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酶工程
第二章 酶的发酵工程
（四）酶生物合成的阻遏作用
1. 终产物阻遏 某一代谢（合成）途径的终产物阻遏合成途径中酶
的合成的现象。
A E1 B E2 C E3 D E4 E
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第二章 酶的发酵工程
2. 分解代谢物的阻遏作用 当培养基中存在两种碳源（底物）时，容易利用的碳
源的分解代谢产物阻遏分解代谢另一种碳源的酶的合成 的现象。
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第二章 酶的发酵工程
（三）增强子促进酶的生物合成
增强子：是一段能够提高转录效率的特定DNA序列，长 约100~200bp，核心组件8~12bp，单拷贝或多拷贝串联存在。
增强子的作用特点：
（1）提高同一条DNA链上基因的转录效率，可远距离发 挥作用，在基因的上游或下游均可起作用。
（2）与其序列的正反方向无关。 （3）要有启动子才能发挥作用，但对启动子没有严格的 专一性。 （4）必须与特定的蛋白质因子结合才能发挥作用，具有 组织和细胞特异性。
葡萄糖效应：葡萄糖抑制微生物利用其他碳源（底物） 的现象 。
cAMP-CAP
I
P
OZ Y A
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二、真核生物中酶生物合成的调节
（一）细胞分化改变酶的生物合成
如：端粒酶的生物合成
（二）基因扩增加速酶的生物合成
如：爪蟾卵细胞形成时，rRNA的基因数增加4000倍； 中国田鼠细胞培养在含有氨甲基蝶呤的培养基中生长时， 细胞中编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增，以合成大量 的二氢叶酸还原酶。
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第二章 酶的发酵工程
6. 菌种的退化与复壮 （1）菌种退化现象：随着菌种保藏时间的延长或多次的
转接传代，菌种本身所具有的优良遗传性状发生了不利于 发酵生产的遗传变异现象。
（2）防止退化措施：创造合适的培养条件，采取有效的 菌种保藏方法，尽量减少传代次数。
（3）退化菌种的复壮：纯种分离和性能测定。包括已发 生退化菌种的复壮和菌种退化之前的复壮和提高。
醚，泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油）。勤加、少加较好
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5. 湿度对产酶的影响与控制
对固体发酵产酶而言，影响微生物的产酶量，也会影响 产酶达到高峰的时间。
特定菌种，发酵过程的不同时期，对湿度要求不同。固 态发酵产酶，前期湿度低，后期湿度高，有利于产酶。
调节控制
配制培养基时，控制物料的含水量；控制鼓风量大小，或 调节空气的湿度；喷洒水分
培养基 营养成分丰富，尽可能满足细胞生长繁殖； 营养成分尽可能与发酵培养基接近；pH值稳定
培养条件 必须是菌种细胞生长繁殖的最适条件；包括 温度、pH值、通气搅拌、通风、翻曲、湿度
种龄 生命力最为旺盛的对数生长期。细菌：7~24h; 霉菌：16 ~ 50h; 放线菌：21~64h;
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第二章 酶的发酵工程
劳动强度大；原料利用率低；产酶纯度差，提取精制
困难；传质传热效率 低，发酵条件不易控 制，产酶不稳定；不 能进行胞内酶的生产。
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第二章 酶的发酵工程
（三）分批发酵
特点：操作简单；发酵初期营养物过多可能抑制微 生物的生长，中后期可能因为营养物的减少及有害代谢 产物的积累而降低培养效率
（四）连续发酵
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第二章 酶的发酵工程
2. 菌种的分离纯化 平板划线法、稀释涂布分离法
3. 产酶性能的测定 初筛： 快速、简便；平板筛选法—有色圈。 复筛： 精确；液体或固体培养发酵，测定产酶水平。
4. 菌种的选育 诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种、基因工程育种
5. 菌种的保藏 斜面低温保藏法、沙土管保藏法、石蜡油封藏法、真空冷 冻干燥法、超低温保藏法、固体曲法等。
醇、EDTA等
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（二）培养条件对产酶的影响与调节控制
1. pH对产酶的影响与调节控制 细菌、放线菌：中性至微碱性；霉菌、酵母菌：微酸性 培养基pH的改变会影响产酶的种类或比例 调节控制 控制培养基的组分或比例；添加pH缓冲物种；流 加酸碱溶液或补料；提高空气流量
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第二章 酶的发酵工程
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第二章 酶的发酵工程
3. 溶解氧对产酶的影响与调节控制
临界氧浓度——不影响细胞正常代谢的最低氧浓度 溶氧浓度是由溶氧速率和耗氧速率来决定的。
调节控制
① 调节氧分压 改变进气压力或罐压，改变氧含量，
② 增加通气量
添加氧载体
③ 延长气液接触时间，增加气液接触面积
④ 改变培养液的性质 改变组分或浓度，添加消泡剂
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第二章 酶的发酵工程
一、酶的生产菌种
（一）产酶微生物的种类 1. 细菌：大肠杆菌—青霉素酰化酶、L-天冬酰胺酶；
枯草芽孢杆菌—中性蛋白酶、中温α-淀粉酶； 地衣芽孢杆菌—高温α-淀粉
2. 放线菌：葡萄糖异构酶、谷氨酰胺转氨酶
3. 酵母菌：凝血激酶、尿激酶、植酸酶
4. 霉菌：黑曲霉、米曲霉—α-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶、
