植物组织培养脱毒技术共16页
植物组织培养脱毒技术综述
植物组织培养脱毒技术综述作者：李美娜来源：《农家科技下旬刊》2015年第06期摘要：植物病毒分布广、危害大，对农业和花卉产业的发展产生了巨大的冲击。
国内外的系统研究和生产实践证明，培育和栽培无病毒种苗是防治作物病毒病的根本措施。
本文通过查阅国内外研究文献和资料，综合阐述了热处理脱毒法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法等方法以及几种常用的病毒检测方法。
关键词：植物组织培养；脱毒技术；检测技术植物病毒分布广、危害大，对农业和花卉产业的发展产生了巨大的冲击。
近年来，随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术，病毒病开始流行，严重影响了中国花卉产业的发展。
目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。
世界上不少国家十分重视这项工作，把脱除病毒纳入常规良种繁殖的一个重要程序，建立了大规模的无病毒苗生产基地，为生产提供无病毒良种种苗，已经在生产上发挥了重要作用，取得了显著的经济效益。
无病毒良种种苗的优点有：（1）产量提高。
通过脱毒可大大提高作物的产量，如草莓脱毒可提高产量20%—30%、马铃薯脱毒可提高产量40%以上、地瓜脱毒可提高产量30%—50%、苹果脱毒可提高产量15%—45%。
（2）品质提高。
脱毒后的植物所结果实品质提高，如地瓜脱毒可提高出干率0.1%—1.5%；苹果着色好，糖度高；观赏植物生长健壮、花大、花艳，优质花增加，商品价值提高。
（3）抗病性增强。
脱毒后，植物本身抗性提高。
对病虫的抗性增强，如地瓜脱毒后可增强抗茎线虫病；另外，脱毒时，还会同时脱除有些细菌、真菌、线虫等。
一、脱毒技术当前脱除植物病毒的方法有热处理脱毒法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法3类。
其中组织培养脱毒法又包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒法、珠心组织培养脱毒法3种方法。
1.茎尖培养脱毒。
（1）茎尖培养脱毒原理。
在染病毒植株体内，病毒分布并不均匀，在生长点病毒含量最低。
植物组织培养项目六 植物脱毒技术
2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制
了病毒的复制；
3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生 组织中比其他任何区域具有更高的活性。 4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的 增殖 。
二、植物脱毒的方法
1. 茎尖培养脱毒
通过茎尖培养脱毒的原理 1）病毒在植物体内的分布：茎尖、根尖顶端分生组织病毒 浓度低，甚至不带病毒。（茎尖、根尖无维管束系统，病毒 无法运动）
获得的再生植株无病毒。
珠心胚培养对柑橘鳞皮病、速衰病、裂皮病、
脉突病等十分有效。
柑橘珠心胚培养：取花后约7 周的幼果胚囊， 接种在25±2 ℃黑暗条件下培养 1个月，再转光 培养（1000 lx，12 h/d）。
3-4 周发生球形胚和愈伤组织，9-10 周分化子
叶，苗高 3 cm左右移植到营养钵蛭石基质中培
全世界植物病毒近788种，病毒对寄主植物造成
毁灭性危害，导致大幅度减产。
2. 植物病毒病的症状
1）变色
2）坏死 3）畸形 4）萎蔫
3. 植物病毒的侵染特性
1）有性生殖退化、仅用无性繁殖方法繁殖的植物，
极易受病毒病的侵染。
2）大多植物病毒不经种子传播（专化性强的病毒除 外）。 3）病毒在生长旺盛的部位繁殖速度较慢。
4）生根诱导：
将 2-3 cm 的无根苗转入生根培养基（ 1/2MS+IBA 0.10.2 mg/L）继续培养1-2 个月就可形成根。 极难生根的（桃、苹果等）通过微体嫁接法获得完整 植株。 二次茎尖培养，脱毒率达100%
培养基与培养方式
1）MS培养基适于多种植物茎尖培养，White、Morel培
葵、紫罗兰等；块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物
植物组织培养课件第6章B-植物脱毒
茎尖不带病毒原因：
I 病毒通过维管系统移动，分生组织中不存在维管系统
II 竞争机制：茎尖分生组织中，代谢活性高，竞争中病毒 复制处于劣势
