酶促反应动力学

（ 2）
说明：设[E]为酶的总浓度；[ES]为中间产物浓度；[S]为底物 浓度；[E]—[ES]为游离状态酶的浓度。并且由于底物的量通常 要比酶的量高很多，所以在最初反应时间内，[S]浓度的减少可 忽略不计。同时，由于在最初反应时间内，产物的生成很少， 所以其逆反应可忽略不计。 因此根据中间产物学说的反应有： [ES]的生成速度为：v1=k1（[E]—[ES])（[S]） [ES]分解的速度为：v2+v3=[ES]（k2+k3） 根据恒态理论，ES形成的速度应等于分解的速度，所以： k1（[E]—[ES]）（[S]） = [ES]（k2+k3） 即：
Km=
所以1/Km表示形成ES的趋势大小 所以1/Km表示形成ES的趋势大小 1/Km表示形成ES
特例： Km=K2/K1=Ks(在K3<<K1，K2时) <<K1 特例： Km=K2/K1=Ks(在K3<<K1，K2时
5. Km与Ks Km不等于Ks。在K3<<K1、K2时， Km看 也只有此时1/ 1/Km 作Ks，也只有此时1/Km 才可以近似表示酶与底
3、米氏方程式的分析
（1）当[S]Km时，v = Vmax[S]/Km ，反应为一级反应。 （2）当[S]Km时， v =Vmax，反应为零级反应。 （3）当v=Vmax/2时，Km=[S]，即米氏常数的含义为反应达 到最大反应速度一半时的底物浓度。它的单位是摩尔/升，与 底物浓度的单位一样。
4、米氏常数的意义
木瓜蛋白酶 胆碱脂酶
PH影响酶活力的原因可能有以下几个方面 ： 1、过酸过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶 变性失活。 2、PH影响底物分子和酶分子的解离状态。最 适PH与酶活性中心结合底物的基团及参与催化的 基团PK值有关，往往只有一种解离状态最有利于 与底物结合，在此PH下酶活力最高；也可能影响 到中间产物ES的解离状态。总之，都影响到ES 的形成，从而降低酶活性。 3、PH可影响酶分子中另一些基团的解离，这 些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活 力中心的构象有关。
（1） Km值是酶的特征性常数之一。它一般与酶的性质有关， 而与酶的浓度无关。不同的酶， Km值不同。 （2）如果一个酶有几个底物，则对每一种底物各有一个特 定的Km值。并且 Km值还受PH及温度的影响。因此，测定酶 的Km值可以作为鉴别酶的一种手段，但必须在指定的实验条 件下进行。
。
（3） Km值可表示酶与底物的亲和力（当k3k1或k2k3 时）。 Km值愈大，亲和力越小； Km值愈小，亲和力越 大。一般Km值最小的底物称为该酶的最适底物或天然底 物。 Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断没的专一 性，并有助于研究酶的活性中心。 （4）可用来判断某一反应所用底物浓度的大小。即可 根据所要求的反映速度求出应当加入底物的合理浓度；也 可根据已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度
c.Hanes-Woolf作图法 c.Hanes-Woolf作图法
Km 1 1 1 = × + V Vmax [S] Vmax
Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图 d. EisenthaFra Baidu bibliotek和Cornish-Bowden直接线性作图 将米氏方程改写为： 将米氏方程改写为：
最适PH可因底物浓度、种类及缓冲液浓度不同而不 同，而且常与酶的等电点不一致，所以该值也不是 常数。
动物：6.5-8.0；植物及微生物：4.5-6.5，但 有例外。如胃蛋白酶为1.5；精氨酸酶为9.7
应当指出的是酶在试管反应的最适PH 与它所在正常生理的PH并不一定完全相同。 这是因为一个细胞内可能会有几百种酶。不 同的酶对此细胞内的生理PH的敏感性不同； 也就是说PH对一些酶是最适PH，而对另一 些酶则不是，不同的酶表现出不同的活性。 这种不同对于控制细胞内复杂的代谢途径可 能具有很重要的意义。
