微生物的生理生化反应
生理性生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解细菌生理生化反应原理；2. 掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法；3. 了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。
二、实验原理通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些糖的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物的多样性。
某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚反应阳性。
微生物发酵葡萄糖成丙酮酸，2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性条件下与肌酸类物质反应，生成红色物质，为甲基红反应阳性。
三、实验方法1. 吲哚试验：将细菌接种于含有色氨酸的培养基中，加入吲哚试剂，观察颜色变化。
2. 甲基红试验：将细菌接种于含有葡萄糖的培养基中，加入甲基红试剂，观察颜色变化。
四、实验结果1. 吲哚试验：接种了大肠杆菌的试管在加入乙醚和吲哚试剂后，能在乙醚和液体培养基的交界面上产生红色环状物质，大肠杆菌的吲哚试验显阳性。
2. 甲基红试验：大肠杆菌甲基红试验阳性，即大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH。
五、实验分析1. 吲哚试验失败原因分析：可能是因为乙醚加量太少，影响实验现象的观察；另一个可能的原因是大肠杆菌菌种有问题。
2. 甲基红试验结果分析：大肠杆菌在培养后仍能维持酸性，而产气杆菌则转化为非酸性末端产物。
六、实验结论1. 通过本实验，我们了解了细菌生理生化反应原理；2. 掌握了细菌鉴定中常见的生理生化反应方法；3. 认识到生理生化反应在鉴别细菌中的意义。
七、实验注意事项1. 实验过程中要严格按照操作规程进行，避免污染；2. 注意观察实验现象，记录实验数据；3. 分析实验结果，找出实验失败的原因。
第2篇一、实验目的1. 了解生理性生化实验的基本原理和方法。
2. 掌握常用的生理性生化指标及其检测方法。
3. 通过实验，学会使用生理性生化检测仪器，提高实验技能。
二、实验原理生理性生化实验是研究生物体内各种生化反应及其代谢过程的重要手段。
微生物生理生化反应
微生物生理生化反应实验原理通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。
某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红色的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。
V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。
微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。
有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红色。
某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。
实验材料和方法：材料：培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基；菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）；试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素；仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。
实验方法：1.V-P反应取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。
置于37℃恒温箱中培养48小时。
取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。
微生物的生理生化反应
实验六微生物的生理生化反应一、实验目的掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。
二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体个原理如下：1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。
3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。
①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。
由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。
④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。
生化反应鉴定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解生化反应在微生物鉴定中的重要性。
2. 掌握常见生化反应的原理和方法。
3. 通过实验，对给定的微生物进行鉴定。
二、实验原理生化反应是指微生物在生长过程中，通过酶的催化作用，将营养物质转化为自身所需的物质，同时产生一些代谢产物。
这些代谢产物可以用来鉴定微生物的种类。
常见的生化反应包括糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验等。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌等。
- 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂等。
- 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等。
- 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管等。
2. 仪器：- 酒精灯- 接种环- 超净工作台- 恒温培养箱- 高压灭菌锅- 试管- 移液枪- 滴管四、实验方法1. 菌种培养：将菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
2. 糖发酵试验：- 将培养好的菌种接种于糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖），置于恒温培养箱中培养24小时。
- 观察培养基颜色变化，记录发酵结果。
3. 吲哚试验：- 将培养好的菌种接种于蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
- 加入吲哚试剂，观察颜色变化，记录结果。
4. 甲基红试验：- 将培养好的菌种接种于蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
- 加入甲基红试剂，观察颜色变化，记录结果。
五、实验结果与分析1. 糖发酵试验：- 大肠杆菌：发酵葡萄糖、乳糖，不发酵蔗糖。
- 金黄色葡萄球菌：不发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
- 枯草芽孢杆菌：不发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
- 变形杆菌：发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
2. 吲哚试验：- 大肠杆菌：吲哚试验阳性。
- 金黄色葡萄球菌：吲哚试验阴性。
- 枯草芽孢杆菌：吲哚试验阴性。
- 变形杆菌：吲哚试验阳性。
实验六微生物的生理生化反应.
