Southern 杂交试验方案—本实验室
southern印迹杂交操作流程
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Southern杂交实验
Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
实验四 植物DNA的大量提取与Southern杂交
实验四植物DNA的大量提取与Southern杂交第一天一、植物DNA的大量提取CTAB法：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。
NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中。
β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
材料：转基因植株步骤：1)取20 mL CTAB提起液于50 mL离心管中，65℃预热。
2)取5克新鲜幼嫩叶片，加液氮磨成粉末，转入盛有预热提起液的离心管内，迅速搅拌均匀。
3)于65℃水浴提取1 h。
冷却至室温。
4)加等体积氯仿-异戊醇（24∶1），充分混合均匀。
5)离心（4000r/min，15分钟）。
6)上清液用等体积氯仿-异戊醇抽提1次（4000 rpm，15 min）。
7)上清液中加入2/3体积的异丙醇，摇匀。
此时应有絮状DNA出现。
8)挑出DNA，置于10 mL离心管中。
加76％乙醇浸泡1 h9)离心（3000 g，4℃）15 min10)沉淀DNA用76%乙醇洗2次，自然晾干11)沉淀加入5 mL 1 mol/L pH8.0 TE buffer，5 µL RNase A（1.0mg/ mL），56℃温浴至全部溶解12)加入预冷的等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，摇匀，4°C静置10 min，离心(3000 g, 20 min)13)上清液加入1/10体积5 mol/L NaAc，2倍体积乙醇，-20o C放置1 h或过夜。
Southern杂交
PCR扩增线粒体基因(atp9 gene as sample)以提取的基因组DNA为模板进行PCR反应。
PCR反应体系：Template 0.5μL10×Taq buffer (含Mg2+ ) 5.0μLdNTP (2.5mM) 4.0μLPrimer F (20μM) 1.0μLPrimer R (20μM) 1.0μLTaq酶(2.5U/μL)0.5μLddH2O 38μLTatal 50μLPCR反应热循环程序为：1）94℃预变性5min，2）94℃变性45s，3）60℃退火45s，4）72℃延伸1min，5）Go to step2，35 cycle；6）72℃延伸10min。
7）4℃保存。
PCR反应在Biometra（Bio-Rad）PCR仪上进行。
退火温度按照每个基因的引物Tm值确定。
扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，EB染色，凝胶成像仪照相。
照相后将目的条带用刀切下后，用凝胶回收试剂盒回收。
据实验室经验，模板应在200-2000bp，一般选择1000bp。
基因探针的标记将基因片段回收后，用分光光度计进行定量，取1 µg回收DNA，定容到16 µL。
沸水浴煮10min，快速放到冰中（5min），然后快速离心10秒，再放回冰浴中10min。
加入4 µL充分混合的DIG-High Prime，混匀，37℃反应20h，其间手指弹外壁混匀数次。
标记结束后，65℃加热10分钟终止反应。
原实验室操作：标记结束后，沸水浴10min，冰上速冻，然后放入-20℃冰箱备用。
（此时已变性。
）个人建议：探针标记好后每2µL分装，暂不变性。
待用时变性。
孟老师建议，标记后直接变性，冻存，用时解冻直接用，不再变性。
没有问题。
冰乙醇混合物温度较冰低。
DNA Ladder的标记取1 µg（2µl）进行标记，方法同上。
Northern杂交实验
b)在可见光下用黄色滤光片对染色的膜照像。
c)照像后，将膜放入0.2×SSC和1%（m/v）SDS中室温脱色15min。
注：用适宜的方法将RNA固定在膜上后，可直接进行杂交，也可用锡箔纸或滤纸宽松包装，真空下储存于室温。
总RNA的甲醛凝胶电泳、变性RNA的转膜及固定。
A：在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳
方法采用萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版。
注：可加入溴化乙锭在甲醛凝胶中
试剂：溴化乙锭（用DEPC处理的水配制）
甲醛37%--40%
甲酰胺
试剂：
10×甲醛凝胶电泳加样缓冲液
50%甘油
10 m mol/L EDTA(Ph8.0)
转移膜的准备
5、用新的解剖刀或切纸刀裁一张长宽均大于胶1MM的尼龙膜。
6、将尼龙膜漂浮在去离子水表面直至滤膜从下往上全部湿透，然后将膜侵入10×SSC中至少5分钟，用干净的解剖刀切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。
转移系统的安装和RNA转移
7、将胶倒转后置于平台上滤纸的中央，确保厚滤纸和胶之间没有气泡滞留。
含1%SDS的0.2*SSC
20*SSC：
在800mL水中溶解175.3g NaCL和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaOH溶液调pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。
