体
完全抗原
B B B
B Th
Th
抗体
半抗原—载体效应示意图
PPT课件 半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原 9
1、抗原与抗体
抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片 段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的 物质基础。 构象决定簇 ：构象决定簇（conformational determinant） 由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。 顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又 称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的 氨基酸肽片段构成的决定簇。 抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够 与抗体分子结合的决定簇数目。
免疫比浊分析技术原理与进展
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1
免疫比浊检验技术原理与进展
一、免疫学基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比浊技术原理
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一、免疫学基本原理
1、抗原与抗体 2、抗原抗体的结合——免疫学反应 3、免疫学反应的检测技术
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3
1、抗原与抗体
抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应 答的物质。 “应” 是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞 “答” 是指相应抗原与免疫应答产物结合并 将其排除体外） 抗原的免疫原性和免疫反应性 完全抗原与半抗原 抗原表位与抗原结合价位
自动化分析-(免疫比浊)
自动化免疫比浊
➢免疫比浊分析技术发展
两测定Biblioteka 原抗体形成后的阶段 个 测定抗原抗体结合的峰值
散射(终点)比浊
阶
段
速率散射比浊
散射比浊法:
当一束光
在光源的光路方向（50-960）
免 疫 比 浊
线通过溶 液受到光 散射和光 吸收两个
角的方向上测量透射光强度 和被检测溶液中微粒浓度关 系的方法。
法
因素的影
➢对抗原过量进行阈值限定 先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超 过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。
三、速率散射比浊分析
三、速率散射比浊分析 （一）基本原理
— 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。
— 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。
平光线
散射光θ
透射光
检测器 检测器
光源 透镜 滤光片
散射比浊、透射比浊光路图
实验要求（了解）
❖ 溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm) ❖ 溶液中形成的复合物分子要足够多 ❖ 控制抗原抗体反应的温度和时间 ❖ 加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 ❖ 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 ❖ 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A)
Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量 呈正比，与散射光的夹角呈正比，与波长呈反 比。
在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积， 减小入射光的波长，扩大散射光夹角等因素， 均可增加检测的敏感度。
（二）反应物含量与散射浊度
Heidelberger曲线
免疫学实验 免疫比浊(免疫球蛋白的测定)
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水 剂
• 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
•
样本管吸光度
• 浓度＝————————×校准液浓度（g/L）
•
校管吸光度
• 结果及讨论
– 检测报告 – 检测意义
实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验步骤见说明书 IgG9.77g/L IgA1.72g/L IgM1.37g/L