III 病毒钝化系统在茎尖分生组织内活性最高
IV 分生组织内高水平的内源激素抑制病毒的增殖
大 茎尖
脱毒效果差， 脱毒效果差，成苗易 脱毒效果好， 脱毒效果好，成苗难
指 示 植 物 穗 接
嫁接后 的植物
②抗血清(antisemm)鉴定法 抗血清 鉴定法 利用了“ 血清反应” 利用了 “ 血清反应 ” ， 用已知抗血清可以 鉴定未知病毒“抗原” 鉴定未知病毒“抗原” 特点： 特异性高； 测定速度快， 特点 ： 特异性高 ； 测定速度快 ， 一般几小 时甚至几分钟就可以完成； 时甚至几分钟就可以完成； 植物病毒鉴定中最有用的方法之一
II 植株热处理脱毒法 试验母株在高温生长室中生长一段时 间，其顶端分生组织比次生分生组织生长 迅速， 迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培 养。 生长室温度35—40℃ 生长室温度 ℃ 光照3000—10000 lx 光照
评价： 评价：利用了病毒的热敏性 i、并非所有病毒都有热敏性； 、并非所有病毒都有热敏性； ii、热处理影响母体植株存活率； 、热处理影响母体植株存活率；
小（0.1－1.0mm） － ）
在满足培养材料 成苗的前提下， 成苗的前提下， 茎尖越小越好
茎尖
小茎尖
顶端分生组织 小茎尖：顶端分生组织+叶原基（1-2个），大小为0.1mm-1mm
香石竹（康乃馨）脱毒的具体操作过和如下： 香石竹（康乃馨）脱毒的具体操作过和如下： （1）热处理 将盆栽植株或离体瓶苗，在 36～38℃下处理2周，或每天在36℃16小时和 38℃8小时处理共30天，光照为3000lx。 （2）表面消毒 选取盆栽香石竹植株叶腋间生 出的侧芽为外植体，先用自来水冲洗半小时， 用75%的酒精消毒30秒，再用2.5%次氯酸钙 或次氯酸钠溶液处理15分钟,取出后用无菌蒸 馏水清洗4次,用无菌滤纸吸去多余水分备用。
植物组织培养技术第七章植物脱毒快繁技术
1、茎尖培养脱毒原理
病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株 部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染 的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm） 几乎不含或含病毒很少。
分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管 系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连 丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖 细胞不断分裂和活跃的生长速度。
二、脱毒方法
(一) 热处理脱毒
（一）发现： 1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证
明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可 去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病 毒病。
热处理又称温治疗法。
• 1、热处理脱毒原理：
①病毒是DNA大分子，病毒进入植 物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。 热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒 的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或 增殖停止，而失去病毒的侵染能力。
把抗原-抗体的免疫反应于酶的催化反应相结合而发展 起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，发展最快 应用最广的方法。
原理：采用酶标记的特异抗体指示抗原-抗体的结合， 从而检测样品中的抗原定量测定法。
操作程序：将待检植物汁液注入酶联板（聚苯乙烯多 孔微量反应板）中，使抗原吸附在它的孔壁，加入酶(
过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的特异抗体，抗原 -抗体充分反应后，清洗，固相载体酶联板表面只留 下以酶标记的抗原-抗体复合物。加入酶嘚无色底物
葡萄扇叶病毒