转移缓冲液：
碱性转移至带正电荷的膜：用0.01mol/L NaOH和3mol/L NaCL
中性转移至不带电荷的膜：用20*SSC
50×TAE：242克Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA(Ph8.0)，定容至1000ml
实验六 southern杂交ECL检测
实验六水稻基因组DNA的Southern杂交与非放射性ECL直接核酸标记及检测【实验目的】通过本实验学习和掌握Southern转膜、辣根过氧化物酶直接标记探针、Southern杂交及增强化学发光（ECL）检测分子杂交结果的过程。
【实验原理】Southern杂交是一项在复杂的背景基因中识别特异性DNA序列的重要技术之一，它是Southern于1975年首创的杂交方法。
其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链DNA在一定的条件下可按碱基互补原则（A=T,C=G）形成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及标记的探针。
此杂交过程是高度特异性的。
ECL直接核酸标记及检测系统用辣根过氧化物酶（HRP）直接标记探针。
该法用带正电荷的核酸标记试剂（经修饰成为带正电荷的HRP聚合体：HRP—对苯醌—聚乙烯亚胺复合物）与变性过的、带负电荷的单链核酸探针松散连接，然后加入戊二醛，在戊二醛的化学交联作用下与带负电荷的单链DNA共价结合，从而标记DNA。
标记的探针DNA与膜上的单链DNA杂交形成双链DNA，探针上的HRP在H2O2存在下，催化H2O2还原，同时使鲁米诺氧化并伴随蓝光产生，在增强剂的作用下使产生的光加强，从而可在X光片上检测。
首先将经限制性内切酶酶解的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离以及在凝胶上经NaOH处理使之变性，然后将尼龙膜（Hybond-N+）放在凝胶上，使之按原有顺序将条带转移至膜上并固定起来，这是Southern 转膜过程。
Southern膜杂交是将吸附并固定在Hybond-N+尼龙膜上的DNA片段与一个标记的探针杂交，最后经过显影从Ｘ光片上显现出杂交分子的区带。
本实验中，经琼脂糖凝胶电泳分离的水稻基因组DNA酶切产物，通过Southern转移，将其吸印在Hybond-N+尼龙膜上，通过辣根过氧化物酶直接标记探针，与膜上的水稻DNA进行杂交，再用增强的化学发光方法得到分子杂交结果。
本实验所用的探针来源于水稻和大麦，具有抗病基因NBS-LRR结构特点的DNA探针，因此水稻DNA 和探针之间有较好的同源性，可得到杂交带，可满足初学者对Southern杂交方法进行训练。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
southern_杂交实验流程
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％ SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
Southern 印迹杂交实验报告
Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
【实验步骤】1、基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。
老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。
总体积20μL。
37℃保温1.5小时。
2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL（稀释10,000倍）。
浇板，水平放置，待凝。
胶凝后按照以下顺序加样。
两组共用一块凝胶，共7个样。
①基因组DNA10 20μl （自己的）②基因组DNA10 μg（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)⑤酶切样品⑥基因组DNA10 μg （老师的）⑦基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。
southern杂交
2.1.3.6.3 虹吸法转膜主要试剂：变性液：1.5M NaCl，0.5M NaOH中和液：1M Tris-HCl（PH8.0），1.5M NaCl转移液（20×SSC）：3M NaCl ，0.3M 柠檬酸钠PH7.0400mL 水中加入87.65gNaCl 和44.1g 柠檬酸钠，用NaOH 调节PH7.0,定容至500mL。
DIG Easy Hyb 工作液：分两次加入64mL 灭菌ddH2O 到DIG Easy Hyb Granules 中，37℃迅速搅拌溶解5分钟。
洗涤液Ⅰ：2×SSC，0.1％SDS洗涤液Ⅱ：0.5×SSC，0.1％SDS马来酸缓冲液：0.1M 马来酸，0.15M NaCl用NaOH 调节PH8.0，15— 25℃保存。
洗液：含0.3％（v/v）吐温20 的马来酸缓冲液。
检测液：0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl PH9.5，15— 25℃保存。
（6）封闭液：（现用现配）用马来酸缓冲液稀释封闭原液10 倍。