沉淀反应
微生物与免疫教研室
实验测试方法免疫比浊法原理
实验测试方法免疫比浊法原理免疫比浊法（immunoturbidimetry）是一种常用的实验测试方法，用于测定血清或尿液中特定分析物质的浓度。
它基于免疫学原理，通过测量可见光的散射程度来获得目标物质的浓度信息。
在实验中，样品中的目标物质与专门设计的抗原抗体反应，形成可见性沉淀物，从而引起溶液的浑浊程度的变化。
免疫比浊法的原理可以概括为以下几个步骤：1.抗原抗体反应：在实验开始前，需要将抗原抗体组分预先混合。
抗原可以是目标物质的衍生物或合成物，而抗体是特异性识别和结合抗原的蛋白质。
2.沉淀形成：向样品中加入混合的抗原抗体溶液，使其与样品中的目标物质相互作用。
当目标物质存在于样品中时，抗体会识别并与其结合，形成可见性沉淀物。
3.光散射测量：实验中使用的光散射测量器可以测量光线通过沉淀物混浊的溶液时的散射程度。
目标物质的浓度越高，形成的沉淀物越多，溶液的浑浊程度越高，从而引起更强的散射。
4.标准曲线计算：为了准确测量目标物质的浓度，需要根据已知浓度的标准品制备一条标准曲线。
标准品的浓度范围一般从低浓度到高浓度逐步增加。
通过测量标准品和待测样品的散射程度，并使用标准曲线进行外推和内推，可以得出待测样品中目标物质的浓度。
免疫比浊法的优点包括操作简单、结果快速、成本较低和高灵敏度。
然而，它也存在一些限制和注意事项。
由于光散射测量主要基于理论计算，因此需要确保实验中的测量条件如温度、光源强度和检测器的响应都是稳定和准确的。
另外，免疫比浊法在样品中可能存在其他干扰物质时可能会失去灵敏度和特异性。
因此，在进行免疫比浊法实验时，需要进行一系列的控制实验来检测和排除干扰因素。
除了免疫比浊法，还有其他一些常用的免疫学方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫分析（RIA）。
这些方法在分析物质浓度的测量范围、特异性和精确度方面可能略有不同。
因此，在选择适当的实验方法时，需要考虑样品性质、目标物质的特征和实验室的设备和技术条件。
免疫比浊检验技术原理与进展
水果检测
检测水果中的农药残留，保障食 品安全。
饮料检测
食品制造商可以使用免疫比浊检 测检测其产品中的营养素含量和 成分组成。
免疫比浊检验技术在环境监测中的应用
水质检测
通过检测水中污染物的含量，保护自来水中的 化学和生物安全。
空气质量检测
用免疫比浊检测检测空气中常见的有害气体 （如烟尘和花粉），保障工作场所的空气质量。
3 测量结果
检测并记录样品的光学浊 度变化，得出结果。
免疫比浊检验技术的主要进展1快速检测新一代的荧光免疫比浊检测方法可以在5-
高灵敏度
2
30分钟内完成检测，速度更快。
金纳米粒子和荧光标记物的出现使得免
疫比浊检测的灵敏度得到大幅提高。
3
自动化流程
随着自动化仪器的发展，免疫比浊检测 的多样性和自动化程度更高。
免疫比浊检验技术原理与 进展
免疫比浊检验技术是一种快速、准确、灵敏的免疫学检测方法，其原理基于 光学浊度的变化。本文将介绍其定义与概念。
免疫比浊检验技术的基本原理
1 标准物质
将待检物质与易于检测的 标准物质结合，形成免疫 复合物。
2 光学浊度变化
通过加入反应物，使得免 疫复合物聚集形成浑浊物 质，从而改变光学性质。
免疫比浊检验技术在医学领域的应用
诊断
免疫比浊检测可以用于检测血清中的肿瘤标志物、 细胞因子、抗体等，用于辅助医生做出诊断。
药物监测
免疫比浊检测可以用于监测炎症、感染等疾病治疗 过程中药物的有效性和副作用。
免疫比浊检验技术在食品安全检测中的应 用
酸奶检测
通过检测酸奶中的大肠菌群，保 证食品卫生和质量。
免疫比浊检验技术的优势和局限性
免疫比浊检验技术原理与进展
新型免疫比浊法研究动态
纳米颗粒增强免疫比浊法
01
利用纳米颗粒的高比表面积和光学性质，提高抗原抗体复合物
的浊度变化，从而提高检测灵敏度。
均相免疫比浊法
02
在反应体系中直接加入抗原抗体复合物，通过浊度变化检测待
测物，无需分离步骤，简化实验操作。
多重免疫比浊法
03
同时检测多个目标物，提高检测通量和效率，满足临床多样化
需求。
存在问题与挑战分析
抗原抗体复合物稳定性
复合物在反应体系中的稳定性直接影响浊度变化的准确性和可重复性，需要优化复合物制备和保 存条件。
非特异性干扰
血清等样本中的非特异性物质可能干扰免疫比浊反应，导致结果误差，需要采取相应措施降低干 扰。
自动化与标准化
当前免疫比浊法操作仍较为繁琐，需要进一步提高自动化程度，同时推动标准化进程，以确保结 果的准确性和可比性。
肿瘤标志物检测中的应用
01
肝癌
通过检测甲胎蛋白（AFP）等肿 瘤标志物，可辅助诊断肝癌及判 断其预后。
卵巢癌
02
03
前列腺癌
免疫比浊法可检测癌抗原125 （CA125），用于卵巢癌的诊断 和病情监测。
通过检测前列腺特异性抗原 （PSA），有助于前列腺癌的早 期发现和诊断。
05 免疫比浊法研究进展及挑 战
探讨了免疫比浊检验技术在临床实验室中的应用，如特定蛋白的 测定、药物监测等，并强调了质量控制的重要性和实施方法。
对未来发展趋势的展望
自动化与智能化
多项目联合检测
随着科技的进步，未来免疫比浊检验技术 将更加自动化和智能化，提高检测效率和 准确性。
开发能够同时检测多个项目的免疫比浊试 剂盒，以满足临床实验室对于高通量、高 效率的检测需求。