实验六微生物的生理生化反应一、实验目的掌握i 微生物（细菌）鉴定中主要生化反应的常规实验法二、实验原理（一）大分子物质（如淀粉、明胶）在常规条件下不被降解成小分子物质，但某些微生物细胞能分泌胞外酶，使大分子物质降解。
大分子物质在微生物分泌的胞外酶的作用下分解成小分子物质。
1. 淀粉水解实验根据淀粉遇碘变蓝的原理，向含有淀粉培养基中加入碘产生淀粉酶无色透明圈微生物细胞无淀粉酶蓝色2. 明胶水解实验产生明胶酶的，明胶培养基在4 度时成液体状微生物细胞无明胶酶时，在明胶培养基在4 度成固体状（二）糖发酵实验不同的细菌分解糖，醇的能力不同，有些细菌分解某些糖产酸并产气，有的分解糖仅产酸而不产气，因此，可根据其分解利用糖的差异作为鉴定菌种的依据之一。
在糖发酵实验中，用溴甲酚紫作为指示剂，PH6.8时为紫色，当PH< 5.2时变为黄色，若细菌分解糖产酸，则培养液由紫色变为黄色，有无气体产生，可以从德汗氏小管中观察。
（三）IMVC 实验IMVC 实验主要包括吲哚（indol test）试验、甲基红（methyl red test）试验、柠檬酸盐（citrate test）试验、伏-普（Voges-Prokauer test）试验，这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细菌学检查甲基红试验（M.R.试验）某些细菌在糖代谢过程中，分解培养基中的糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸，乙酸等，使培养基的PH 值降至4.5 以下。
酸的产生可由甲基红的变色来指示。
甲基红的变色范围是PH4.2-6.3，PH4.2 时为红色，PH6.3 时为黄色。
若细菌分解葡萄糖产酸量少时，则培养基PH 值在6.3以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。
伏普试验有些细菌可以分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸通过缩合和脱羧产生乙酰甲基甲醇。
在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，二乙酰可以与培养基中的蛋白胨中的精氨酸的胍基产生红色化合物。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告细菌鉴定是微生物学中的一个重要分支，它是通过对细菌的形态、生理生化反应、生长特性等方面进行分析，来确定细菌种类的过程。
在细菌鉴定中，生理生化反应实验是一种常用的方法，它可以通过观察细菌在不同条件下的生长情况，来确定细菌的种类。
本文将介绍几种常用的生理生化反应实验。
1. 氧气需求实验氧气需求实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的氧气需求量。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同氧气浓度的培养基中，然后观察细菌的生长情况。
如果细菌只能在氧气充足的条件下生长，那么它就是一种需氧菌；如果细菌只能在氧气缺乏的条件下生长，那么它就是一种厌氧菌；如果细菌既能在氧气充足的条件下生长，也能在氧气缺乏的条件下生长，那么它就是一种兼性厌氧菌。
2. 糖类发酵实验糖类发酵实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌对不同糖类的发酵能力。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同糖类的培养基中，然后观察培养基的酸碱度变化。
如果培养基的酸碱度发生了变化，那么说明细菌对这种糖类进行了发酵。
通过这个实验，我们可以确定细菌对哪些糖类具有发酵能力，从而进一步确定细菌的种类。
3. 氧化还原实验氧化还原实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的氧化还原能力。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同氧化还原剂的培养基中，然后观察培养基的颜色变化。
如果培养基的颜色发生了变化，那么说明细菌对这种氧化还原剂具有反应能力。
通过这个实验，我们可以确定细菌的氧化还原能力，从而进一步确定细菌的种类。
4. 酶活性实验酶活性实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的酶活性。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同底物的培养基中，然后观察底物的变化情况。
如果底物发生了变化，那么说明细菌对这种底物具有酶活性。
通过这个实验，我们可以确定细菌的酶活性，从而进一步确定细菌的种类。
关于微生物的生理生化反应
【试验器材】
白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰
1．菌种
吲哚〔红色〕。但并非全部的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，
枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，一般变
因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
形杆菌，产气肠杆菌。
色氨酸水解反应：
2．培育基
1
在接种后，轻缓摇动试管，使其匀称，防止倒置的小管进入气泡。
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〔3〕将接过种和作为对比的 6 支试管均置 37℃中培育 24~48h。
变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。
〔4〕观看各试管颜色改变及德汉氏小管中有无气泡。
【试验结果】
卢戈氏碘液，甲基红指示பைடு நூலகம்等。
基红指示剂由橙黄色〔pH6.3〕转变为红色〔pH4.2〕，即甲基红反应。尽
4．仪器和其他用品
管全部的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠
无菌平板，无菌试管，接种环，试管架等。
杆菌和产气肠杆菌上仍旧是有价值的。这两个细菌在培育的早期均产生有
【操作步骤】
机酸，但大肠杆菌在培育后期仍能维持酸性 pH4，而产气肠杆菌则转化有
1．淀粉水解试验