（4）抗体液：（现用现配）12000rpm 离心anti-digoxigenin-AP，5 分钟，用封闭液稀释10000 倍。
（5）D-76 显影液：将盒内小袋药粉，溶解于适量温水（约50℃）中，完全溶解后继续溶解大袋药粉，待全部溶解后，加清水至1000mL 使用。
酸性定影液：先用适量温水（约25℃）将药粉溶解，待溶解后，加清水至1000mL。
实验步骤：转膜：（1）DNA 样品经适当的限制性内切酶酶切后，电泳；（2）电泳完毕后，将无用的凝胶部分切除，将凝胶的右下角切去，以便定位；（3）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温1 小时，不间断地轻摇（对于较大的DNA 片段，变性前可使用0.2M HCl 预处理10 分钟，再进行碱处理）；（4）将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的中和液中30 分钟，不间断轻摇。
换新鲜中和液，继续浸泡15 分钟；（5）在玻璃平台上铺一层Whatman 3MM 滤纸，盆中盛满20×SSC。
DIG探针的Southern 杂交
【实验目的】
1．了解Southern 杂交的基本原理及其应用。 2．掌握地高辛标记探针的Southern杂交的基本方法。
【实验原理】
1.探针合成： 1.1 PCR方法
变性后的线性 DNA
Байду номын сангаас
Taq酶
加入
dATP, dCTP, dTTP,dGTP+Dig-dUTP 特异引物
【实验原理】
1.探针合成： 1.2 随机引物法
变性后的线性 DNA
Klenow酶
加入
dATP, dCTP, dTTP,dGTP+Dig-dUTP 随机引物
2.电泳分离DNA样品，并转移至尼龙膜：
标记 点样孔
切胶
凝胶
重物 吸水纸 厚滤纸 保鲜膜 转移缓冲液 支持物
吸水纸
玻璃板
尼龙膜 凝胶 厚滤纸
2.电泳分离DNA样品，并转移至尼龙膜：
－ +
－ +
－
+
紫外交联
尼龙膜
吸水纸
3.探针杂交：
a.预杂交
尼龙膜
预杂交液
b. 杂交
加入已变性的探针
适宜的 杂交温度
适量的 探针
适宜的 杂交时间
4.检测反应 a.加入抗DIG-AP抗体（偶联了碱性磷酸酶的抗地高辛抗体）
加入抗体
4.检测反应 b.加入CSPD ready_to_use CSPD (ready to use)
4.检测反应 c.曝光，记录结果
GnRH
β-actin
Southern杂交步骤
Southern杂交实验步骤一实验所需溶液1. Denaturation Solution(1L)0.5M NaOH; 1.5M NaCl 2. Neutralization solution(PH7.5) (1L)0.5M Tris-HCl; 3M NaCl 3. 20 X SSC(PH7.0) (2L)3M NaCl; 0.3M Sodium citrate 4. Maleic acid buffer(PH7.5) (1L)0.1M Maleic acid ; 0.15M NaCl 5. Detection Solution(PH9.5) (1L)0.1M Tris-HCl; 0.1M NaCl 6. DNA Hybridization Solution Ⅰ5XSSC0.02%SDS0.1% N-lauroylsarcosine2%Blocking reagentMaleic acid buffer7. RNA Hybridization Solution Ⅱ5XSSC0.02%SDS0.1% N-lauroylsarcosine1%Blocking reagent50% Formamide8. 0.5 X Wash buffer Ⅰ0.5 X SSC0.1% SDS9. Wash buffer ⅡMaleic acid buffer0.3%(v/v)Tween20 10．10% Lauroylsarcosine sodium(40ml)称量4.12g Lauroylsarcosine sodium 溶于40ml 水中。
二探针的制备（RNA探针和DNA探针）1 DNA探针的制备（参考DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ）（1）利用设计的特异性引物扩增目的DNA，并且回收纯化，使其达到模板DNA的条件。
（2）向一个反应管仲中加入1μg模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μL。
Southern杂交
实验九Southern 印迹杂交目的要求：了解核酸Southern印迹杂交的原理及其操作过程。
核酸杂交原理：核酸分子杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术。
其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的两条多核苷酸链,按碱基配对原则形成稳定的双链分子。
若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。
探针与其互补的的核苷酸序列杂交后杂交体也就带上了同样的标记，可被检测出来。
这样，以特定的已知核苷酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定以及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。
核酸分子杂交分为两类，即Southern杂交和Northern杂交。
Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，常用于外源基因整合的鉴定及分析。
Northern杂交是以DNA 或RNA为探针，检测RNA链，常用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。
Southern 杂交是研究DNA物理图谱的基本技术，在DNA遗传诊断及PCR产物分析等方面有重要应用。
Southern印迹杂交基本方法是将DNA用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下将DNA从凝胶中转印至膜上，烘干固定后即可用于杂交。
凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
附着在滤膜上的DNA与标记的探针杂交，利用放射自显影术或其它显影技术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
实验材料和试剂：变性缓冲液：1.5M NaCl 0.5M NaOH中和缓冲液：0.5M Tris-HCl(pH8.0) 1.5M NaCl20×SSC：3 M NaCl 0.3M柠檬酸钠pH7.0待检PCR DNA样品实验操作步骤：DNA 凝胶电泳和转膜1.配制0.8% 的琼脂糖凝胶，3-4V/cm电压电泳。
Southernblotting实验方法
Southernblotting实验⽅法Southern 杂交的实验⽅法Southern 杂交是分⼦⽣物学的经典实验⽅法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进⾏杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显⽰出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的⽚段以及该⽚段的长度。
该项技术⼴泛被应⽤在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作⽐较烦琐、费时，所以现在有⼀些其他的⽅法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是⽬前其他⽅法所不能替代的，如限制性酶切⽚段的多态性(RFLP)的检测等。
⼀、基因组DNA的制备（前述）⼆、基因组DNA的限制酶切根据实验⽬的决定酶切DNA的量。
⼀般Southern杂交每⼀个电泳通道需要10-30µg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品⽬录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，⼀般⽤2-4U的酶消化1µg 的DNA。
消化的DNA浓度不宜太⾼，以0.5µg /µl 为好。
由于内切酶是保存在50%⽢油内的，⽽酶只有在⽢油浓度<5%的条件下才能发挥正常作⽤，所以加⼊反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离⼼管中依次加⼊DNA（1µg /µl） 20 µg10×酶切buffer 4.0 µl限制性内切酶（10U/µl） 5.0 µl加ddH2O ⾄ 500 µl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5µl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
或者放⼤反应体积，或者补充酶再消化。
如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活⼒下降。
Southern印迹杂交实验原理和方法-2
Southern印迹杂交实验原理和方法-2（一）细管虹吸印迹法此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，转移方式见图10－1：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜或尼龙膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动而滞留在膜上。
步骤：1．20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。
2．凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
3．照凝胶的大小剪一张尼龙膜。
4．膜放在凝胶上。
5．尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
7．以下方法把DNA固定在膜上：（1）紫外交联：1）把膜（DNA面朝上）放在用2×SCC浸湿的whatman 3MM滤纸上2）把湿膜暴露在短波紫外光（254nm）下1～3分钟。
3）在无菌双蒸水中浸润膜。
4）空气中凉干膜。
（2）干燥：1）在2×SCC中短暂洗膜。
2）120℃30分钟干烤固定或80℃2h干烤固定。
8. 如果不立即进行下一步杂交反应，则可把膜保存在两张whatman 3mm滤纸之间，放在密封袋中4℃保存。
图 10-1细管虹吸印记法（二）电转移法此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。