免疫比浊法原理
免疫比浊法原理
免疫比浊法是一种常用于生物化学和免疫学领域的实验方法，它通过测定抗原
与抗体结合后形成的免疫复合物的光学密度来定量分析抗原或抗体的含量。
这种方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，因此在医学诊断、生物学研究等领域得到了广泛应用。
免疫比浊法的原理主要是利用抗原与抗体结合后形成的免疫复合物对光的散射
或吸收产生影响，从而实现对抗原或抗体含量的测定。
具体来说，当抗原与抗体结合形成免疫复合物后，会使溶液中的颗粒浓度增加，导致溶液的浊度增加，从而使溶液对光的散射或吸收增强。
通过测定溶液的光学密度，就可以间接地反映出抗原或抗体的含量。
在进行免疫比浊法实验时，首先需要将待测样品与相应的抗体进行反应，形成
免疫复合物。
然后利用光度计或比色皿等设备，测定样品溶液的光学密度。
通过比较待测样品与标准曲线的关系，就可以计算出样品中抗原或抗体的含量。
免疫比浊法在实际应用中具有广泛的适用性。
例如，在医学诊断中，可以利用
免疫比浊法来检测血清中特定蛋白质的含量，从而辅助诊断各种疾病。
在生物学研究中，可以利用免疫比浊法来分析细胞表面分子的表达情况，研究免疫应答过程等。
此外，免疫比浊法还可以用于药物的药效学研究、环境监测等领域。
总之，免疫比浊法作为一种常用的免疫学实验方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适用于各种领域的抗原或抗体含量的定量分析。
通过对免疫复合物对光的散射或吸收进行测定，可以实现对抗原或抗体含量的准确测定，为医学诊断、生物学研究等领域提供了重要的实验手段。
自动化分析 (免疫比浊)
自动化分析 (免疫比浊)自动化分析 (免疫比浊)一、引言免疫比浊是一种自动化分析方法，通过测量免疫反应中形成的免疫复合物的浊度来检测样品中特定抗原或抗体的存在或浓度。
本文档旨在提供关于自动化分析 (免疫比浊)的详细信息和操作指南。
二、背景1. 免疫比浊的原理：免疫比浊基于免疫反应导致的免疫复合物形成的特性，即抗原和抗体相互结合产生可见的浊度。
测量这种浊度可以提供关于抗原或抗体的定量信息。
2. 仪器设备：免疫比浊分析通常使用细菌二联体仪器或其他具有浊度测量功能的仪器进行测量。
3. 样品处理：样品在进行免疫比浊分析之前需要进行适当的处理，如稀释、去除干扰物质等。
三、方法1. 样品准备：根据需要的抗原或抗体浓度范围，选取适当的稀释倍数来稀释样品。
确保样品中不含有干扰物质。
2. 试剂准备：准备好所需的抗体或抗原溶液，并按照说明书中的指导来配制试剂。
3. 仪器操作：将稀释后的样品和配制好的试剂加入到测量池中，按照仪器操作指南进行测量。
4. 数据分析：根据仪器的测量结果，结合相应的标准曲线或计算方法，计算出样品中抗原或抗体的浓度。
四、注意事项1. 严格按照操作指南进行操作，避免出现误差；2. 样品稀释倍数要根据实际情况选择，确保在仪器的测量范围内；3. 遵循试剂的储存和使用要求，确保试剂的活性；4. 仪器的保养和校准要定期进行，以保证数据的准确性。
五、附件本文档涉及的附件详见附件清单。
六、法律名词及注释1. 免疫反应：免疫系统对抗原的特异性应答，包括抗体的和细胞免疫反应等。
2. 免疫复合物：抗原和抗体结合形成的复合物，通常可导致可视的浊度。
3. 抗原：能够诱导免疫反应的物质，通常为细菌、病毒、蛋白质等。
4. 抗体：免疫系统产生的一种特异性蛋白质，能够与特定的抗原结合并参与免疫反应。
免疫比浊分析
（三）技术要求
• 待测的抗原抗体复合物分子量足够大。
• 抗原抗体复合物数量足够多。 • 具有充分的反应时间，只能测定抗原抗 体反应的第二阶段。 • 高亲和力的抗体，并保证抗体过量。
（四）方法评价
优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确 不足: ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大 ③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。
1．抗原抗体比例 抗原抗体比例要适当。 诊断试剂应尽可能 溶液中免
颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝
聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。
三、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
第二节 自动化免疫比浊分析
一、主流免疫比浊设备概况
（一）BN特种蛋白分析测定系统 1.测定原理 该系统的测定方法是透射免疫比浊法的 一种改良。以发光二极管作为光源，检测前
向角13～24度的散射光，然后利用硅化光电
二、免疫散射比浊法
(一) 原理 粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到 光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成 散射光。 悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的 大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因 素密切相关。