E+A ←→ EA ←→ FP ←→ F ←→ FB ←→ EQ ←→ E+Q 可用以下图式来说明： A P B Q
E——————————————————————→E EA ←→ FP F FB ←→ EQ
米氏方程最初是有Michaelis和Menten提出，然后有 Briggs和Haldane又加以补充与发展。 其公式的推导： 按照酶被底物的饱和现象出发，依据“稳态平 衡”假说理论，推导如下：
米氏方程的推导: 米氏方程的推导:
Michaelis和Menten的酶促反应动力学基础上 的酶促反应动力学基础上， 在Michaelis和Menten的酶促反应动力学基础上， 1925年 Briggs和Haldane提出酶反应分两步进行 提出酶反应分两步进行， 1925年，Briggs和Haldane提出酶反应分两步进行，即 稳态平衡”理论： “稳态平衡”理论： ES的浓度与 的浓度与（ ）（2 ES的浓度与（1）（2）都有关系 第一步： 第一步： （ 1） 第二步： 第二步：
用图式来说明： A B Q P ↓ ↓ ↑ ↑ E———EA———EAB ←→EPQ———EP———E 或者是： B A P Q ↓ ↓ ↑ ↑ E———EB———EBA ←→EPQ———EQ———E 如磷酸化酶催化的反应就属此类： 磷酸化酶 糖原+P————G—1—P+糖原 （3）乒乓反应机理（ping pong mechanism） P B
四、酶促反应动力学 酶促反应动力学（kinetics ofenzymecatalyzed reaction ）是研究酶促反应的速度 以及影响此速度的各种因素的科学。
Michaelis 与 Menten 发展出酶动力学 展出酶动力学
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.258
Michaelis Menten
（一）温度的影响
温度对酶促反应速度的影响具有双重效应。其一是当 温度升高时，随温度的升高反应速度加快（温度系数Q10为 1-2；每增加10 ℃ ，反应速度为原反应速度的1-2倍）；其 二是当温度升高到一定限度时，随温度的升高，酶发生变 性而使速度降低。 [ 说明：温度系数（tempperature coefficient）是指反应温度 升高10度，其反应速度与原来的反应速度之比。] 每种酶都有其最适温度，在温血动物提取的酶，其最适 温度一般为35-40℃；植物的为40-50℃；某些细菌的酶可 高达70℃ 。 最适温度不是酶的特征性常数，随环境因素而变化。 酶干燥状态下和低温下保存较好。
最适温度
T℃
(二）PH的影响
在一定的pH 在一定的pH 下, 酶具 有最大的催化活性, 有最大的催化活性,通 胃蛋白酶 常称此pH 常称此pH 为最适 pH)。 pH(optimum pH)。 a.过酸或过碱影响酶蛋白 a.过酸或过碱影响酶蛋白 的构象，使酶变性失活。 的构象，使酶变性失活。 b.影响酶分子中某些基团 b.影响酶分子中某些基团 的解离状态（ 的解离状态（活性中心 的基团或维持构象的一 些基团） 些基团） c.影响底物分子的解离状 c.影响底物分子的解离状 态 缓冲液体系
（k2+k3）/k1=
（[E]—[ES]）（[S]） /[ES]
令Km= （k2+k3）/k1 ，则有 Km= （[E]—[ES]）（[S]） /[ES] 也就是 [ES]=[E][S]/（Km+[S]） 因为反应速度的大小与[ES]成正比，即v=k3[ES]，将 其带入上式则变换为： v=k3[E][S]/（Km+[S]） 而当底物浓度很高时，酶全部被底物所饱和，此时 [E]=[ES]，而反应速度达到最大反应速度，即： Vmax=k3[ES]=k3[E]，所以将其带入上式即可得到以下 表达式： v=Vmax[S]/（Km+[S]） 即米氏方程式。
6、多种底物的反应
实际上大多数酶反应的机理是比较复杂的，一般包含有一种以上的底物，至 少也是两种底物，即双底物反应： E A+B——→P+Q 目前认为大部分双底物反应可能有三种反应机理： （1）依次反应机理（ordered mechanism） B P