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〔1〕将固体淀粉培育基溶化后冷却至 50℃左右，无菌操作制成平板。
〔2〕用记号笔在平板底部划成 4 部分，分别在 4 部分表上菌名。
〔2〕用记号笔在平板底部划成 4 个部分。
〔3〕用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜
微生物生理生化反应实验报告
微生物的生理生化反应一、实验目的1.掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的测定方法。
2.了解细菌代谢类型的多样性。
3.了解细菌生长现象及代谢产物在鉴别中的意义。
4.学习接种技术。
二、实验原理在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。
1.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。
产酸后再加入溴甲酚紫指示剂后会使溶液呈黄色，且杜氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且杜氏小管中无气体。
2.甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。
大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
3.伏-普试验（VP）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成非酸性或中性末端产物，某些细菌产生丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被氧化成二乙酰，二乙酰与胍基作用，生成红色化合物，为阳性。
4.靛基质（吲哚）试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。
大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
5.硫化氢实验：某些细菌分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫酸铵亚铁等铁盐可与硫化氢反应生成不溶性硫化亚铁之黑色沉淀，为硫化氢实验阳性。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
实验九微生物的生理生化反应
思考题
1. 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发 酵试验应该出现什么结果？（P120，2 ） 2. 解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理， 为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色 氨的酶活性的指示剂，而不用丙酮酸? P123，2（2）
糖 发 酵 试 验
• • • • •
IMViC反应： 吲哚实验： 甲基红实验 V.P.实验 柠檬酸盐实验
• H2S实验
吲哚试验: 检查吲哚的产生 有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中
的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲 基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
甲基红试验：检查微生物利用葡萄糖产酸的情况 细菌代谢糖产生的有机酸会使培养基变酸，可通过 加入的甲基红指示剂（PH6.3 橘黄色-PH4.2 红色）。 尽管所用的肠道菌都能发酵葡萄糖产生有机酸，大肠杆 菌和产气杆菌在培养早期均产生有机酸，但大肠杆菌在 培养后期仍能维持酸性PH4.0， 而产气杆菌则转化有机 酸为非酸性末端产物，如乙醇，丙酮酸等。
结果观察
实验名称 糖发 葡萄糖发 酵实 酵 验 乳糖发酵 吲哚实验 IMVi 甲基红实 C反 验 应 V.P实验 柠檬酸盐 实验 H2S实验 培养基 葡萄糖发酵培 养基 乳糖发酵培养 基 蛋白胨水培养 基 葡萄糖蛋白胨 水培养基 葡萄糖蛋白胨 水培养基 柠檬酸盐培养 基 H2S培养基 菌种 大肠、产气 大肠、产气 大肠、产气 大肠、产气 大肠、产气 大肠、产气 大肠、变形 产生红色玫瑰吲哚 丙酮酸分解为小分子酸， 使得培养基颜色变红 丙酮酸不分解，氧化后与 α-萘酚形成红色 可以利用柠檬酸盐，pH升 高，颜色变蓝 产生PbS黑色沉淀 现象 颜色变化、有气泡积聚
• 硫化氢试验：检测硫化氢 的产生
有些细菌能分解含硫的有 机物，如胱氨酸、半胱氨酸 和甲硫氨酸等产生硫化氢，
实验6-微生物的生理生化反应
实验六微生物的生理生化反应1、实验目的探究菌株在碳源同化、氮源利用、乙醇发酵和抗生素效价分析等方面不同的生长特性，观察并简要分析不同微生物的生理生化特征及其形成机理。
2、实验过程简述2.1 培养基与试剂准备2.1.1碳源同化培养基准备碳源为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、松三糖、可溶性淀粉、α-甲基葡萄糖苷的YNB 培养基，放入一根杜氏管。
2.1.2氮源同化培养基准备氮源为硫酸铵，尿素，蛋白胨，硝酸钾，无氮源YNB 的固体、液体培养基。
2.1.3 乙醇发酵用种子培养基：YPD 培养基2.1.4乙醇发酵用发酵培养基葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，尿素，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙。
2.1.5抗生素效价测定用培养基：LB 培养基2.1.6青霉素：用pH 6.0 磷酸缓冲液配制，浓度为100 mg/ml，0.22μm 孔径过滤灭菌。
2.2 微生物的碳源同化和发酵1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。
2、取200 μl 菌悬液，分别转接于含杜氏管的小试管中，静置培养48 h。
3、每24 h 观察记录生长和产气情况。
4、根据实验结果判断不同菌株对不同碳源的同化或发酵。
2.3 微生物的氮源利用1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。