不同大小的微粒形成的散射光分布不同。
当微粒直径小于入射光的波长的十分之一时，
(二) 技术要求 应选择适当的光源强度、反应时间、测量角 度及光源的波长。 另外，要注意保证抗原浓度合适。 此外，还要选择适宜的离子强度、pH值等。
(三)速率散射比浊法（rate nephelometry） 速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的一种动 态测定方法。
所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免
胶体金颗粒免疫比浊法
胶体金颗粒免疫比浊法
胶体金颗粒免疫比浊法是一种常用的生物化学分析方法，用于检测和测定溶液中的抗原或抗体含量。
本文将介绍胶体金颗粒免疫比浊法的原理、应用和发展历程。
一、胶体金颗粒免疫比浊法的原理
胶体金颗粒免疫比浊法是基于免疫反应原理的一种定量分析方法。
它利用胶体金颗粒与抗原或抗体结合后形成的免疫络合物，在特定条件下产生可见的比浊反应。
该方法利用胶体金颗粒的特殊性质，具有较高的灵敏度和特异性。
二、胶体金颗粒免疫比浊法的应用
胶体金颗粒免疫比浊法在医学、生物学等领域有广泛的应用。
在临床诊断中，它可用于检测血清中的肿瘤标志物、病毒、细菌等，对于疾病的早期诊断和预后评估具有重要意义。
此外，胶体金颗粒免疫比浊法还可以应用于食品安全检测、环境监测和药物研发等领域。
三、胶体金颗粒免疫比浊法的发展历程
胶体金颗粒免疫比浊法起源于20世纪70年代，最初用于检测结核分枝杆菌。
随着研究的深入，科学家们发现该方法具有较高的敏感性和特异性，并且可以与其他分析技术相结合，如酶联免疫吸附法、荧光免疫分析法等，进一步提高检测的准确性和灵敏度。
随着生物技术的不断发展，胶体金颗粒免疫比浊法也得到了进一步的改进和应用扩展。
现在，已经有许多新的胶体金颗粒免疫比浊法
衍生技术被开发出来，如纳米颗粒标记技术、多重共振光散射技术等，进一步提高了检测的灵敏度和多样性。
总之，胶体金颗粒免疫比浊法是一种重要的生物化学分析方法，
广泛应用于医学、生物学等领域。
随着技术的不断创新和改进，它将
在未来发挥更大的作用，为疾病的早期诊断和治疗提供有力的支持。
透射免疫比浊的原理
透射免疫比浊的原理
透射免疫比浊是一种常用的免疫学实验技术，用于定量测定溶液中含有的抗原或抗体的浓度。
该技术基于光的散射原理。
当溶液中存在大分子抗原或抗体时，它们会与光发生相互作用，散射光的方向和强度发生改变。
透射免疫比浊实验中，首先制备一系列已知浓度的抗原或抗体溶液，称为标准曲线。
然后，将未知浓度的溶液加入比浊槽中，并在透射比浊仪中测量其散射光的强度。
根据已知浓度的标准曲线，可以得出未知浓度溶液的光强值。
通过比较标准曲线和未知浓度溶液的光强值可以计算出未知溶液的抗原或抗体浓度。
透射免疫比浊的原理可以简单概括为：根据抗原或抗体溶液对光的散射特性进行测量，从而定量分析溶液中的抗原或抗体浓度。
免疫比浊法检测免疫球蛋白
随着技术的进步，免疫比浊法的检测过程将更加自动化和标准化，提高检测效率和准确 性。
多项目联合检测
未来免疫比浊法有望与其他免疫分析方法联合使用，实现多项目同时检测，提高诊断效 率。源自未来发展趋势及新技术应用前景
• 拓展应用领域：随着对免疫球蛋白研究的深入，免疫比浊 法的应用领域将进一步拓展，如疾病预后评估、免疫治疗 监测等。
力。
质评样本处理
02
按照质评计划要求处理质评样本，确保结果的准确性和可比性
。
结果分析与反馈
03
对室间质评结果进行认真分析，及时发现问题并采取改进措施
。
问题分析与解决策略
问题识别
通过室内质控和室间质评结果 分析，识别存在的问题。
原因分析
针对问题进行深入的原因分析 ，包括试剂、仪器、操作等方 面。
改进措施
影响。
06
总结与展望
免疫比浊法检测免疫球蛋白优势与局限性
灵敏度高
免疫比浊法能够检测到非常低浓度的 免疫球蛋白，具有较高的灵敏度。
特异性强
该方法使用的抗体具有高度的特异性 ，能够准确识别并定量目标免疫球蛋 白。
免疫比浊法检测免疫球蛋白优势与局限性
• 操作简便：免疫比浊法检测步骤相对简单 ，易于自动化和标准化，适用于大规模样 本检测。
分为血清型和分泌型两 种。血清型IgA主要存在 于血液中，而分泌型IgA 主要分布于呼吸道、消 化道等黏膜表面，是黏 膜免疫的主要抗体。
正常血清中含量极低， 主要参与I型超敏反应和 抗寄生虫免疫。当机体 发生过敏反应时，血清 中IgE水平会显著升高。
主要存在于B淋巴细胞表 面，作为B细胞分化发育 成熟的标志。在血清中 含量很低，其功能尚不 完全清楚。
免疫比浊法原理
免疫比浊法原理
免疫比浊法是检测类风湿因子的方法，是利用抗原和抗体相互结合，动态测定类风湿因子的方法，基本原理是抗原、抗体在特定稀释系统中反应，比例合适的时候形成可溶性免疫复合物，在稀释系统中的促凝剂作用下，从液体状态析出形成微粒，使反应液混浊，抗体浓度固定的时候形成的免疫复合物量，会随检测样中抗原量增加，反应液混浊度也会随之增加。
通过测定反应液的浊度，与一系列标准品进行对比，可以计算出检测样品中抗原含量。
所以，免疫比浊法是检测类风湿因子的定量检查，有时候在测定类风湿因子的时候会将检测方法写在检查结果后面，有利于临床医生对结果做出比较规范的判断。
