二代测序(NGS)实验方案计划和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。

随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。

这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：•全基因组从头测序或者重测序•目标序列重测序•转录组分析•微生物组研究•基因调控研究NGS 序列二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。

从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。

这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。

目前，这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。

一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。

与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。

还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。

这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。

这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。

DNA测序二代DNA测序的工作流程如下：•DNA样本制备•文库构建和验证•文库分子大规模平行克隆扩增•测序二代测序DNA样本的质量控制首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。

凝胶电泳法基因组DNA的完整性和大小，可以用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。

常规的凝胶电泳的精确度不高，这是因为大的DNA 分子在凝胶中移动的时候，本质上是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。

但是，它仍然能够提供完整性（大小范围）和纯度（RNA污染物在凝胶底部形成脱尾条带）方面的有效信息。

因此，它仍然是评价基因组DNA质量的有效方法之一。

注：RNA污染会导致DNA浓度高估，并且抑制一些下游步骤。

如果能肯定有RNA污染，则可使用去DNase的RNase I处理样本。

分光光度测定法分光光度仪在260 nm和280 nm处读数的比例（A260/A280）可以用来估计DNA相对于一些吸收紫外光的杂质（比如蛋白）的纯度。

纯净的DNA的A260/A280比例大约为1.7–1.9。

注：想要获得精确的A260/A280值，需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比如, 10 mM Tris•Cl, pH 7.5)。

第二个步骤是测定基因组DNA的浓度。

分光光度法DNA的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在260 nm波长的吸光度来确定。

Nanodrop目前被广泛使用，因为它需要的样本量少(1 µl)，并且使用方便（不需要比色皿）。

为了确保结果的可靠性，读数应该在0.1到1.0之间。

注：吸光度测定不能区别DNA和RNA。

RNA污染物会导致DNA浓度高估。

但是，纯净RNA的A260/A280比值在2.0左右，而纯净的DNA大约为1.8。

因此，如果这个值为1.95，那么说明样本里面有RNA杂质。

注：苯酚在270–275 nm的波长范围内有最大的吸光度，非常接近于DNA。

因此苯酚能提高样本在260 nm附近的吸光度，从而导致高估DNA的产量和纯度。

荧光法荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度，具有特异性和灵敏性。

Hoechst 33258结合到DNA上后，能增大458 nm波长附近的发光强度，除此之外，也可以使用一些更加灵敏的荧光染料，比如PicoGreen染料。

基于PicoGreen染料的实验，比紫外吸光光度法灵敏10，000倍，而比使用Hoechst 33258染料的方法至少灵敏400倍。

和紫外吸光光度法不同，PicoGreen实验对双链DNA的选择性要远高于RNA 和单链DNA。

DNA标准品和样本与荧光染料混合，并且使用荧光计检测。

将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较，以确定DNA的浓度。

Real-time PCR可以使用real-time PCR 技术来测定DNA样本的数量和质量。

多重PCR技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段，是检测DNA 损伤和片段化的有效质控手段。

此类技术试验专门测定可经PCR扩增，适于二代测序的DNA分子。

上述提到的这些常规方法，通常不能测定的样本中扩增得到的DNA的量，或者会高估了DNA的量。

与它们相比，real-time PCR更加适用于预测DNA样本是否适合于二代测序。

文库制备对于大多数商业化的二代测序平台，使用诸如桥式扩增或者乳液PCR方法，对文库中的DNA片段进行克隆扩增，以产生足够拷贝数量的测序模板非常必要。

通过将平台特异性的适配子与感兴趣的DNA源（比如基因组DNA、双链cDNA或者PCR扩增子等所产生的DNA 片段）退火，得到片段文库。

适配子序列的存在，使得我们可以对文库分子进行选择性的克隆扩增。

因此，这种方法不需要像传统的方法那样，在微生物中间体中，对基因组片段进行微生物克隆。

另外，适配子序列中，还含有平台特异性的测序引物的结合位点。

通常情况下，一个常规的DNA文库构建方案包含四步：•片段化DNA•对DNA片段进行末端修复•连接适配子序列（不适用于单分子测序）•对可选的文库进行扩增目前有四种方法用于产生基因组DNA碎片：酶消化法、超声波法、喷雾法和水动力剪切法。