2、取200μl 菌悬液，分别转接于上述培养基小试管中，30℃或37℃静置培养48 h。
3、各取20μl 菌悬液，分别划线于不同氮源的固体平板上，待菌液被吸收后，培养皿倒置，静置培养48 h。
4、每24 h 观察记录生长情况，48 h 测定液体培养物的OD 600。
5、根据实验结果判断不同菌株对不同氮源的利用能力或偏好性。
2.4 酵母菌的乙醇发酵1、种子液培养：将酿酒酵母从菌种斜面上接一接种环至YPD 种子培养基中，30℃，200rpm，培养18 h。
2、乙醇发酵：按照10%（v/v）的比例将培养好的种子液接入100 ml 发酵培养基中，用无菌塑料布将封口密封，30℃，静置培养，每24 h 手摇1 次，发酵3-4 d。
实验九微生物的生理生化反应教案资料
四、实验内容
1.将大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌在对应培养基内接种
试验 菌名
大肠杆菌
IMViC 吲哚试 验
√
甲基 红
(M.R) 试验
√
伏普 （ VP ）试 验
√
柠檬酸 盐试验
√
产气杆菌 √
√
√
√糖发酵 Biblioteka 验√√√√
H2S 试验
√
变形杆菌
培养基 接种方式
蛋白胨 水 培养基
液体
葡萄糖蛋白胨水 培养基
液体 液体
• 糖发酵实验
细菌在分解糖或醇(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘 露醇、甘油)的能力有很大的差异。有些细菌发 酵某种糖后产生各种有机酸(如乳酸、醋酸、甲 酸、琥珀酸)及各种气体(如氢、甲烷、二氧化 碳)。有的细菌只产酸不产气。酸的产生可利用 指示剂来指示。在配制培养基时可预先加入溴甲 酚紫(pH 5(黄)－pH7(紫))。当细菌发酵糖产酸 时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可 由糖发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。
MOTILITY TEST 1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile
三、实验器材
• 1. 菌种：大肠杆菌、产气杆菌、 变形杆菌
• 2. 培养基：见表格
氏小管中有气泡。 ⑥H2S试验：直接观察，阳性有黑色沉淀。
结果观察
实验名称
培养基
菌种
现象
糖发 葡萄糖发 酵实 酵
验 乳糖发酵
吲哚实验
IMVi 甲基红实 C反 验 应 V.P实验
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微生物的生理生化反应
姓名：王雪学号：201500140130 班级：2015级四班2组同组者：张彬、田文娅
一、实验目的
1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不通过的酶系统。
2、掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3、了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
4、了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二、实验原理
微生物的生理生化反应原理：在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。
代谢过程主要是酶促反应过程。
许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。
大分子水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。
脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。
糖发酵试验：是常用的鉴别微生物的生化反应。
某些细菌能利用糖类作为碳源和能源，使糖类分解为产酸产气或产酸不产气。
不同种的细菌对于各种糖类利用能力不同，分解产物也不同。
大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。
当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。
气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
吲哚实验：用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。
吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
但并非所有的微生
物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
甲基红实验：用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。
大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。
因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
三、实验器材
1、菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌（大分子水解试验）
大肠杆菌、普通变形杆菌（糖发酵试验）大肠杆菌、产气肠杆菌（吲哚试验）
大肠杆菌、产气肠杆菌（甲基红试验）
2、培养基：
（1）固体淀粉培养基，固体油脂培养基（大分子水解试验）
（2）葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）
（3）蛋白胨水培养基（吲哚试验）
（4）葡萄糖蛋白胨水培养基
3、溶液和试剂：卢戈氏碘液，乙醚，吲哚试剂，甲基红试剂，蒸馏水，中性红试剂等
4、仪器或其他用具：培养皿，试管，酒精灯，烧杯，德汉氏小管，接种环等
四、实验步骤
A．大分子水解试验
1．淀粉水解试验
（1）配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
（2）用记号笔在平板底部划成四部分
（3）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、和铜绿假单胞菌分别在不同的部分点种，在平板的反面对应部分分别写上菌名
（4）将平板倒置，在37℃温箱中培养24小时