在临床上也会采用其他检测方法进行类风湿因子的检测，有的是定性检测，报告只出现阴性、阳性结果，没有具体数值。
免疫比浊法是一种检测类风湿性因子的方法，是利用抗原抗体相互结合，动态测定类风湿因子的方法，其基本原理是：抗原、抗体在特定稀释系统中反应，适当比例后形成可
溶性免疫复合物，在稀释系统中的促凝剂作用下，从液体状态析出形成微粒，使反应液混浊，当抗体浓度固定时，所形成的免疫复合物量，就会随检测样中抗原量增加，反应液混浊度也会随之增加。
用该反应液测定浊度，并与标准系列产品对比，可计算出检测样品中抗原含量。
06第六章 免疫比浊分析
返回章目录
人民卫生出版社
第六章
免疫比浊分析
第二节 自动化免疫比浊分析
一、主流免疫比浊设备概况
（一）BN特种蛋白分析测定系统 1.测定原理 该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种
改良。以发光二极管作为光源，检测前向角
13～24度的散射光，然后利用硅化光电二极 管接收散射光信号，经过微电脑处理，与标 准曲线进行比较，最后转换成待检物质的浓 度。
复合物产 产生速率 生总量
8 13 25 60 150 230 300 360 415 450 480 500 — 5 12 35 90 80 70 60 55 45 30 20
人民卫生出版社
第六章
免疫比浊分析
（二）技术要求 速率散射比浊法峰值出现的时间与抗体浓 度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力 交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性 状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。
4
人民卫生出版社
第六章
免疫比浊分析
在抗原或抗体量一定的条件下，可以利用比 浊仪在光源的光路方向上测定透射光强度与 入射光强度的比值或吸光度，来判断待测抗 原的量，这种方法称为透射比浊法 。
人民卫生出版社
第六章
免疫比浊分析
透射免疫比浊法光路图
人民卫生出版社
第六章
免疫比浊分析
（二）技术要求
• 待测的抗原抗体复合物分子量足够大。
影响检测结果，因此需要选择均匀一致的
胶乳颗粒。此外，试剂需要加保护剂以提
高其稳定性，所用器皿要洁净，避免杂质 微粒的干扰。
人民卫生出版社
第六章
免疫比浊分析
（三）方法学评价 该法敏感度高，试剂稳定，个体免疫复 合物对结果影响也小，因此结果稳定、可 靠，特异性好，精确度高，且不需要特殊
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2、抗原抗体的结合——免疫学反应
抗原抗体反应的原理
抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和 性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。 抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合 的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。 第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、 pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、 沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。 抗原抗体的结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水 胶体。 四种分子间引力（电荷引力、范登华引力 、氢键结合力 和疏水作 用 ）参与并促进抗原抗体间的特异性结合。
抗原与抗体在一定缓冲液中形成 IC，当光线透过反应溶液时，由 于溶液内IC粒子对光线的反射和 吸收，引起透射光减少，IC越多 透射光越少，可用吸光度表示。
透射免疫比浊法
反应要求
溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm) 溶液中形成的复合物分子要足够多 控制抗原抗体反应的温度和时间 加增敏剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A) 为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标 准曲线
抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体
1、抗原与抗体
抗体的分子结构
1、抗原与抗体
“Y”型，四肽链 重链 （5种: 、 、、、） 轻链 （2种: 、） 可变区 （V区）
超变区（ 又称CDR 互补 决定区）
骨架区: FR
恒定区 （C区）
铰链区
1、抗原与抗体
根据重链抗原性的不同，免疫球蛋白可以 分为5类： IgG —γ(gamma) IgA — α(alpha) IgM — μ(mu) IgD — δ(delta) IgE — ε(epsilon)