苹果花叶病毒
（二）茎尖培养脱毒
1、茎尖培养脱毒原理 2、培养基 3、茎尖培养方法 4、影响微茎尖培养的因素
①外植体大小 ②培养条件 ③外植体的生理状态
植物组织培养技术课件
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大学课程植物组织培养13植物脱毒--组培课件
二 茎尖脱毒技术的原理和方法
1 基本原理（采用茎尖的原理）
利用病毒在植物体内的分布不均匀性，一般情况下，病毒 在植物的顶端分生组织中不存在或只有较低的浓度（胚中也是 这种情况，为什么？）
2病毒分配不均匀性的可能原因：
A 物理隔离：分生组织微管系统或胞间连丝不发达，细胞分 裂速度快于病毒侵染速度
B能量竞争 ：病毒核酸和植物细胞分裂时都须要消耗大量的 能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是 自我提供能量自我复制，这样病毒核酸复制就得不 到足够的能量。
D 植物病毒结构 植物病毒结构简单，杆状、线条状的病毒，粒体中间 是螺旋状的核酸链，外面是蛋白质亚基组成的衣壳。
E 植物病毒的发展简史 1．症状描述期
2．病原研究期 代表人物：Adolf mayer（1882）， Dmitrii Ivanowski（1892），Martinus Beijernek （1898）。
3 植物脱毒技术概念：
A 广义：消除包括病毒、真菌、细菌在内的微生物病原体 B 狭义：单指消除植物细胞、组织内的病毒、类病毒
（本节重点为狭义脱毒所涉及内容）
4 植物脱毒技术的一般方法： A 从材料角度分：
茎尖培养脱毒（或顶端分生组织）、珠心胚培养脱毒、 微尖嫁接脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织培养脱毒
C 存在病毒钝化系统：植物不同部位细胞的防卫系统能力的 差别。
D 抑制因子存在
2 基本步骤 （1）母体的选择 （2）母体（预）处理 （3）茎尖的分离 （4）茎尖的培养和小批量快繁 （5）效果检验 （6）大批量快繁及无毒原种保存。
2 基本步骤 （1）母体的选择
欲脱毒材料的品种典型性
植体健康程度选择
织细胞。
A
B
植物组织培养项目六 植物脱毒技术
5）电镜检测法
用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否 有病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、形状（ 杆状、线状、球状）和结构。
二、脱毒苗的保存
1. 隔离保存：避免脱毒苗再次感染病毒，脱毒
苗需隔离与保存，最好将无病毒母本园建立
在相对隔离的山上（300 目的防虫网室），
管理得当可保存5 ~ 10 年。
2. 长期保存
将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种在 培养基上，低温离体保存。
1）低温保存： 1-9 ℃ 的低温、并低光照保存，只需半 年或1年更换1次培养基（最小生长法）
2）冷冻保存（超低温保存）：液氮（-196 ℃）
①材料选择
植方式移入蛭石、河沙、椰壳等基质中培养。
3. 理化方法脱毒
1）物理方法
① 高温处理（热处理 / 温热疗法）：病毒对热
不稳定，高于常温的温度（ 35-40 ℃ ）下钝
化失活。
温汤处理：50 ℃左右热水中浸泡数分钟至几 小时（适用于离体材料和休眠器官的处理）
热风处理：盆栽植物移入室内或生长箱中， 35-40 ℃
2）茎尖大小与脱毒效果：顶端分生组织即生长点（最大直
径0.1 mm）；也可是带1-3个幼叶原基的茎尖（0.3-0.5 mm） 最适合作外植体，脱毒效果好。
方法
1）取样与消毒：取植株顶芽或侧芽梢段 消毒方法：剪取顶芽梢段（侧芽） 3-5 cm 。剥去大
叶，自来水冲洗干净，用 75%酒精浸泡 30 s左右，再
处理几十分钟至数月。 处理温度和处理时间因植物种类、器官类别、生理状 况、待脱除病毒的种类等而异。 变温处理可消除病毒但不伤及植物。
植物组织培养脱毒
第九章植物组织培养脱毒一、植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义1、植物病毒的危害病毒给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。
葡萄扇叶病毒使葡萄减产10%-18%。
花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。