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第二章 酶的发酵工程
第一节 酶生物合成的调节机制 第二节 酶的发酵技术 第三节 酶发酵动力学
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第二章 酶的发酵工程
第一节 酶生物合成的调节机制
一、原核生物中酶生物合成的调节
原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，调 节方式主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式。
原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制都可以用 Jacob和Monod提出的操纵子理论来解释。
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第二章 酶的发酵工程
三、酶生物合成调节作用机理的实际应用
（一）发酵中的应用
（二）酶生产中的应用
（三）微生物菌种选育中的应用
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第二章 酶的发酵工程
第二节 酶的发酵技术
利用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控 制发酵过程，大规模产酶的技术，称为酶的发酵技 术。内容主要包括：菌种的选育、培养基的配置、 培养条件控制、发酵方法。
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第二章 酶的发酵工程
2. 乳糖操纵子的诱导机制
（1）乳糖（操2）纵阻子遏的蛋结白构的（负3性）调CA节P；的正性调节
cAMP-CAP β-半乳糖苷酶 透过酶 乙酰基转移酶
DNA
I
P
OZ Y A
RNA聚合酶
mRNA
诱导物
阻遏蛋白
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（二）色氨酸操纵子学说
分支酸 邻氨基苯甲酸 磷酸核糖邻氨基苯甲酸 羧苯氨基脱氧核糖磷酸 吲哚甘油磷酸
2. 温度对产酶的影响与调节控制 不同的微生物生长与产酶的最适温度各不不同；
很多微生物发酵产酶的最适温度与生长繁殖的最适温 度不同，且往往低于生长最适温度。
在酶发酵生产的不同阶段控制不同的温度条件， 进行变温发酵。
调节控制
液态发酵可利用发酵罐的夹套、盘管或蛇管等通过 温（冷）水进行调节控制，固态发酵可通过通风量或风 温来进行调节。
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第二章 酶的发酵工程
（四）菌种活化与扩大培养
1. 菌种扩大培养
保藏菌种 试管斜面活化 三角瓶培养 种子罐培养
2. 种子制备的过程 防止杂菌污染，减少转接次数，避免种子培养基的长时
高温灭菌；培养基及培养条件是细胞生长繁殖的最适条件； 培养时间以对数生长期为宜。
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第二章 酶的发酵工程
3. 种子质量的控制 （1） 影响种子质量的因素及其控制
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第二章 酶的发酵工程
第二章 酶的发酵工程
所有的生物为了维持其正常的生命活动，在一定 的条件下都能够合成其自身生长所需要的各种酶，酶 的种类和数量是受到细胞自身的严格调控的。
通过人为的操作控制，利用生物细胞的生命活动 来大规模发酵生产人们所需要的酶的技术过程，称为 酶的发酵生产。
酶的制备方法：提取法、发酵法、合成法。
优点：可有效实现自动化，降低劳动强度，设备利 用率高，可消除反馈阻遏作用，酶产率高。适合于与生 长相偶联的发酵产物的生产。
缺点：菌种易变异退化，易染杂菌。原料利用率低， 生产成本增加。
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第二章 酶的发酵工程
（五）补料分批发酵
优点：可解除营养基质的抑制和分解代谢物阻遏作 用；可改善好氧发酵的溶氧状况；减少菌体生成量，提高
脂肪酶；理氏木霉—木聚糖酶、纤维素酶； 青霉—葡萄糖氧化酶、5/-磷酸二酯酶
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第二章 酶的发酵工程
（二）产酶菌种的要求
（1）酶的产量高； （2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，便 于管理； （3）菌株遗传性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保 证生产的稳定性； （4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低； （5）有利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶； （6）菌株安全可靠，非病原菌，不产毒素及其它有害物质，不 影响生产人员的身体健康； （7）基因工程菌必须符合安全性要求。
色氨酸
邻氨基苯甲酸合酶 邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶 吲哚甘油磷酸合酶 色氨酸合酶
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第二章 酶的发酵工程
1. 操纵子的调节作用
DNA
R
PO
E D C BA
mRNA
辅阻遏物
（色氨酸）
阻遏蛋白原
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2. 衰减子的调节作用
DNA
R
PO
1
前导序列
E D C BA
有用产物的转化率；菌丝 减少可降低发酵液的粘度， 便于发酵培养物的输送及 后处理；不易产生菌种退 化和变异，杂菌污染易控 制；使用范围广。
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第二章 酶的发酵工程
四、提高产酶的措施
（一）添加诱导物
诱导物类型：作用底物、反应产物、底物类似物
（二）降低阻遏物浓度
分解代谢物阻遏、末端产物（反馈）阻遏