标准品抗原浓度测定
与相应抗体结合形成沉 淀环，沉淀环大小与抗 原浓度呈正相关。
不同病人抗原浓度测定
凝胶内沉淀——双向琼脂扩散原理示意图 模拟图
Ag
Ab
1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧
染色琼脂图
三、免疫比浊技术原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊 的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液 体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗 原含量。
半抗原 +
载体
完全抗原
B B B
B Th
Th
抗体
半抗原—载体效应示意图
半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原
1、抗原与抗体
抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片 段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的 物质基础。 构象决定簇 ：构象决定簇（conformational determinant） 由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。 顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又 称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的 氨基酸肽片段构成的决定簇。 抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够 与抗体分子结合的决定簇数目。
峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图 散 射 光 峰 值
C
F
D G H
散 射 率
抗体过量
第二峰值信号
抗原过量
0
60
85
反应时间（秒）
粒子增强免疫比浊分析技术
基本原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后， 当遇到相应抗原时，则发生聚集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内， 光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少
按测定时间
按增敏剂
透射比浊法和散射比浊法光路
透射免疫比浊法是在180°角， 即在直射角度上测定光透射强度。
IC I
透射比浊法
I0
θ
检测器A
Iθ 检测器B
散射比浊法
散射比浊法在光路的5°～96°角的方向上测量散射光强度。
单色器
透 射 比 浊 计
散射比浊和透射比浊的区别示意图
透射免疫比浊法
（transmission turbidimetry 原理
3、免疫学检测技术
凝集与沉淀 非标记免疫检测技术 比浊 电位、微天平
放射性核素标记 酶标记、荧光标记和胶 体金标记 化学发光物标记或偶联 化学发光反应
标记免疫检测技术
二、免疫沉淀
凝集：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质 参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应 （agglutination）是最经典的免疫学检测技术。
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
典型的抗原抗体结合反应
特异性识别
形成抗原抗体复合物
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
抗原抗体反应的特点
特异性 按比例
可逆性
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
Antigen added →
2、抗原抗体的结合——免疫学反应
影响抗原抗体反应的因素
电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为 疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物 或凝集物的形成，常用0.85％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释 液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1－，可分别中和胶体粒子上的 电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（12～15mV）以下 时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。 