水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究

收稿日期：2007-07-27 * 通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(30560096)；教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0540)作者简介：李欣(1980-)，女，博士研究生，研究方向为食品生物技术。

水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的

初步研究

李 欣1,2，高金燕3， 陈红兵1,2,*

(1.南昌大学 食品科学教育部重点实验室，江西 南昌 330047；

2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；

3.南昌大学食品系，江西 南昌 330047)

摘 要：为绘制水牛奶中β-乳球蛋白的过敏原表位，本实验以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗体IgG 为固相筛选分子，免疫筛选噬菌体随机七肽库，采用间接ELISA 和竞争抑制ELISA 鉴定阳性克隆。经四轮富集后，得到16个阳性克隆子，进行测序，得到5个不同的肽段。与已知的表位比对，初步确定了六个I g G 识别表位，分别为：第41～51位(VYVEELKPIPE)、第51～64位(EGDLEILLQKWENDE)、第81～96位(VFKIDALNE NKVLVLD)、第141～56位(KALPMHIRLSFNPTQL)、第127～136位 (LNENKVLVLD)和第145～159 位(MHIRLSFNPTQLEEQ)。关键词：水牛乳；β-乳球蛋白；筛选；表位定位；食物过敏

Primary Epitope Mapping of β-Lactoglobulin from Buffalo Milk

LI Xin 1,2，GAO Jin-yan 3，CHEN Hong-bing 1,2,*

(1.Key Laboratory of Food Science, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China；

2.Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；

3.Department of Food Science, Nanchang University, Nanchang 330047, China)Abstract ：To map the mimotopes of β-lactoglobulin from water buffalo milk, the specific rabbit antibody against buffalo β-lactoglobulin were used to pan the specific phage from a heptapeptide phage display library. The positive clones were identified by indirect ELISA and competitive ELISA. After fourth round enrichment , sixteen positive clones were obtained and five different clones peptide sequence were deduced by DNA sequencing. Compared with the known IgG epitopes of β-lactoglobulin,six epitopes have been identified, which are located at fragment 41～51(VYVEELKPIPE), fragment 51～64(EGDLEILLQKWENDE),fragment81～96(VFKIDALNE NKVLVLD), fragment 141～156(KALPMHIRLSFNPTQL), fragment127～136(LNENKVLVLD) and fragment 145～159(MHIRLSFNPTQLEEQ respectively.

Key words ：buffalo milk ；β-lactoglobulin ；panning ；epitope mapping ；food allergy

中图分类号： TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)10-0360-04

牛乳β-乳球蛋白是乳清中的一种主要蛋白质，由162个氨基酸残基组成，分子量约为18.4kDa，是牛乳中的主要过敏原之一。β-乳球蛋白有五个异构体分别为：A 、B 、C 、D 和D r ，其中A 和B 比较常见。而水牛乳中也含有丰富的β-乳球蛋白，两者除第1和162位的氨基酸不同，其余氨基酸序列一致。水牛乳的β-乳球蛋白只有一个突变体，根据泳动速度和离心情况，与B 型相似。有研究表明，两者的存在着免疫交叉反应[2]。因此，水牛乳中的β-乳球蛋白的过敏问题也值得研究。本实验采用随机肽库筛选水牛乳中β-乳球蛋白

的模拟表位,与已知序列比对，对其IgG 结合表位进行初步定位，可以初步阐明水牛乳中β-乳球蛋白过敏原的物质基础。1材料与方法1.1

材料

噬菌体7肽库(Ph.D-7.TM Phage Display Peptide Library) New England Biolabs公司，库浓度为6.00×1012pfu/ml，受体菌为E.coli 2738，-96g III自动测序引物。主要试剂：H R P 抗M 13单抗(1:5000稀释工作浓

度) Amersham Biosciences公司；邻苯二胺 Sigma公司，溶于柠檬酸和磷酸氢二钠的底物缓冲液，底物浓度0.4mg/ml。离心机，Bio-Rad 凝胶呈像仪，Bio-Rad M680自动读板仪。抗水牛乳β-乳球蛋白兔IgG，本实验室采用免疫亲和层析方法制备，浓度为5.8mg/ml，纯度达电泳纯。水牛乳β-乳球蛋白是本实验室通过离子交换层析和凝胶层析方法制备，其浓度为43mg/ml，纯度高于商品化的β-乳球蛋白，即大于90%。