其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶与滤膜一起置于滤纸之间，固定于凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。
在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹。
该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。
southern杂交实验方法和步骤
southern杂交实验方法和步骤一、主要仪器：离心机恒温水浴锅Orbital shaker 恒温摇床Poner PAC300核酸电泳仪VersaDoc凝胶成像系统水平摇床HL-2000 Hybrilinker分子杂交仪烘箱二、主要材料whatman 3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板三、主要试剂RNase A真菌基因组提取试剂盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit IDNA MakerNaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸四、试剂准备变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl；Southern blot中和液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5 mol/L NaCl；20×SSC：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；2×SSC：取100 mL 20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；2×SSC+0.01%SDS：取100 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；0.5×SSC0.01%SDS：取25 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；洗涤缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5，0.3% （v/v）Tween 20；马来酸缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；检测缓冲液：0.1 Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5；封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4µL上清，加入20mL封阻溶液中，备用；底物显色液：取20mL检测缓冲液，避光加入400µL DIG试剂盒内的5号管。
Southern杂交
Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。
（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。
Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。
Southern杂交方法
Southern杂交方法分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8%，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25NHCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4NNaOH中变性20min。
↓在一塑料或玻璃平台上铺2-3层滤纸，将其置于一搪瓷盆或玻璃缸中，盛满0.4NNaOH，滤纸的两端要完全浸泡在溶液中。
（即搭桥：大小要精确，每层都要慢展开，不要有气泡）再在其上铺1-2层滤纸（和凝胶一样大小）。
↓将变性后的凝胶上下颠倒后（注意正反面），置于上述平台中央（注意两者之间不要有气泡）。
↓在凝胶边的四周用Parafilm或废胶片封严，以防止在转移过程中产生短路。
↓将尼龙膜（面积稍大于凝胶）小心覆盖在凝胶上，相应地将膜的一角剪去并标计好正反面。
（注意膜一经与凝胶接触即不可移动）。
↓再将两张滤纸（和凝胶一样大小）覆盖在尼龙膜上，排除气泡。
↓裁剪一些与凝胶一样大小的吸水纸，置于上述滤纸之上。
在吸水纸上置一玻璃板，其上压一重约500g的物品。
↓静置8-24hr使其充分转移，其间注意更换吸水纸。
↓转移结束后，将膜置于2SSC、0.1%SDS中浸泡5min，室温晾干。
五、烤膜(现用紫外交联仪，倒记时，几秒—几分钟即可，粘液，然后在微波炉中烤一会)80℃真空烤膜2hr，固定DNA（碱转移可不需此过程，已与膜共价结合了）。
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Southern 杂交试验方案
一、探针标记
1、探针标记严格按照罗氏试剂盒说明书进行；
2、标记探针检测：
取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。
由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。
所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。