酸碱度（pH）：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有 两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在 pH为6～8进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH 达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原 非特异性的凝集，造成假阳性反应。 温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增 多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离， 甚至变性或破坏；在40℃时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常 用的抗原抗体反应温度为37℃。每种试验都有其独特的最适反应温度，例 如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。 其它：适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。
免疫比浊分析技术原理与进展
桂林英美特生物技术研究所
免疫比浊检验技术原理与进展
一、免疫学基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比浊技术原理
一、免疫学基本原理
1、抗原与抗体 2、抗原抗体的结合——免疫学反应 3、免疫学反应的检测技术
1、抗原与抗体
抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应 答的物质。 “应” 是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞 “答” 是指相应抗原与免疫应答产物结合并 将其排除体外） 抗原的免疫原性和免疫反应性 完全抗原与半抗原 抗原表位与抗原结合价位
的程度与胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。
特点：变非均相反应为均相反应，灵敏度提高（ ≥0.1ng/mL ）；
T
致敏T细胞
Ag
B 浆细胞
抗体
抗原性（免疫反应性）示意图
1、抗原与抗体
完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原 性的物质。
半抗原（hapten，又称不完全抗原 incomplete antigen ） 无免疫原性，只有抗原性的物质。 载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。 半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原。
散射免疫比浊法
速率散射比浊分析
基本原理： 抗原抗体结合反应的一种动态测定法，适时检测抗原抗体复合物形 成的散射光信号。是测定抗原抗体结合反应的动态过程。
— 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成复合物的速度。将各单位时 间内形成复合物的速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态的速率比浊分 析。 — 当仪器测定到某一时间内形成速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低， 即代表所测抗原的量。 — 速率峰值一般在25秒时出现。 — 在反应介质中加入一定量的促凝剂，可加速抗原抗体复合物的形成，以减 少反应时间。 — 速率法的优点：是快速、不需要减去样本和试剂本底读数，校正结果也较 稳定。
平光线
射 散
透射光
光源 透镜 滤光片
检测器
比浊测定法原理示意图
光波
λ
当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射， 在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光 的量代表复合物的量
d
当复合物小于入射波长时呈全透射， 透射与散射相当
三、免疫比浊技术原理
免疫比浊技术分类：
按光路 透射免疫比浊 散射免疫比浊 终点比浊 速率比浊 无增敏 PEG增敏 胶乳增敏
在预反应时段， 加小量样本与 抗原/抗体反应， 测定第一次散 射光信号值
加全量样本， 约反应 2分 钟后，第二 次测定散射 光信号
信号峰值 计算机处理 转换为样 品浓度
定时散射比浊反应曲线图
预反应阶段 5ul样本 反 应 阶 段 45ul样本 抗原过剩区
信 号
抗原不过量 阈值 抗原过量
7.5秒
2分钟
原理
抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、 偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的 大小和量有关
单色器
散射免疫比浊法
定时散射比浊分析
基本原理： 免疫沉淀反应和散射比浊分析结合之技术，反应分两个阶段，预 反应阶段和反应阶段 保证抗原不过量的方法： 确保反应体系抗体过量 对抗原过量进行阈值限定