1.2方法

1.2.1噬菌体随机肽库的筛选　

将纯化的多克隆抗体IgG用包被缓冲液(0.1mol/L NaHCO3，pH8.6)稀释至10μg/ml，每孔100μl包被96孔酶标板,4℃轻微震荡，孵育过夜。弃去包被液，每孔加满封阻液(0.1mol/L NaHCO3，5mg/ml BSA，0.02%的NaN3)，4℃封阻2h；用TBST(50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)快速洗板六次，每孔加入2×1011个噬菌体，室温轻摇震荡60min；弃去未结合噬菌体液，用T B S T洗板10次，每孔加入甘氨酸洗脱液(0.2mol/L pH2.2 Glycine-HCl，1mg/ml BSA) 100μl，室温轻摇10m i n，洗脱特异性结合的噬菌体，收集洗脱液于微量离心管，加入中和缓冲液；留取5μl用于滴度测定，剩余洗脱物进行扩增，用于下一轮筛选。同样的方法进行第2、3、4轮筛选，洗脱液中的Tween-20浓度依次为0.25%、0.5%、0.5%。

1.2.2待测随机克隆的挑选

E.coli2738过夜培养物以1:100进行稀释加到试管中,第3和4轮的平板上挑取30个单菌落加到试管中，37℃摇培养4.5～5h培养物转入微量离心管中，离心30s。上清转入另一管中，再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，进行E L I S A 检测及D N A序列测定。

1.2.3噬菌体滴度的测定　

用L B培养基对洗脱液进行倍比稀释，分别取各稀释度的噬菌体加入到制备好的对数生长期的E.coli 2738菌液中，室温温育后加入到上层琼脂中混匀，均匀铺于平皿上，培养过夜。记录平皿上蓝斑个数。噬菌体滴度=平皿中蓝斑个数×稀释倍数，即每10μl的噬菌体形成单位。

1.2.4间接ELISA鉴定阳性克隆

用包被缓冲液稀释抗体(100μg/ml)，每孔100μl包被96孔酶标板，4℃过夜。弃包被液，每孔加满封阻液，4℃封阻2h。0.5%T B S T洗板3次，每孔一个克隆的上清液，37℃ 2h，洗板三次，加入1:5000稀释的HRP conjugate anti-M13抗体100μl/孔，室温孵育1h，洗板后加100μl/孔OPD底物显色液，室温作用10～20min 显色，2mol/L H2SO4终止反应，490nm处读数[3]。

1.2.5间接抑制ELISA方法

用包被缓冲液稀释抗体(100μg/ml)，每孔100μl包被96孔酶标板，4℃过夜。弃包被液，每孔加满封阻液，4℃封阻2h。0.5%T B S T洗板三次，每孔加50μl扩增的噬菌体和50μl 1mg/ml水牛乳β-乳球蛋白，37℃ 2h，洗板三次，加入1:5000稀释的HRP conjugate anti-M13 抗体100μl/孔，室温孵育1h，洗板后加100μl/孔OPD底物显色液，室温作用10～20min显色，2mol/L H2SO4终止反应，490nm处读数。

1.2.6D N A提取和序列测定

从1.2.3中挑到的噬菌斑进行扩增，得到的噬菌体上清用 PEG/NaCl进行沉淀。沉淀物重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10m i n。离心10m i n，弃上清；用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μl TE[10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1m m o l/L E D T A]中，琼脂糖凝胶电泳鉴定。D N A序列的测定是自动双脱氧方法，由上海生工完成。公司提供的自动测序引物：-96 III 5'-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。

2结果与分析

2.1亲和淘选结果

从表1可知，第四轮筛选后的噬菌体产出率比第一轮高1000倍，说明经过四轮的筛选可以有效富集特异性噬菌体。

2.2间接ELISA和间接抑制ELISA进行阳性克隆子鉴定

按1.2.2步骤，从第三轮和第四轮分别挑选的30个克隆子，分别标为1～30号。将收集上清进行间接E L I S A，测定其吸光值，结果如图1和2所示。从图1和2分别筛选14和2个效价较高的克隆，其中第三轮的两个克隆分别标为6(3)和28(3)。将这16个克隆子进行扩增，再通过间接E L I S A和竞争抑制E L I S A，测定其吸光值，结果如图3和4所示。可知所得到的16个克隆子均被抑制，被确定为阳性。

2.3测序及表位初步定位结果

D N A测序结果表明，有5个不同的核苷酸序列，将其分别编号为I、I I、I I I、I V、V，对应的氨基酸表1 亲和淘选噬菌体随机肽库的回收率

Table 1 Recovery of washed phages by biopanning

淘选轮数投入量(pfu)产出量(pfu)回收率12×10113×104 1.5×10－7 22×10112×105 1.0×10－6 32×10116×106 3.0×10－5 42×10112×107 1.0×10－4