而且病毒危害与细菌、真菌不同，不能通过化学药剂进行防治。
2、病毒的特性及其浸染病毒是指在活体细胞内寄生增殖的不具细胞结构的生命体。
病毒在植物体内的主要传播途径有：☐介体传播。
如蚜虫、叶蝉、螨类等。
☐机械传播（汁液摩擦传播）。
☐无性繁殖材料和嫁接传播。
☐种子和花粉传播。
3、无病毒苗培育的意义无病毒良种种苗的优点产量提高品质提高抗病性增强如草莓可增产20%—50%，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。
菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵较大等特点。
“无病毒”概念通常所说的无病毒应为“特定无病毒或特定无病原菌”.无病毒苗是一个相对概念,并不是绝对不带有任何病毒,只是不带有对当地生产危害最大的几种病毒而已.二、脱除植物病毒的原理及方法•热处理脱毒法•微体嫁接离体培养脱毒法•微茎尖培养脱毒法•珠心组织培养脱毒法组织培养脱毒法•愈伤组织培养脱毒法1、热处理脱毒植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在着相互竞争。
在快速分裂的细胞中是正常核蛋白合成占优势，而在细胞伸长期间是病毒核蛋白的合成占优势，因此加速分生组织细胞的分裂，是能获得无病毒植株的。
热处理可以钝化病毒的活性，使其增殖减缓或停止，失去传染能力。
但并不能杀死病毒。
热处理方法愈伤组织热处理 热空气处理热处理脱毒的局限性并非所有病毒都对热处理敏感延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能钝化植物中的抗性因子而降低处理效果。
热处理后只有一小部分植株能够存活。
2 微体嫁接离体培养脱毒法也称“试管嫁接”，是把极小（小于0.2mm）的茎尖作为接穗接到实生砧木上（无菌种子培养获无菌苗，种子实生苗不带毒），然后将嫁接后的砧木接种到新的培养基上培养。
7.植物组织的脱毒培养(植物组织培养)
第七章植物组织的脱毒培养一、植物病毒的危害病毒:一类结构简单生物，由核酸和蛋白质分子组成。
病毒结构简单，没有完整的酶系统来独立地进行物质代谢和能量代谢，只能依靠寄主生物的酶系统实现生理代谢过程，因此，具有寄生性。
病毒侵入寄主后，在寄主细胞中进行自我复制而迅速增殖，并扩展到植物全株发病。
病毒病不同于真菌和细菌病害，不能用杀菌剂和抗菌素进行防治，与细胞共生，一旦染病，只能采用拨除病株的措施。
病毒危害：1）导致植物产量和品质的大幅度降低。
2）通过无性繁殖或者种子传给下一代。
通过植物组织培养方法，可脱除植物病毒，恢复种性，使品种复壮，提高产量品质。
二、植物组织中病毒的分布病毒在植物组织中分布不均匀：在顶端分生组织中含毒少，在老组织中病毒增加。
（茎尖培养脱毒的理论依据）植物茎尖分生组织无病毒原理（原因）：(1) 能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA 合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。
(2) 传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在茎尖分生组织中，维管组织还不健全或不存在，从而抑制了病毒向分生组织的传导。
(3) 激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。
(4) 酶缺乏：1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。
(5)抑制因子：1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子，如“酶钝化系统” 。
三、脱除植物病毒的方法(一)茎尖培养脱毒1、根据培养目的和取材大小可将茎尖培养分为:1）普通茎尖（Shoot tip）培养较大茎尖（几毫米至几十毫米的茎尖）培养技术。
技术简单，操作方便，茎尖易成活，成苗所需时间短，能加速繁殖速度。
植物组织培养脱毒技术进展研究19页PPT
1 有 佳 色，裛 露掇其 英。 3、 日 月 掷 人 去，有 志不获 骋。 4、 未 言 心 相 醉，不 再接杯 酒。 5、 黄 发 垂 髫 ，并怡 然自乐 。
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非