Southern 杂交试验方案—本实验室

Southern 杂交试验方案

一、探针标记

1、探针标记严格按照罗氏试剂盒说明书进行；

2、标记探针检测：

取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。

如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA 稀释液按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。如初始模板量较大，可取1μl标记产物稀释10~100倍后定量。

二、基因组DNA酶切

1、采用EcoRI和一对甲基化敏感同裂酶HPaIl、MspI消化高粱基因组DNA 5ug，3 Unit/ug DNA，50uL反应体系，在37℃条件下酶切消化10h。

2、酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳（电压小于1v/cm，12h）分离。凝胶在0.2mol/L的HCl 中脱嘌呤处理，至溴酚蓝变为黄色，弃去HCl后用蒸馏水洗几次，然后以0.4mol/L的NaOH 为转移液，利用毛细管作用将DNA转移到Hybond N+尼龙膜上，转移过夜后将膜取出夹放于滤纸间，80℃烘烤2小时。常温放于干燥处保存备用。

（转膜：

1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）

2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）

3、用蒸馏水冲洗2 次。加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。

4、用蒸馏水冲洗2 次。加入中和液（1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl，pH7.4）室温振荡2×15min；

5、用蒸馏水冲洗2 次。加入2×SSC 平衡凝胶和尼龙膜5min；

6、虹吸印记法转膜26 小时

1) 在方盘上放置一平板，其上放置一滤纸，滤纸两端搭入盘内浸入2×SSC中，用玻璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡。

2) 将凝胶倒置于平台上, 正面朝下，切掉右下角，并用保鲜膜封闭四周以防止吸水纸接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。

3) 将尼龙膜放于胶上，赶走气泡。

4) 膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸。

5) 吸水纸上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液体从液池经凝胶向尼龙膜的上行通路，以洗脱凝胶中的DNA 并使其聚集到尼龙膜上。

6) 室温下过夜转膜，持续16小时以上，期间换纸2-3次。

7）完成转膜后，胶染色，观察转膜效果。并标记好序号、加样孔位置和对应分子量标准的位置，尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。

8）用2×SSC漂洗尼龙膜一次，滤纸吸干，紫外交联仪下照射固定DNA(5000μJ /cm2)5min。）

杂交：

1、将3 ml预杂交液（6×SSC，0.5%SDS，100ug/ml鱼精DNA，5×Denhardt,50%甲酰胺）加入塑料试管中（按每cm2膜加0.20 ml预杂交液计算），置摇床上42℃预杂交1小时。

2、打开塑料试管，吸弃预杂交液，加入用杂交液（6×SSC，0.5%SDS，100ug/ml鱼精DNA，50%甲酰胺）稀释的20ng/ml寡核苷酸探针（1.5ul 5Um），混匀后置摇床上摇动，42℃杂交1小时。同时，将洗涤液I(2×SSC-0.1%SDS)、洗涤液II(0.5×SSC—0.1%SDS) 置42℃预温。

3、洗涤：小心倒出杂交液，加5 ml预温的洗涤液I，轻轻振摇1分钟后取出杂交膜，将杂交膜置另一塑料试管中，再加5 ml预温的洗涤液I，在42℃洗膜3次，每次5分钟。再用洗涤液II 42℃洗膜2次，每次5分钟。取出杂交膜，置另一塑料试管中（保持膜湿润，勿干燥）。

4、封闭：用封闭液37℃封闭15分钟，弃去封闭液（3％BSA 的PBS）。

5、加5 ml用封闭液1000倍稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，37℃30分钟。

6、洗涤：用洗涤液III洗涤4次，每次2分钟。

7、显色：用(19ml 0.1M柠檬酸钠pH5.0, 1ml 2mg/mlTMB,2ulH2O2)显色液在暗处显色9分钟后，弃去显色液，用水洗3次，每次2分钟，观察结果。

HCl溶液：脱嘌呤0.25 mol/L

NaOH溶液：变性液 1.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH

中和液0.5mol/L Tris-HCl PH=7.5 3mol/L NaCl

6xSSC

20xSSC

预杂交液：6xSSC 0.5% SDS 100ug/ml 鲑鱼精DNA 5x Denhardt 50%甲酰胺

杂交液（用于稀释探针）：6XSSC 0.5%SDS 100ug/ml 鲑鱼精DNA 50%甲酰胺

封闭液：3%BSA 的PBS

100xDenhardt：2%聚蔗糖（Ficoll 400型）2%PVP-40 2%BSA

溶液Ⅰ：2xSSC-0.1%SDS