二代测序(NGS)实验方案计划和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。

随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：

•全基因组从头测序或者重测序

•目标序列重测序

•转录组分析

•微生物组研究

•基因调控研究

NGS 序列

二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。

从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。目前，这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。

DNA测序

二代DNA测序的工作流程如下：

•DNA样本制备

•文库构建和验证

•文库分子大规模平行克隆扩增

•测序

二代测序DNA样本的质量控制

首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。

凝胶电泳法

基因组DNA的完整性和大小，可以用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。常规的凝胶电泳的精确度不高，这是因为大的DNA 分子在凝胶中移动的时候，本质上是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。但是，它仍然能够提供完整性（大小范围）和纯度（RNA污染物在凝胶底部形成脱尾条带）方面的有效信息。因此，它仍然是评价基因组DNA质量的有效方法之一。

注：RNA污染会导致DNA浓度高估，并且抑制一些下游步骤。如果能肯定有RNA污染，则可使用去DNase的RNase I处理样本。

分光光度测定法

分光光度仪在260 nm和280 nm处读数的比例（A260/A280）可以用来估计DNA相对于一些吸收紫外光的杂质（比如蛋白）的纯度。纯净的DNA的A260/A280比例大约为1.7–1.9。

注：想要获得精确的A260/A280值，需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比如, 10 mM Tris•Cl, pH 7.5)。

第二个步骤是测定基因组DNA的浓度。

分光光度法

DNA的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在260 nm波长的吸光度来确定。Nanodrop目前被广泛使用，因为它需要的样本量少(1 µl)，并且使用方便（不需要比色皿）。为了确保结果的可靠性，读数应该在0.1到1.0之间。

注：吸光度测定不能区别DNA和RNA。RNA污染物会导致DNA浓度高估。但是，纯净RNA的A260/A280比值在2.0左右，而纯净的DNA大约为1.8。因此，如果这个值为1.95，那么说明样本里面有RNA杂质。

注：苯酚在270–275 nm的波长范围内有最大的吸光度，非常接近于DNA。因此苯酚能提高样本在260 nm附近的吸光度，从而导致高估DNA的产量和纯度。

荧光法

荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度，具有特异性和灵敏性。Hoechst 33258结合到DNA上后，能增大458 nm波长附近的发光强度，除此之外，也可以使用一些更加灵敏的荧光染料，比如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的实验，比紫外吸光光度法灵敏10，000倍，而比使用Hoechst 33258染料的方法至少灵敏400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen实验对双链DNA的选择性要远高于RNA 和单链DNA。

DNA标准品和样本与荧光染料混合，并且使用荧光计检测。将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较，以确定DNA的浓度。

Real-time PCR

可以使用real-time PCR 技术来测定DNA样本的数量和质量。多重PCR技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段，是检测DNA 损伤和片段化的有效质控手段。此类技术试验专门测定可经PCR扩增，适于二代测序的DNA分子。上述提到的这些常规方法，通常不能测定的样本中扩增得到的DNA的量，或者会高估了DNA的量。与它们相比，real-time PCR更加适用于预测DNA样本是否适合于二代测序。

文库制备

对于大多数商业化的二代测序平台，使用诸如桥式扩增或者乳液PCR方法，对文库中的DNA片段进行克隆扩增，以产生足够拷贝数量的测序模板非常必要。通过将平台特异性的适配子与感兴趣的DNA源（比如基因组DNA、双链cDNA或者PCR扩增子等所产生的DNA 片段）退火，得到片段文库。适配子序列的存在，使得我们可以对文库分子进行选择性的克隆扩增。因此，这种方法不需要像传统的方法那样，在微生物中间体中，对基因组片段进行微生物克隆。另外，适配子序列中，还含有平台特异性的测序引物的结合位点。

通常情况下，一个常规的DNA文库构建方案包含四步：

•片段化DNA

•对DNA片段进行末端修复

•连接适配子序列（不适用于单分子测序）

•对可选的文库进行扩增

目前有四种方法用于产生基因组DNA碎片：酶消化法、超声波法、喷雾法和水动力剪切法。这四种方法都可以用于文库构建，但是每一种方法都有其优点和局限性。核酸内切酶消化的方法快速并且容易，但是难以精确的控制片段长度的分布。另外这种方法可能会对基因组DNA的呈递引入偏倚。另外三种技术使用物理的方法将DNA的双链打断，这种断裂是随机的，因此能在文库中对DNA进行无偏的呈递。可以使用琼脂糖凝胶电泳或者自动化的DNA分析方法，对DNA片段的尺寸分布进行控制。

片段化DNA之后，需要将DNA修复，产生5’磷酸化的平末端DNA，以便能够和测序平台特异性的适配子相连接。文库构建的效率直接依赖于DNA末端修复的效率和准确性。

末端修复混合溶液将5’或者3’的粘性末端转变成5’磷酸化的平末端DNA。在大多数情况下，末端修复通过T4 DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完成。而T4多聚核苷酸激酶确保平末端的DNA片段5’端的磷酸化，以便进行后续的适配子连接。

根据所使用的测序平台，平末端DNA片段可以直接与适配子连接，或者需要在其片段的3’端增加一个单独的突出的腺苷酸A，以便与平台特异性适配子上突出的胸苷酸T相互配对。通常情况下，使用Klenow片段（具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端转移酶活性的聚合酶催化这一步骤。

T4 DNA连接酶将双链的适配子与文库片段修复过的末端相连，然后使用回收反应或者根据DNA的尺寸，选择性去除文库中未连接的适配子和适配子二聚体。大小筛选方法包括使用琼脂糖凝胶电泳分离，使用磁珠或者使用高等的基于柱的纯化方法。在连接过程中可能出现适配子的二聚体，它们会和与适配子连接的文库片段共同扩增，从而降低测序平台对真正文库片段测序的能力并且降低测序的质量，因此在测序之前，必须将它们从文库中除去。一些测序平台要求文库片段的长度分布在比较窄的范围内，以得到最佳的结果，很多时候，这只能通过去除凝胶电泳上的相应的片段条带实现。这种方法也可以用来去除适配子二聚体。

完成这一步骤之后，应该对DNA片段文库的质量进行检测，并进行定量检测。根据浓度和测序文库的适配子设计，既可以直接稀释溶液并用于测序，也可以对文库进行选择性扩增。在文库扩增阶段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的适配子序列，通过与PCR引物的重叠，用于后续的克隆扩增和与测序引物结合，或者提高DNA文库的产量。为了得到最佳的文库扩增结果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。

文库质量评估方法，参见NGS文库质控。

为了充分利用测序能力，不同样本得到的测序文库可以放在一起，在同一轮实验中一同测序。通过将DNA片段与具有不同特征的适配子相连接，可以实现这一过程，即对于每一个样本使用不同的短核苷酸序列作为适配子。