如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA 稀释液按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。
用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。
如初始模板量较大，可取1μl标记产物稀释10~100倍后定量。
二、基因组DNA酶切
1、采用EcoRI和一对甲基化敏感同裂酶HPaIl、MspI消化高粱基因组DNA 5ug，3 Unit/ug DNA，50uL反应体系，在37℃条件下酶切消化10h。
2、酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳（电压小于1v/cm，12h）分离。
凝胶在0.2mol/L的HCl 中脱嘌呤处理，至溴酚蓝变为黄色，弃去HCl后用蒸馏水洗几次，然后以0.4mol/L的NaOH 为转移液，利用毛细管作用将DNA转移到Hybond N+尼龙膜上，转移过夜后将膜取出夹放于滤纸间，80℃烘烤2小时。
常温放于干燥处保存备用。
（转膜：
1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）
2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。
（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）
3、用蒸馏水冲洗2 次。
加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。
4、用蒸馏水冲洗2 次。
加入中和液（1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl，pH7.4）室温振荡2×15min；
5、用蒸馏水冲洗2 次。
加入2×SSC 平衡凝胶和尼龙膜5min；
6、虹吸印记法转膜26 小时
1) 在方盘上放置一平板，其上放置一滤纸，滤纸两端搭入盘内浸入2×SSC中，用玻璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡。
2) 将凝胶倒置于平台上, 正面朝下，切掉右下角，并用保鲜膜封闭四周以防止吸水纸接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。
3) 将尼龙膜放于胶上，赶走气泡。
4) 膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸。
5) 吸水纸上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液体从液池经凝胶向尼龙膜的上行通路，以洗脱凝胶中的DNA 并使其聚集到尼龙膜上。
6) 室温下过夜转膜，持续16小时以上，期间换纸2-3次。
7）完成转膜后，胶染色，观察转膜效果。
并标记好序号、加样孔位置和对应分子量标准的位置，尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。
8）用2×SSC漂洗尼龙膜一次，滤纸吸干，紫外交联仪下照射固定DNA(5000μJ /cm2)5min。
）
杂交：
1、将3 ml预杂交液（6×SSC，0.5%SDS，100ug/ml鱼精DNA，5×Denhardt,50%甲酰胺）加入塑料试管中（按每cm2膜加0.20 ml预杂交液计算），置摇床上42℃预杂交1小时。
2、打开塑料试管，吸弃预杂交液，加入用杂交液（6×SSC，0.5%SDS，100ug/ml鱼精DNA，50%甲酰胺）稀释的20ng/ml寡核苷酸探针（1.5ul 5Um），混匀后置摇床上摇动，42℃杂交1小时。
同时，将洗涤液I(2×SSC-0.1%SDS)、洗涤液II(0.5×SSC—0.1%SDS) 置42℃预温。
3、洗涤：小心倒出杂交液，加5 ml预温的洗涤液I，轻轻振摇1分钟后取出杂交膜，将杂交膜置另一塑料试管中，再加5 ml预温的洗涤液I，在42℃洗膜3次，每次5分钟。
再用洗涤液II 42℃洗膜2次，每次5分钟。
取出杂交膜，置另一塑料试管中（保持膜湿润，勿干燥）。
4、封闭：用封闭液37℃封闭15分钟，弃去封闭液（3％BSA 的PBS）。
5、加5 ml用封闭液1000倍稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，37℃30分钟。
6、洗涤：用洗涤液III洗涤4次，每次2分钟。
7、显色：用(19ml 0.1M柠檬酸钠pH5.0, 1ml 2mg/mlTMB,2ulH2O2)显色液在暗处显色9分钟后，弃去显色液，用水洗3次，每次2分钟，观察结果。
HCl溶液：脱嘌呤0.25 mol/L
NaOH溶液：变性液 1.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH
中和液0.5mol/L Tris-HCl PH=7.5 3mol/L NaCl
6xSSC
20xSSC
预杂交液：6xSSC 0.5% SDS 100ug/ml 鲑鱼精DNA 5x Denhardt 50%甲酰胺
杂交液（用于稀释探针）：6XSSC 0.5%SDS 100ug/ml 鲑鱼精DNA 50%甲酰胺
封闭液：3%BSA 的PBS
100xDenhardt：2%聚蔗糖（Ficoll 400型）2%PVP-40 2%BSA
溶液Ⅰ：2xSSC-0.1%SDS。