（5）观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板
如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。
透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。
2.油脂水解实验
（1）配制固体油脂培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
（2）用记号笔在在平板底部划成四部分，分别在四部分表上菌名
（3）用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和产气肠杆菌分别划十字线接种于平板相对应部分的中心
（4）将平板倒置，在37℃温箱中培养24小时（5）取出平板，观察菌苔颜色
如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应
B．糖发酵实验
3、葡萄糖发酵
（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名
（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。
另取乳糖发酵培养基3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。
（3）将接过种和作为对照的6支试管均置37℃中培养24~48小时
（4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡
4.乳糖发酵实验
（1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置乳糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏小
管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空气，每组五只试管，灭菌。
（2）接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取乳糖发酵培养基试管2支接入大肠杆菌，再
取两只接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡第五支不接种，作为对照。
在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。
（4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。
C．吲哚实验
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入3支蛋白胨水培养基，置37℃培养48h
（2）在培养48h后的蛋白胨水培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管避徐徐加入2滴吲哚试剂。
在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。
D．甲基红试验
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入3支葡萄糖蛋白胨水培养基，置37℃培养48h （2）培养48h后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。
五、实验结果
1．淀粉水解实验.
（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
2.油脂水解实验
因为培养基的制作未按照课本上的要求，所以培养基可能制作失败，导致四种菌全部没有结果。
1.糖发酵实验葡萄糖培养基（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
乳糖培养基（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
2.吲哚实验（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
3.甲基红实验（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
结果分析：理论上产气肠杆菌在培养早期产生有机酸，但一段时间后，产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，从而出现阴性。
但实验结果显示为阳性，分析可能是培养时间不够长，或者接种时出现失误，把菌株弄错了。
另外可能是甲基红滴加太多，出现假阳性。
六、思考题
1、你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
淀粉是大分子,不能通过细胞膜进入细胞,所以细胞中产生的淀粉酶,只能分泌到细胞外去发挥作用,而且菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解所以淀粉酶肯定就是胞外酶2、不利用碘液怎么证明淀粉酶存在？
如果不用碘液鉴定淀粉的存在,可以使用斐林试剂来鉴定是否生成了还原性糖,麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖,淀粉则是非还原性糖
3.假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵实验会出现什么结果？
耗氧气、产生二氧化碳及其他废气、产生水分
由于产生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。
德汉氏小管中有气柱。
4.解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么这个实验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性指示剂，而不用丙酮酸？
色氨酸是植物体内生长素生物合成重要的前体物质,其结构与IAA（吲哚乙酸,即生长素）相似,在高等植物中普遍存在.某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。
对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。