这四种方法都可以用于文库构建，但是每一种方法都有其优点和局限性。

核酸内切酶消化的方法快速并且容易，但是难以精确的控制片段长度的分布。

另外这种方法可能会对基因组DNA的呈递引入偏倚。

另外三种技术使用物理的方法将DNA的双链打断，这种断裂是随机的，因此能在文库中对DNA进行无偏的呈递。

可以使用琼脂糖凝胶电泳或者自动化的DNA分析方法，对DNA片段的尺寸分布进行控制。

片段化DNA之后，需要将DNA修复，产生5’磷酸化的平末端DNA，以便能够和测序平台特异性的适配子相连接。

文库构建的效率直接依赖于DNA末端修复的效率和准确性。

末端修复混合溶液将5’或者3’的粘性末端转变成5’磷酸化的平末端DNA。

在大多数情况下，末端修复通过T4 DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完成。

而T4多聚核苷酸激酶确保平末端的DNA片段5’端的磷酸化，以便进行后续的适配子连接。

根据所使用的测序平台，平末端DNA片段可以直接与适配子连接，或者需要在其片段的3’端增加一个单独的突出的腺苷酸A，以便与平台特异性适配子上突出的胸苷酸T相互配对。

通常情况下，使用Klenow片段（具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端转移酶活性的聚合酶催化这一步骤。

T4 DNA连接酶将双链的适配子与文库片段修复过的末端相连，然后使用回收反应或者根据DNA的尺寸，选择性去除文库中未连接的适配子和适配子二聚体。

大小筛选方法包括使用琼脂糖凝胶电泳分离，使用磁珠或者使用高等的基于柱的纯化方法。

在连接过程中可能出现适配子的二聚体，它们会和与适配子连接的文库片段共同扩增，从而降低测序平台对真正文库片段测序的能力并且降低测序的质量，因此在测序之前，必须将它们从文库中除去。

一些测序平台要求文库片段的长度分布在比较窄的范围内，以得到最佳的结果，很多时候，这只能通过去除凝胶电泳上的相应的片段条带实现。

这种方法也可以用来去除适配子二聚体。

完成这一步骤之后，应该对DNA片段文库的质量进行检测，并进行定量检测。

根据浓度和测序文库的适配子设计，既可以直接稀释溶液并用于测序，也可以对文库进行选择性扩增。

在文库扩增阶段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的适配子序列，通过与PCR引物的重叠，用于后续的克隆扩增和与测序引物结合，或者提高DNA文库的产量。

为了得到最佳的文库扩增结果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。

文库质量评估方法，参见NGS文库质控。

为了充分利用测序能力，不同样本得到的测序文库可以放在一起，在同一轮实验中一同测序。

通过将DNA片段与具有不同特征的适配子相连接，可以实现这一过程，即对于每一个样本使用不同的短核苷酸序列作为适配子。

有一些其它的方法可以用于简化文库构建。

有一种新方法使用转位酶/DNA的复合物进行体外转座，以便在同一个试管中同时将DNA片段化并标记。

通过对所标记的DNA片段进行有限次数的PCR扩增，可以构建完整的测序文库，这节省了操作步骤和时间。

但是，使用体外转座构建的文库，与传统方法构建的文库相比，具有更高的序列偏倚。

NGS文库质控高质量的文库是成功进行第二代测序的关键。

文库构建包含复杂的步骤，比如片段化样本、修复末端、将末端腺苷酰化、连接适配子和扩增文库。

根据使用的平台和文库类型，这些步骤也会发生变化。

监控每一个步骤非常必要，包括在片段化样本之后检查片段的尺寸，以及连接适配子之后检查片段的大小和浓度。

文库验证过程中，需要分析文库中片段的大小和数量，这是质控的最后步骤。

评估文库中片段的大小琼脂糖和PAGE凝胶电泳是传统的检测片段大小的方法，它们比较耗时。

最近，基于微流技术的电泳或者毛细管电泳越来越广泛的用于检测片段的大小和浓度。

即买即用的芯片和胶盒省去了配置凝胶的步骤，使用方便。

它们具有更高的通量，并且省去了很多的手动操作时间。

除此之外，它们的灵敏度更高（对于检测的限制更少），并且能完全自动化的获取数据和输出电子化的数据资料。

这些仪器能同时检测片段的大小和浓度。

•测定文库中的片段数量•分光光度法和荧光法•参见分光光度法和荧光法电泳设备如前所述，基于微流技术的电泳和毛细管电泳除了提供片段大小的信息之外，还提供了定量检测数据。

但是，电泳、分光光度法和荧光法的一个共同的局限性是，都只检测总的核苷酸的浓度，而非与适配子连接的分子的浓度。

Real-time PCR将适配子连接到文库分子的两端，使得可以在平行的PCR扩增步骤中扩增上百万个独立的DNA分子（乳液PCR或者桥式PCR）。

在有些仪器中，乳液PCR可以将一个DNA分子扩增到数百万个相同序列的拷贝，并全都结合在同一个珠子上。

在另一种平台上，桥式PCR 能够将一个DNA分子转变成一个包含相同序列的多个拷贝的DNA簇。

因此，两端连接了适配子的扩增之后的分子，决定了乳液PCR 中模板和珠子的比例以及桥式PCR中产生的最佳DNA簇。