E+A ←—→EA ←—→EAB ←→EPQ ←—→EQ ←—→E+Q 用图式说明： A B P Q ↓ ↓ ↑ ↑ E———— ———— ———— ———— ————→E EA EAB ←—→EPQ EQ 需要NAD+或NADP+的脱氢酶的反应就属此类型。 （2）随机机理（random mechanism ） 加入底物A及B后，产物P及Q以随机的方式释放出来。 同时，底物的加入也是随机的，E可以先和A结合，也可以先和B结合，其结 果都是形成中间产物EAB。在产物释放时，可先释放P，也可先释放Q。
底物浓度对反应速度的影响
提 高 底 物 浓 度 增 强 酶 活 性 表 現
80 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8
生 成 40 物 浓 20 度
0 0 2 4 6 8
S + E ↓ P
在 固 定 時 間 內 反 應 (
底物浓度 mole
2、米氏方程式 人们曾提出各种假说来解释上述现象，其中比较合理的解 释是“中间产物学说”。按此学说，1913年前后Michaelis and Menten在前人工作的基础上，作了大量的定量研究，积累了足 够的实验证据，从而提出酶促动力学的基本原理，并归纳出一 个数学表达式，即： =Vmax[S]/ Km+[S] v =Vmax[S]/（Km+[S]） 此式即为米氏方程式，它的前提是酶与底物的“快速平衡 说”——开始反应速度快，迅速地建立平衡。米氏方程式圆 满地表示了底物浓度与酶反应速度间的定量关系。这就使 “中间产物学说”得到了人们的普遍承认，现在一般称为 “米氏学说”。
1、底物浓度对反应速度的影响 底物浓度（substrate concentration）对反应速度的影响比较复杂。在一定的酶浓 度下，如将初速度对底物浓度的关系作图，可以发现：当底物浓度较低时，反应速 度与底物浓度成正比，表现为一级反应（first order reaction）。随着底物浓度的升 高，反应速度不再按正比升高，表现为混合级反应（mixed order reaction）。若再增 加底物浓度，曲线表现为零级反应（zero order reaction），这时尽管底物浓度还可 以不断增加，但反应速度却不再增加，说明酶已被底物所饱和，反应速度达到了最 大反应速度。如下图。
物结合的难易程度。 物结合的难易程度。 无抑制剂时，ES的分解速度与形成速 6.Km与Km′ 无抑制剂时，ES的分解速度与形成速 度的比值符合米氏方程， 度的比值符合米氏方程，为Km; 而有抑制剂时发 生变化，则不符合米氏方程， 生变化，则不符合米氏方程，为Km′ 。
7.Km可以帮助推断某一反应的方向和途径 7.Km可以帮助推断某一反应的方向和途径 Km Km=1.7x10-5mol/L 乳酸脱氢酶 乳酸
a.双倒数作图法
(Lineweaver-Burk) Lineweaver1.0 0.8
斜率=Km/Vmax 斜率
0.6 1/v 0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0 2 4
-1
0.0 -4 -2 6 8 10 1/[S](1/m ol.L ) m
v-v/[S]作图法 b. v-v/[S]作图法 Eadie(Eadie-Hofstee) 将米氏方程改写： 将米氏方程改写：
三）酶浓度的影响 在酶促反应中，如果底物 浓度足够大，足以使酶饱和， 则反应速度与酶浓度成正比。 如右图。 这种正比关系可由下式表 示： V=K[E] 该式也可以由米氏方程推 导出来。式中的K表示K3[S]/ （Km+[S]）。 注意：使用的酶必须是纯酶制 剂或不含抑制物的粗酶制剂。
（四）底物浓度的影响
丙酮酸
丙酮酸脱氢酶
乙酰CoA 乙酰CoA 乙醛
Km=1.3x10-3 mol/L Km=1.0x10-3mol/L
丙酮酸脱羧酶
米氏常数Km和Vmax的求法的求法 5. 米氏常数 的求法
V m ax [S ] V= K m + [S]
Km 1 1 1 = × + V Vmax [S] Vmax